TUGAS MATA KULIAH FITOKIMIA

METODE KROMATOGRAFI

Disusun Oleh:

Rina Nur Azizah 260110100104

Prinka Ariessa 260110100129

Septian Anggadibya 260110100158

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS PADJADJARAN

JATINANGOR

2011

KATA PENGANTAR

Dengan mengucapkan syukur ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa, akhirnya

makalah Metode Kromatografi ini selesai kami susun. Makalah ini disusun dengan

tujuan untuk memenuhi tugas mata kuliah Fitokimia dan juga untuk membantu

mahasiswa-mahasiswa lain dalam mempelajari serta memberi gambaran mengenai

metode-metode kromatografi.

Dalam penyusunan makalah ini tidak lupa kami mengucapkan terima kasih

yang sebesar-besarnya kepada semua pihak atas saran, komentar, dan dorongan

sehingga makalah ini dapat selesai disusun.

Tiada gading yang tak retak, begitu juga dengan makalah ini. Akhirnya, kami

mengharapkan saran, kritik, dan masukan yang membangun demi perbaikan makalah

ini di masa yang akan datang. Kami berharap semoga makalah ini dapat bermanfaat

bagi kita semuanya. Amin.

Jatinangor, April 2012

Penyusun

1

DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR……………………………………………………………………….1

BAB I : PENDAHULUAN……………………………………………………..…..3

BAB II : ISI………………………………………………………………………...7

Kromatografi Cair-Padat……………………………………………………7

Kromatografi Gas-Padat……………………………………………………7

Kromatografi Cair-Cair…………………………………………………….8

Kromatografi Gas-Cair……………………………………………………..8

Kromatografi Gas…………………………………………………………..16

Kromatografi Cair………………………………………………………….17

Kromatografi Partisi……………………………………………………….19

Kromatografi Penukar Ion………………………………………………..20

Kromatografi Eksklusi Molekular………………………………………..25

Kromatografi Permeasi Gel………………………………………………29

Kromatografi Adsorpsi……………………………………………………32

Kromatografi Lapis Tipis………………………………………………….32

Kromatografi Lapis Tipis Preparatif………………………………………40

Kromatografi Kertas………………………………………………………41

Kromatografi Kolom………………………………………………………42

Kromatografi Cair-Vakum………………………………………………..43

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC)………………………………..44

BAB III : PENUTUP……………………………………………………………….47

DAFTAR PUSTAKA……………………………………………………………………….48

BAB I

2

PENDAHULUAN

Suatu analisis kimia menjadi meragukan jika pengukuran sifat tidak

berhubungan dengan sifat spesifik senyawa terukur. Analisis meliputi pengambilan

cuplikan, pemisahan senyawa pengganggu, isolasi senyawa yang dimaksudkan,

pemekatan terlebih dahulu sebelum identifikasi dan pengukuran. Terdapat banyak

teknik pemisahan tetapi kromatografi merupakan teknik yang paling banyak

digunakan.

Kromatografi pertama kali diberikan oleh Michael Tswett, seorangahli botani

Rusia, pada tahun 1906.Kromatografi berasal dari bahasa Yunani ‘Kromatos’ yang

berarti warnadan ‘Graphos’ yang berarti menulis.

Kromatografi adalah metode pemisahan komponen kimia yang didasarkan

pada perbedaan antara fase bergerak dan fase diam dari komponen-komponen yang

terdapat dalam suatu sampel uji. Komponen yang dipisahkan tersebut dapat

dikuantifikasi dengan menggunakan detektor dan/atau dikoleksi untuk analisa lebih

lanjut. Instrumen untuk mengkuantifikasi adalah Gas and liquid chromatography

dengan mass spechtrometry (GC-MC dan LCMC); Fourier transform infrared

spectroscopy (GC-FTIR) dan diode-array UV-VIS absoprtionspectroscopy (HPLC-

UV-VIS). Kromatografi gas (GC) digunakan untuk memisahkan senyawa organik

menguap (volatile). Fase bergerak adalah gas dan fase diam biasanya cairan. High

Performance Liquid Chromatografi (HPLC) adalah variasi dari khromatografi cairan

yang menggunakan pompa bertekanan tinggi untuk meningkatkan efisiensi

pemisahan senyawa kimia. Kromatografi cair (LC) digunakan untuk menganalisis

pemisahan campuran, yang mengandung ion-ion logam dan senyawa organik. Fase

bergerak adalah pelarut dan fase diam adalah cairan yang mendukung padatan,

padatan, dan ion pengganti resin.

3

Kromatografi dalam berbagai bentuknya telah digunakan secara luas sebagai

teknik pemisahan dan analisis. Pada tahun 1941, Martin dan Synge, yang kemudian

mendapat hadiah Nobel, dalam makalahnya mengemukakan pengertian-pengertian

dasar tentang kromatografi gas (GC) dan HPLC. Tidak kurang dari 10 tahun

kemudian, yaitu pada tahun 1952, James dan Martin untuk pertama kali

mengintrodusir penggunaan GC. Sejak saat itu GC telah menjadi bentuk kromatografi

yang paling baik dan berkembang dengan sangat cepat. Bentuk- bentuk kromatografi

yang lain seperti kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis (TLC), kromatografi

penukar ion dan kromatografi eksklusi (semuanya termasuk kromatografi cairan),

belum memperoleh sukses yang sama seperti yang telah dicapai oleh GC. Hal ini

disebabkan karena efisiensinya yang rendah serta waktu analisisnya yang panjang:

Pada awal tahun 1960-an, Giddings menunjukkan bahwa kerangka kerja teoritis yang

dikembangkan untuk GC berlaku sama baiknya untuk kromatografi cairan, dan antara

tahun 1967 – 1969 Kirkland, Huber, dan kelompok Horvath, Preiss dan Lipsky

mengemukakan penggunaan HPLC yang pertama kali. Dengan menggunakan

tekanan yang tinggi (sampai dengan 5000 psi), HPLC dapat mengatasi kelemahan-

kelemahan dari kromatografi cairan pada umumnya, misalnya viskositas cairan yang

relatif lebih besar dibanding dengan viskositas gas, sehingga HPLC mampu

memberikan waktu analisis (5 - 30 menit) yang kurang lebih sama dengan waktu

analisisnya GC.

Berdasarakan jenis fasa gerak dan fasa diamnya, kromatografi dapat

dibedakan atas berbagi tipe sebagai berikut:

Fase Gerak Fase Diam Tipe Kromatografi

Cairan Padatan Kromatografi Cair-Padat

Gas Padatan Kromatografi Gas-Padat

Cairan Cairan Kromatografi Cair-Cair

Gas Cairan Kromatografi Gas-Cair

4

Selain itu, penggolongan kromatografi juga dapat dilakukan berdasarkaan fase

geraknya saja, berdasarkan mekanisme pemisahannya, berdasarkan jenis

pendukungnya, dan juga berdasarkan arah pengembangnya.

Penggolongan berdasarkan fase gerak memberikan dua tipe kromatografi

sebagai berikut:

Fase Gerak Dasar Pemisahan Tipe Kromatografi

Gas Kestabilan termal senyawa Kromatografi Gas

Cairan Proses adsorpsi atau partisi Kromatografi Cair

Penggolongan kromatografi berdasarkan mekanisme pemisahan adalah

sebagai berikut:

Mekanisme Pemisahan Tipe Kromatografi

Adsorpsi Kromatografi Adsorpsi

Partisi Kromatografi Partisi

Pertukaran ion Kromatografi Pertukaran Ion

Perbedaan ukuran partikel Kromatografi Saringan Gel

Kromatografi Eksklusi Molekular

Pembagian kromatografi berdasarkan jenis pendukungnya adalah sebagai

berikut:

Jenis Pendukung Tipe Kromatografi

Kertas Kromatografi Kertas

5

Kaca/ lempeng logam tipis Kromatografi Lapis Tipis

Kolom Kromatografi KolomKromatografi Cair Vakum

Berdasarkan arah pengembangannya, kromatografi dapat dibedakan atas

beberapa tipe, yaitu:

Arah Pengembangan Tipe Kromatografi

Horizontal Kromatografi Horizontal

Vertikal menurun Kromatografi Vertikal Menurun

Vertikal menaik Kromatografi Vertikal Menaik

Sirkular Kromatografi Sirkular

Dua arah tegak lurus Kromatografi Dua arah

6

BAB II

ISI

Kromatografi adalah teknik pemisahan fisik suatu campuran zat-zat kimia

yang berdasar pada perbedaan migrasi dari masing-masing komponen campuran yang

terpisah pada fase diam di bawah pengaruh pergerakan fase gerak.

Berdasarakan jenis fasa gerak dan fasa diamnya, kromatografi dapat

dibedakan atas berbagi tipe sebagai berikut:

1. Kromatografi Cair-Padat

Metode jenis ini diketemukan oleh Tswett dan diperkenalkan kembali oleh

Kuhn dan Ledere pada tahun 1931. Metode ini banyak digunakan untuk analisis

biokimia dan organik. Teknik pelaksanaannya dilakukan dengan kolom. Sebagai fasa

diam di dalam kolom dapat dipilih salika gel atau alumina. Kekurangan metode

kromatografi cair-padat ini antara lain ialah:

(a) pilihan fasa diam (adsorben) terbatas

(b) koefisien distribusi untuk serapan seringkali tergantung pada kadar total. sehingga

pemisahannya kurang sempurna.

2. Kromatografi Gas-padat (KGP)

Kromatografi jenis ini digunakan sebelum tahun 1800 untuk menurunkan gas.

Metode ini pada awalnya kurang berkembang. Penemuan jenis-jenis padatan baru

sebagai hasil riset memperluas penggunaan metode ini. Kelemahan metode ini mirip

dengan kromatografi cair-padat.

Kelebihan menggunakan kromatografi padatan gas adalah :

7

a. Untuk memisahkan gas-gas H , N , O , CO, gas-gas mulia, dan hidrokarbon-

hidrokarbon rendah

b. Perkembangan KGP saat ini yaitu digunakanya polimer-polimer yang berpori

sperti PORAPAK dan POLYPAK, dimana penyerap-penyerap ini cocok untuk

memisahkan senyawa-senyawa yang polar sperti H O, NH , R-NH , R-OH dan

glikol-glikol, dan asam lemah rendah, juga untuk gas-gas seperti CO , N O, O dan

sebagainya.

c. Dapat digunakan untuk menyerap pada fasa diam yang berupa alumina atau pada

silica gel.

Kekurangan menggunakan kromatografi padatan gas (KGP) adalah:

a. KGP sangat sukar digunakan secara berulang dengan hasil yang sama.

b. Reproducibility KGP yang rendah karena puncak-puncak berekor disebabkan

permukaan aktif yang tidak homogen dari penyerap, waktu retensi relative

panjang, waktu retensi sangat tergantung pada jumlah pada cuplikan. Selain itu

kemungkinan penyerap dapat berkelakuan sebagai katalisator yang aktif, sehingga

KGP penggunaanya sangat terbatas sekali untuk senyawa yang mempunyai titik

didih yang rendah maupun tinggi.

3. Kromatografi Cair-cair

Metode kromatografi ini diperkenalkan oleh Martin den Synge pada tahun

1941. Fasa diam pada kromatografi Jenis ini berupa lapisan tipis cairan yang terserap

pada: padatan inert berpori, yang berfungsi sebagai fasa pendukung. Keuntungan

metode ini ialah:

(a) pelihan kombinasi cairan cukup banyak;

(b) koefisien distribusinya tidak tergantung pada konsentrasi, sehingga hasil-hasil

pemisahannya lebih tajam.

8

4. Kromatografi Gas-Cair (KGC)

Pada kimia organik kadang-kadang menyebutnya sebagi kromatografi fasa

uap. Pertama kali diperkenalkan oleh James dan Martin pada tahun 1952. Metode ini

paling banyak digunakan karena efisien. serba guna, cepat dan peka. Cuplikan dengan

ukuran beberapa mikrogram sampai dengan ukuran 10-15 gram masih dapat

dideteksi. Sayangnya komponen cuplikan harus mempunyai tekanan beberapa torr

pada suhu kolom.

Seluruh bentuk kromatografi terdiri dari fase diam dan fase gerak. Dalam

seluruh bentuk kromatografi yang lain, anda akan menemui fase gerak adalah cairan.

Dalam kromatografi gas-cair, fase gerak adalah gas seperti helium dan fase diam

adalah cairan yang mempunyai titik didih yang tinggi diserap pada padatan.

Bagaimana kecepatan suatu senyawa tertentu bergerak melalui mesin, akan

tergantung pada seberapa lama waktu yang dihabiskan untuk bergerak dengan gas

dan sebaliknya melekat pada cairan dengan jalan yang sama.

Diagram alir kromatografi gas-cair

9

Injeksi sampel

Sejumlah kecil sampel yang akan dianalisis diinjeksikan pada mesin

menggunakan semprit kecil. Jarum semprit menembus lempengan karet tebal

(Lempengan karet ini disebut septum) yang mana akan mengubah bentuknya kembali

secara otomatis ketika semprit ditarik keluar dari lempengan karet tersebut.

Injektor berada dalam oven yang mana temperaturnya dapat dikontrol. Oven

tersebut cukup panas sehingga sampel dapat mendidih dan diangkut ke kolom oleh

gas pembawa misalnya helium atau gas lainnya.

Cara kerja kolom

Material padatan

Ada dua tipe utama kolom dalam kromatografi gas-cair. Tipe pertama, tube

panjang dan tipis berisi material padatan; Tipe kedua, lebih tipis dan memiliki fase

diam yang berikatan dengan pada bagian terdalam permukaannya.

Untuk menyederhanakan, kita akan melihat pada kolom terpadatkan.

Kolom biasanya dibuat dari baja tak berkarat dengan panjang antara 1 sampai 4

meter, dengan diameter internal sampai 4 mm. Kolom digulung sehingga dapat

disesuakan dengan oven yang terkontrol secara termostatis.

Kolom dipadatkan dengan tanah diatomae, yang merupakan batu yang sangat

berpori. Tanah ini dilapisis dengan cairan bertitik didih tinggi, biasanya polimer lilin.

Temperatur kolom

10

Temperatur kolom dapat bervariasi antara 50 oC sampai 250 oC. Temperatur

kolom lebih rendah daripada gerbang injeksi pada oven, sehingga beberapa

komponen campuran dapat berkondensasi pada awal kolom.

Dalam beberapa kasus, seperti yang anda akan lihat pada bagian bawah,

kolom memulai pada temperatur rendah dan kemudian terus menerus menjadi lebih

panas dibawah pengawasan komputer saat analisis berlangsung.

Bagaimana pemisahan berlangsung pada kolom?

Ada tiga hal yang dapat berlangsung pada molekul tertentu dalam campuran

yang diinjeksikan pada kolom:

Molekul dapat berkondensasi pada fase diam.

Molekul dapat larut dalam cairan pada permukaan fase diam

Molekul dapat tetap pada fase gas

Dari ketiga kemungkinan itu, tak satupun yang bersifat permanen.

Senyawa yang mempunyai titik didih yang lebih tinggi dari temperatur kolom

secara jelas cenderung akan berkondensasi pada bagian awal kolom. Namun,

beberapa bagian dari senyawa tersebut akan menguap kembali dengan dengan jalan

yang sama seperti air yang menguap saat udara panas, meskipun temperatur dibawah

100 oC. Peluangnya akan berkondensasi lebih sedikit selama berada didalam kolom.

Sama halnya untuk beberapa molekul dapat larut dalam fase diam cair.

Beberapa senyawa akan lebih mudah larut dalam cairan dibanding yang lainnya.

Senyawa yang lebih mudah larut akan menghabiskan waktunya untuk diserap pada

fase diam: sedangkan senyawa yang suka larut akan menghabiskan waktunya lebih

banyak dalam fase gas.

11

Proses dimana zat membagi dirinya menjadi dua pelarut yang tidak

bercampurkan karena perbedaan kelarutan, dimana kelarutan dalam satu pelarut satu

lebih mudah dibanding dengan pelarut lainnya disebut sebagai partisi. Sekarang, anda

bisa beralasan untuk memperdebatkan bahwa gas seperti helium tidak dapat

dijelaskan sebagai pelarut. Tetapi, istilah partisi masih dapat digunakan dalam

kromatografi gas-cair.

Beberapa molekul dalam substansi menghabiskan waktu untuk larut dalam

cairan dan beberapa lainnya menghabiskan waktu untuk bergerak bersama-sama

dengan gas.

Waktu retensi

Waktu yang digunakan oleh senyawa tertentu untuk bergerak melalui kolom

menuju ke detektor disebut sebagi waktu retensi. Waktu ini diukur berdasarkan

waktu dari saat sampel diinjeksikan pada titik dimana tampilan menunujukkan tinggi

puncak maksimum untuk senyawa itu.

Setiap senyawa memiliki waktu retensi yang berbeda. Untuk senyawa

tertentu, waktu retensi sangat bervariasi dan bergantung pada:

Titik didih senyawa. Senyawa yang mendidih pada temperatur yang lebih

tinggi daripada temperatur kolom, akan menghabiskan hampir seluruh

waktunya untuk berkondensasi sebagai cairan pada awal kolom. Dengan

demikian, titik didih yang tinggi akan memiliki waktu retensi yang lama.

Kelarutan dalam fase cair. Senyawa yang lebih mudah larut dalam fase cair,

akan mempunyai waktu lebih singkat untuk dibawa oleh gas pembawa..

Kelarutan yang tinggi dalam fase cair berarti memiiki waktu retensi yang

lama.

Temperatur kolom. Temperatur tinggi menyebakan pergerakan molekul-

molekul dalam fase gas; baik karena molekul-molekul lebih mudah menguap,

12

atau karena energi atraksi yang tinggi cairan dan oleh karena itu tidak lama

tertambatkan. Temperatur kolom yang tinggi mempersingkat waktu retensi

untuk segala sesuatunya di dalam kolom.

Untuk memberikan sampel dan kolom, tidak ada banyak yang bisa dikerjakan

menggunakan titik didih senyawa atau kelarutannya dalam fase cair, tetapi anda dapat

mempunyai pengatur temperatur.

Semakin rendah temperatur kolom semakin baik pemisahan yang akan anda

dapatkan, tetapi akan memakan waktu yang lama untuk mendapatkan senyawa karena

kondensasi yang lama pada bagian awal kolom.

Dengan kata lain, menggunakan temperatur tinggi, segala sesuatunya akan

melalui kolom lebih cepat, tetapi pemisihannya kurang baik. Jika segala sesuatunya

melalui kolom dalam waktu yang sangat singkat, tidak akan terdapat jarak antara

puncak-puncak dalam kromatogram.

Jawabannya dimulai dengan kolom dengan suhu yang rendah kemudian

perlahan-lahan secara teratur temperaturnya dinaikkan.

Pada awalnya, senyawa yang menghabiskan lebih banyak waktunya dalam

fase gas akan melalui kolom secara cepat dan dapat dideteksi. Dengan adanya sedikit

pertambahan temperatur akan memperjelas perlekatan senyawa. Peningkatan�

temperatur masih dapat lebih `melekatan` molekul-molekul fase diam melalui kolom.

Detektor

Ada beberapa tipe detektor yang biasa digunakan. Detektor ionisasi nyala

dijelaskan pada bagian bawah penjelasan ini, merupakan detektor yang umum dan

lebih mudah untuk dijelaskan daripada detektor alternatif lainnya.

Detektor ionisasi nyala

13

Dalam mekanisme reaksi, pembakaran senyawa organik merupakan hal yang

sangat kompleks. Selama proses, sejumlah ion-ion dan elektron-elektron dihasilkan

dalam nyala. Kehadiran ion dan elektron dapat dideteksi.

Seluruh detektor ditutup dalam oven yang lebih panas dibanding dengan

temperatur kolom. Hal itu menghentikan kondensasi dalam detektor.

Jika tidak terdapat senyawa organik datang dari kolom, anda hanya memiliki

nyala hidrogen yang terbakar dalam air. Sekarang, anggaplah bahwa satu senyawa

dalam campuran anda analisa mulai masuk ke dalam detektor.

Ketika dibakar, itu akan menghasilkan sejumlah ion-ion dan elektron-elektron

dalam nyala. Ion positif akan beratraksi pada katoda silinder. Ion-ion negatif dan

elektron-elektron akan beratraksi pancarannya masing-masing yang mana merupakan

anoda.Hal ini serupa dengan apa yang terjadi selama elektrolisis normal.

14

Pada katoda, ion positif akan mendatangi elektron-elektron dari katoda dan

menjadi netral. Pada anoda, beberapa elektron dalam nyala akan dipindahkan pada

elektroda positif; ion-ion negatif akan memberikan elektron-elektronnya pada

elektroda dan menjadi netral.

Kehilangam elektron-elektron dari satu elektroda dan perolehan dari elektroda

lain, akan menghasilkan aliran elektron-elektron dalam sirkuit eksternal dari anoda ke

katoda. Dengan kata lain, anda akan memperoleh arus listrik.

Arus yang diperoleh tidak besar, tetapi dapat diperkuat. Jika senyawa-

senyawa organik lebih banyak dalam nyala, maka akan banyak juga dihasilkan ion-

ion, dan dengan demikian akan terjadi arus listrik yang lebih kuat. Ini adalah

pendekatan yang beralasan, khususnya jka anda berbicara tentang senyawa-senyawa

yang serupa, arus yang anda ukur sebanding dengan jumlah senyawa dalam nyala.

Kekurangan detektor ionisasi nyala

Kekurangan utama dari detektor ini adalah pengrusakan setiap hasil yang

keluar dari kolom sebagaimana yang terdeteksi. Jika anda akan mengrimkan hasil ke

spektrometer massa, misalnya untuk analisa lanjut, anda tidak dapat menggunakan

detektor tipe ini.

Penerjemahan hasil dari detektor

Hasil akan direkam sebagai urutan puncak-puncak; setiap puncak mewakili

satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor. Sepanjang anda mengontrol

secara hati-hati kondisi dalam kolom, anda dapat menggunakan waktu retensi untuk

membantu mengidentifikasi senyawa yang tampak-tentu saja anda atau seseorang lain

telah menganalisa senyawa murni dari berbagai senyawa pada kondisi yang sama.

15

Area dibawah puncak sebanding dengan jumlah setiap senyawa yang telah

melewati detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui komputer yang

dihubungkan dengan monitor. Area yang akan diukur tampak sebagai bagian yang

berwarna hijau dalam gambar yang disederhanakan.

Perlu dicatat bahwa tinggi puncak tidak merupakan masalah, tetapi total area

dibawah puncak. Dalam beberapa contoh tertentu, bagian kiri gambar adalah puncak

tertinggi dan memiliki area yang paling luas. Hal ini tidak selalu merupakan hal

seharusnya.

Mungkin saja sejumlah besar satu senyawa dapat tampak, tetapi dapat terbukti

dari kolom dalam jumlah relatif sedikit melalui jumlah yang lama. Pengukuran area

selain tinggi puncak dapat dipergunakan dalam hal ini (Clark, 2007).

Penggolongan berdasarkan fase gerak memberikan dua tipe kromatografi

sebagai berikut:

1. Kromatografi Gas

Campuran gas dapat dipisahkan dengan kromatografi gas. Fasa stationer dapat

berupa padatan (kromatografi gas-padat) atau cairan (kromatografi gas-cair).

Umumnya, untuk kromatografi gas-padat, sejumlah kecil padatan inert misalnya

16

karbon teraktivasi, alumina teraktivasi, silika gel atau saringan molekular diisikan ke

dalam tabung logam gulung yang panjang (2-10 m) dan tipis. Fasa mobil adalah gas

semacam hidrogen, nitrogen atau argon dan disebut gas pembawa. Pemisahan gas

bertitik didih rendah seperti oksigen, karbon monoksida dan karbon dioksida

dimungkinkan dengan teknik ini.

Dalam kasus kromatografi gas-cair, ester seperti ftalil dodesilsulfat yang

diadsorbsi di permukaan alumina teraktivasi, silika gel atau penyaring molekular,

digunakan sebagai fasa diam dan diisikan ke dalam kolom. Campuran senyawa yang

mudah menguap dicampur dengan gas pembawa disuntikkan ke dalam kolom, dan

setiap senyawa akan dipartisi antara fasa gas (mobil) dan fasa cair (diam) mengikuti

hukum partisi. Senyawa yang kurang larut dalam fasa diam akan keluar lebih dahulu.

Metoda ini khususnya sangat baik untuk analisis senyawa organik yang mudah

menguap seperti hidrokarbon dan ester. Analisis minyak mentah dan minyak atsiri

dalam buah telah dengan sukses dilakukan dengan teknik ini.

Efisiensi pemisahan ditentukan dengan besarnya interaksi antara sampel dan

cairannya. Disarankan untuk mencoba fasa cair standar yang diketahui efektif untuk

berbagai senyawa. Berdasarkan hasil ini, cairan yang lebih khusus kemudian dapat

dipilih. Metoda deteksinya, akan mempengaruhi kesensitifan teknik ini. Metoda yang

dipilih akan bergantung apakah tujuannya analisik atau preparatif ( Takeuchi, 2009 ).

2. Kromatografi Cair

Terdapat dua model operasional yang didasarkan pada polaritas relatif dari

fase diam dan fase bergerak.

17

1. Normal phase Chromatograpy :

Fase diam bersifat polar kuat dan fase gerak bersifat non-polar

Misalnya : Silika = fase diam , n-hexane = fase gerak

2. Reversed phase Chromatography:

Fase diam bersifat non-polar dan fase gerak bersifat polar.

Misal : Hydrocarbon = fase diam, air = fase gerak

Gambar 18.21. menggambarkan kedua teknik tersebut menunjukkann elusi

komponen

sampel dengan polaritas berbeda.

Gambar 18.21. Ilustrasi kromatografi cair yang normal dan “reversed phase”.

Fase gerak dapat dipompakan ke dalam kolom dengan tiga cara :

18

1. Isokratik:aliran tetap (konstan) dan ketetapan komposisi dari fase gerak tetap

berlaku.

2. Gradient Elution:aliran konstan dan perubahan komposisi dari fase gerak

terjadi.

3. Flow Program : aliran bervariasi dan ketetapan komposisi dari fase gerak

terjadi.

(Wiryawan, 2011).

Penggolongan kromatografi berdasarkan mekanisme pemisahannya adalah

sebagai berikut:

1. Kromatografi Partisi

Prinsip kromatografi partisi dapat dijelaskan dengan hukum partisi yang dapat

diterapkan pada sistem multikomponen yang dibahas di bagian sebelumnya. Dalam

kromatografi partisi, ekstraksi terjadi berulang dalam satu kali proses. Dalam

percobaan, zat terlarut didistribusikan antara fasa stationer dan fasa mobil. Fasa

stationer dalam banyak kasus pelarut diadsorbsi pada adsorben dan fasa mobil adalah

molekul pelarut yang mengisi ruang antar partikel yang ter adsorbsi.

Contoh khas kromatografi partisi adalah kromatografi kolom yang digunakan

luas karena merupakan sangat efisien untuk pemisahan senyawa organik (Gambar

12.3).

Kolomnya (tabung gela) diisi dengan bahan seperti alumina, silika gel atau

pati yang dicampur dengan adsorben, dan pastanya diisikan kedalam kolom. Larutan

sampel kemudian diisikan kedalam kolom dari atas sehingga sammpel diasorbsi oleh

adsorben. Kemudian pelarut (fasa mobil; pembawa) ditambahkan tetes demi tetes dari

atas kolom.

19

Partisi zat terlarut berlangsung di pelarut yang turun ke bawah (fasa mobil)

dan pelarut yang teradsorbsi oleh adsorben (fasa stationer). Selama perjalanan turun,

zat terlarut akan mengalami proses adsorpsi dan partisi berulang-ulang. Laju

penurunan berbeda untuk masing-masing zat terlarut dan bergantung pada koefisien

partisi masing-masing zat terlarut. Akhirnya, zat terlarut akan terpisahkan

membentuk beberapa lapisan.

Akhirnya, masing-masing lapisan dielusi dengan pelarut yang cocok untuk

memberikan spesimen murninya. Nilai R didefinisikan untuk tiap zat etralrut dengan

persamaan berikut.

R = (jarak yang ditempuh zat terlarut) / (jarak yang ditempuh pelarut/fasa mobil).

Gambar 12.3 Diagram skematik kromatografi

2. Kromatografi Penukar Ion

Kromatografi pertukaran ion merupakan metode kromatografi utama yang

paling banyak digunakan dalam produksi makromolekul biologis. Dibandingkan

dengan resin konvensional, maka tentakel penukar ion Merck Fractogel® dan

Fractoprep® meningkatkan efisiensi proses pemisahan. Media tentakel memberikan

sejumlah manfaat seperti kapasitas tinggi pada tingkat laju tinggi, selektivitas tinggi,

20

efisiensi tinggi, dan pemulihan tinggi. Keduanya memertahankan aktivitas biologi

selama pemurnian dan mendapatkan hasil yang tinggi. Semua penukar ion Merck

menunjukkan kapasitas pengikat protein yang luar biasa pada tingkat laju tinggi dan

menawarkan berbagai fitur yang bermanfaat untuk banyak proses produksi

(Darmstadt, 2012).

Kromatografi Penukar Ion (Ion Exchange Cromatography)

Fase diam berupa penukar kation maupun anion yang terdiri atas gel silika

atau polimer dengan berat molekul tinggi dimana merupakan gugus ionik berikatan

kimia, Bahan terlarut (bersifat ionik) ditambahkan pada sistem pertukaran kation atau

anion dengan polar eluan (misal air). Mekanisme pemisahan berdasarkan pada daya

tarik elektrostatik.

(Wiryawan, 2011).

Mengoperasikan Alat Penukar Ion

Pada proses kolom ganda, air mentah mula-mula masuk ke dalam kolom

penulcar kation. Di sini sernua kation yang terkandung dalam air (terutama ion

21

kalsium, magnesium dan natrium) ditukar dengan ion hidrogen. Dalarn kolom

berikutnya yang berisi penukar anion, maka anion (terutama ion khlorida, sulfat dan

bikarbonat) ditukar dengan ion hidroksil. Ion hidrogen yang berasal dari penukar

kation dan ion hidroksil dari penukar anion akan membentuk ikatan dan

menghasilkan air.

Setelah air terbentuk maka resin penukar ion harus diregenerasi. Pelaksanaan

regenerasi pada proses kolorn ganda sangat sederhana. Ke dalam kolom penukar

kation dialirkan asarn khlorida encer dan ke dalam kolom penukar anion dialirkan

larutan natrium hidroksida encer. Regeneran yang berlebihan selanjutnya dibilas

dengan air.

Pada proses unggun campuran – kolom tunggal, resin penukar kation dan

penukar anion dicampur menjadi satu dalam sebuah kolom tunggal. Dengan proses

unggun campuran dapat dicapai tingkat kemurnian air yang jauh lebih tinggi daripada

dengan proses kolom ganda. Sebaliknya, pada proses unggun campuran regenerasi

resin penukar lebih kompleks.

Langkah-langkah kerja pada regenerasi unggun campuran:

22

Pernisahan resin penukar kation dan penukar anion dengan cara klasifikasi

menggunakan air (pencucian kembali dari bawah ke atas). Dalam hal ini resin

penukar anion yang lebih ringan (kebanyakan berwarna lebih terang) akan berada di

atas resin 349 penukar kation yang lebih berat (kebanyakan berwarna lebih gelap).

Pencucian kembali harus dilangsungkan terus sampai di antara kedua resin terlihat

suatu lapisan pemisah yang tajam.

1. Untuk regenerasi, regeneran bersama dengan air dialirkan melewati kedua

lapisan resin Asam khlorida encer dialirkan dari bawah ke atas melewati resin

penukar kation, dan dikeluarkan dari kolom pada ketinggian lapisan pernisah.

Larutan natrium hidroksida encer dialirkan dari atas ke bawah melewati resin

penukar anion, juga dikeluarkan pada keting gian lapisan pemisah.

2. Kelebihan kedua regeneran kemudian dicuci dengan air

3. Ketinggian permukaan air dalam kolom diturunkan dan kedua resin penukar

dicampur dengan cara memasukkan udara tekan dari ujung bawah kolom.

4. Pencucian ulang unggun campuran dengan air dari atas ke bawah, sampai alat

ukur konduktivitas menunjukkan kondisi kemurnian air yang diinginkan.

Sekarang instalasi siap untuk dioperasikan lagi. Baik pada instalasi pclunakan

maupun pada instalasi demineralisasi air, maka pengalihan dari kondisi operasi ke

proses regenerasi, pelaksanaan regenerasinya sendiri, dan pengalilian kembah ke

kondisi 350 operasi dapat dilakukan baik secara manual maupun secara otomatik.

Untuk mencapai kualitas air atau performansi yang optimal dan untuk

mencegah terjadinya kerusakan pada resin penukar, maka petunjuk kerja yang

diberikan oleh pabrik pembuat instalasi (misalnya mengenai urutan pelaksanaan

operasi, kuantitas dan konsentrasi regeneran, waktu regenerasi dan waktu pencucian)

harus diikuti dengan seksama.

23

Pada saat bekerja dengan asam dain basa yang diperlukan untuk regenerasi,

perlengkapan keselamatan perorangan yang sesuai harus digunakan. Air buangan

yang keluar pada regenerasi dapat bersifat asam, basa atau mengandung garam. dan

karena itu dalam hubungannya dengan pelestarian lingkungan harus ditangani seperti

air limbah kimia.

Ukuran performansi sebuah instalasi penukar ion adalah kuantitas cairan yang

diproduksi per jam (atau selang waktu di antara dua regenerasi). Performansi

tergantung pada besarnya alat atau kuantitas penukar, pada kuantitas ion yang akan

dipisahkan (dengan syarat kemurnian air yang diinginkan telah tertentu) dan pada

tingkat kemurnian yang diminta. Untuk operasi yang semi kontinu (bila pengolahan

air tidak bolch berhenti di tengah-tengah) diperlukan dua buah unit yang

dihubungkan secara paralel. Karena proses pertukaran dan proses regenerasi tidak

dapat berlangsung pada saat yang bersamaan, kedua unit tersebut bekerja secara

bergantian, yang satu sebagai penukar ketika yang lain sedang regenerasi.

24

Beberapa jenis proses pertukaran sering juga digabungkan bersama. Misalnya

untuk meringankan beban kolorn utama dari instalasi unggun campuran (untuk

meningkatkan perforinansinya) dapat dipasang sebuah kolom pelunak air di

depannya.

(Rahayu, 2009).

3. Kromatografi Eksklusi Molekular

Pemisahan berbagai konstituen dengan meninjau perbedaann ukuran dan

geometri molekul adalah dasar Kromatografi eksklusi. Peredaan ukuran

menyebabkan beberapa partikel bergerak lebih cepat dari yang lainya sehingga

menimbulkaan perbedan permukaan migrasi. Kromatografi eksklusi dapat

dikelompokkan menjadi tiga kategori yaitu :

a) Teknik permeasi gel atau filtrasi gel,

b) Eksklus dan reterdasi ion

c) Inorganic molecular sieves

A. Teknik Permeasi atau Filtrasi Gel

25

Teknik permeasi atau Filtrasi adalah suatu teknik yang menguraikan campuran zat-zat

sesuai dengan ukuran molekulnya. Teknik ini didasari atas inklusi dan eksklusi suatu

zat terlarut melalui suatu fase diam yang terbuat dari gel polimer yang terikat silang

ddan berpori heterogen. Dalam kromatografi eksklusi cair-padat pemisahan teradi

antara vase cair di dalam partike gel dan cairan di luar mengelilingi partikel gel.

Sebagai penunjang fase diam dalam pemisahan ini biasanya digunakan xerogel-

xerogel. Xerogel adalah suatu gel organik yang dapat bersifat hidrofilik (yaitu : agar

dan dekstran yang terikat silang pada poliakrilamida) ataupun hidrofobik (poistirena).

Xerogel-xerogel ini tersedia di pasaran dengan nama dagang biogel p-2

(poliakrilamida),sepadex G-10-200 (dekstran) juga styrogel (gel polistirena yang

dimodifikasi) dan agarose.

Kolom yang digunakan adalah kolom biaya pengelusi (luent) dibiarkan

mengalir karena grafitasinya. Laju aliran akan bertambah dengan bertambahnya

ukuran partikel seperti kromatografi pertukaran ion, laju aliran juga dapat

dipengaruhi oleh variasi porositas gel. Untuk suatu gel yang tidak padat, volume

interstisi dapat diturukan dengan pemberian tekanan, volume eluent berkisar antara

25 – 100 ml. sepertii juga metode kromatografi lainnya, konsekwensi efluaennya

diukur melalui sifat-sifat fisik yang sesuai, seperti indeks refraksi, absorbansi,

intensitaas pendar flour atau sifat-sifat listriknya.

Pemisahann suatu tipe gel bergantung pada ukurran molekul dan sifat kimia

dari zat yang akan dipisahkan. Misalkan biogel 0 – 10 digunakan untuk zat-zat

dengan berat molekul berkisar antara 500-17000 satuan. Molekul dengan besar

molekul diatas batas ini yaitu limit eksklusif, akan lewat saja tanpa rintangan dari gel.

Di bawah limit eksklusi, zat tersebut akan terelusi pada volume elusi yang sesuai

dengan volume bed total. Untuk bekerja dalam medium tidak berai, gel yang tepat

digunakan adalah sephadex LH-20.

26

Pemakain Kromatografi permeasi gel digunakan untuk analisis campran

molekul dengan berat molkul yang berbeda seperti pemisahaan rafinosa, maltose,

dengan menggunakan sephadex pada pH 7,0, laju aliran 5 ml/jam ddan H2O sebagai

eluent. Pemisahan molekul- molekul dengan berat molekul sama dapat juga

dilakukan dengan pemilihan yang tepat tipe gel dan tinggi kolomnya. Pengeluaran

garam (desalting) adalah salah satu pemisahan yang meliputi pembebasan garam dan

senyawa berberat dengan molekul makro.

B. Eksklusi dan reterdarsi ion

Eksklusi ion adalah suatu proses untuk memisahkan materi ionic dari materi

nonionic didasari pada perbedaan distribusi pada ke dua tipe zat pelarut ini di antara

vase resin penukar ion dan larutan air. Jika suatu resin penukar ion diletakkan dalam

larutan elektrolit encer atau dalam air, konsentrasi elektrolit pada kesetimbangan

dalam fase resin akan lebih kecil dari pada larutan sekelilingnya yaitu fase luarnya,

tetapi bila resin diletakkan dalam suatu larutan nondielektrolit (dalam air), maka

nonelektrolit ini akan berubah untuk terdistribbusi secara merata pada kedua fase.

Jadi sebenarnya tidak terjadi penukaran ion dalam peristiwa absobsi elektrolit dan

elektrolit tersebut. Karena ke dua tipe zat terlarut ini dapat diekstraksi dari resin

dengan hanya mengencerkan larutan laurnya (sekelilingnya). Dengan air. Jiak suatu

latutan yang mengandung baik materi-materi ionic dan nonionic diletakkan pada

bagian atas kolom berisi resin dan dicuci dengan air, materi ionic akan mengalir

mengelilingi partikel resin sedang materi nonionic berdifusi kedalam pertikel-partikel

resin dan masuk kedalam rongga-rongga kosong antara partikel resin. Laju

perpindahan materi nonionic akiabatnya akan lebih rendah dari pada komponen

ionicnya dan akan teramati komponen ionic muncul terlebih dahulu sebagai efluen.

Jelasbahwa resin penukaran ion digunakan sebagai fase diam, dank arena tidak terjadi

penukaran ion, resindapat dipakai terus-menerustanpa regenerasi.

B.1. Mekanisme Eksklusi Ion

27

Suatu resin penukaran ion tidaklah sama dengan absobsi biasa. Dengan

mengatur jaringan muatan suatu resin, dapat diperoleh keadaan dimana hanya satu

macam ion elektrolit yang dieksklusikan. Jumlah total elektrolit yang berdifusi

kedalam resin dibatasi eloh prinsip elektronetralitas. Makin kuat terionisasi suatu

resin penukaran makin efesien untuk eksklusi ion. Banyaknya garam yang erdifusi

kedalam resin berkurang dengan bertamnbahnya kapasitas penukar ion suatu resin.

Sebagian besar ion elektrolit berberat elektrolit rendah yang mudah larut dalam air,

bebas berdifusi kedalam dan keluar resin tidak peduli besarnya kapasitas resin,

sehingga cenderung berkonsentrasi sama dengan ke dua fase saat kesetimbangan

tercapai.

B.2. Aplikasi Metode Ion Eksklusi

Gula dan garam tidak dapat dipisahkan dengan metode ini karena ukuran dan

ketidakmampuanya relative dari molekul sukrosa dan glukosa untuk berdifusi secara

cepat kedalam fase resin. Pemisahan elektrolit kuat dan molekul netral paling baik

dicapai dengan metode eksklusi ion, misalnya pemisahan NaCl dan etilen glikol, HCl

dan HC3COOH, CH3COOH; NaCl dan etano. Riechenberg telah menggunakan

teknik ini untuk pemisahan anggota deret Homolog, misalkan pemisahan asam asetat

dan asam n- butirat. Gugusan sulfanat yang bersiafat asam pada resin penukaran ion,

dapat menghasilkan efek garam pada materi organic dan cenderung untuk menehan

efek absorbsi matriks resin. Oleh karena itu rieman menggunakan larutan garam

sebagai pengganti larutan H2O untuk eluen dalam memisahkan methanol, etanol dan

propanol. Efek yang menguntungkan adanya garam dalam eluen adalah efek garam

selektif terhadap komponen nonionic dari fase larutannya.

C. Molekular sieve anorganic – Zeolit

Zeolit alam dan sintesis membentuk suatu saringan molekul untuk pemisahan

gas-gas dan molekul organic berukuran organic berukuran kecil. Volume suatu zeolit

terbentuk dari suatu rongga-romgga yang saling dihungbungkan dengan saluran-

28

saluran (channels). Penyaringan dan aksi penghambatan dari saluran dikombinasikan

dengan aktifitas adsobsi permukaan matriks Kristal sehingga memungkinkan

digunakannya zeolit untuk memisahkan molekul—molekul yang lebih kecil dari

ukuran saluran ini dari molekul yang lebih besar ukurannya dari ukuran saluran.

Aktifitas permukaan dan geometris molecular berperanan dalam pemisahan ini.

Secara structural zeolit adalah rangka tetrahedral yang bersatu membetuk struktur

sarang tawon dengan rongga-rongga besar yang saling berhubungan melalui saluran-

saluran kecil. Penampang lintang dari saluran inilah yang menentukan ukuran

molekul yang dapat masuk ke dalam rongga-rongga. Ukuran dari posisi ion logam

(misal Na, Ca) dalam Kristal zeolit,dan tipe struktur jaringan rangka tetra hedral

alumina silica zeolit menentukan diameter efektif dari saluran-saluran tersebut.

Beberapa macam tipe zeolit, misalkan tipe molecular sieve 4A adalah [Na12

(AlO2)12 (SiO2)12]. Molekul berdiameter lebih kecil dari 4A akan terabsorbsi,

misalkan H2O, CO2, H2S, SO2dan hidrokarbon borongga 1-2 atom karbon. Etana

dapat masuk kedalam molecular sieve 5A, yang dibuat dari molecular sieve 4A

dengan menggantikan Na oleh Ca dan K. paraffin lantai lurus dapat masuk

kedalamnya, demikian juga alcohol sampai dengan C 4, tetapi siklopropana tidak

dapat masuk. Demikian juga asam naftanik dan olekul aromatic lainya. Tipe 10 x dan

13 x adalah Na8 (AlO2)80 (SiO2)106. Mereka mengabsobsi molekul berdiameter

sampai 10 A.

Molecular sieve mempunyai afinitas lebih besar terhadap molekul polar dan

senyawa yang berpolarisasi karena induksi pada molekul nonpolar yang berukuran

sama. Molekul-molekul polar tertahan dengan kuat dalam rongga Kristal. Pada

pemurnian dan industry gas, molekul sieve digunakan untuk menghilangkan molekul-

molekul tidak jenuh (polar). Zeolit digunakan juga sebagai medium berlangsungnya

reaksi. Bahan kimia didalamnya sebagai hasil reaksi dapat dikeluarkan dengan

menggunakan teknik vakum atau dengan pergeseran menggunakan materi yang

berabsorbsi kuat, misalkan air. Molecular sieve ini dapat diaktifkan kemali dengan

29

peanasan 200-3500 C. mereka juga digunakan dalam kromatografi gas padat sebagai

fase diamnya dalam kolom.

4. Kromatografi Permeasi Gel (KPG)

Kromatografi gel merupakan metode kromatografi baru, meliputikromatografi

eksklusi, kromatogeafi penyaring gel, dan kromatografi permeasigel. Kromatografi

ini paling mudah dimengerti dan paling mudah dikerjakan.Selain kesederhanaannya,

teknik ini sangat berguna.

Metode ini dapat digunakan terhadap suatu cuplikan yang larut dan pengguna

utama kromatografi gel biasanya dalam salah satu dari tiga hal ini.

Pertama, kromatografi gel sangat berguna untuk untk pemisahan spesies

dengan berat molekul tinggi (BM >2000), terutama yang tak terionkan. Selain

dari resolusidari setiap makromolekuler seperti protein dan asam nukleat,

kromatografi gel dapat digunakan untuk mendapatkan distribusi berat molekul

dari polimer sintetis.

Kedua, campuran sederhana dapat dipisahkan secara mudah dengan

kromatografi gel, terutama jika penyusun campuran itu memiliki berat

molekul yang sangat berbeda. Untuk hal ini dapat dilakukan dalam jumlah

besar.

Ketiga, kromatografi gel sangat cocok untuk kerja awal, yaitu untuk

mengeksplorasi cuplikan yang tidak diketahui. Pemisahan ini memberikan

gambaran isi cuplikan, sehingga dapat diketahui dengan cepat apakah

cuplikan itu memiliki berat molekul rendah atau tinggi.

Kromatografi gel memiliki beberapa keuntungan dalam penggunaannya:

1. Pita-pita sempit.

30

2. Waktu pemisahan pendek.

3. Waktu pemisahan mudah diramalkan.

4. Harga Tr sesuai dengan ukuran cuplikan.

5. Tidak terjadi kehilangan cuplikan atau reaksi selama pemisahan.

6. Hanya terjadi sedikit masalah dalam deaktivasi kolom.

Kromatografi gel juga memiliki kelemahan:

1. Kapasitas terbatas.

2. Tidak dapat digunakan untuk cuplikan yang mempunyai ukuran hampir sama.

3. Kapasitas puncak yang terbatas. Ini berarti hanya ada sedikit pita yang dapat

dihubungkan dengan kromatogramtotal, karena kromatogram cukup pendek semua

senyawa terelusi sebelum. Pada kromatografi gel jarang terlihat lebih dari enam

pita pada satu kromatogram. Ini berarti bahwa kromatografi gel biasanya tidak

dapat memisahkan secara sempurnasuatu cuplikan kompleks, tanpa pemisahan

lebih lanjut dengan metode lain. Kekurangan kedua adalah tidak dapat

memisahkan senyawa-senyawa yangmempunyai ukuran hampir sama. Hal ini

menyingkorkan kromatografi gel dalam banyak masalah pemisahan senyawa yang

penting, termasuk pemisahan isomer. Perbedaan pada kromatografi gel adalah

prinsip pemisahan yang berbeda denganyang digunakan metode kromatografi lain.

Konsep factor pemisahan α, dan factor kapasitas k’ tidak bisa digunakan. Susunan

fasa gerak juga relative tidak penting pada kromatografi gel.Pengelompokkan

berbagai penggunaan kromatografi gel biasanya dibagidalam dua teknik

yaitu teknik filtrasi gel (pelarut air) dan kromatografi permeasigel (pelarut

oragnik).1.Fasa DiamPemisahan dalam kromatografi gel sebagian besar ditentukan

oleh jenisfasa diam yang digunakan. Oleh karena itu, pemilihan gel atau fasa diam

untuk suatu pemisahan merupakan suatu langkah penting.

31

Fasa diam yang digunakan untuk kromatografi gel merupakan bahan dalam ukuran

pori berbeda-beda dimana setiap ukuran cocok untuk pemisahan

senyawa yang tertentu berat molekulnya. Kebanyakan kromatografi permeasi gel

digunakan fasa diam polistirena berpori yang mempunyai ikatansilang divinil

benzena. Poragel dan Bio-Bead dapat untuk memisahkan senyawayang relative

kecil sampai dengan berat molekul sekitar 20.000. Styragel untuk  memisahkan

senyawa besar dengan berat molekul 20 juta. Gel vinil asetat berporiserupa dengan

gel polistirena, tetapi untuk senyawa dengan berat molekul rendah.

Kromatografi permeasi gel ( KPG ) dengan pelarut organic juga dapat dikerjakan

dengan fasa diam kaku dari silica atau gelas berpori. Bahan ini lebihstabil daripada

gel organic dan pengisian kolompun lebih mudah. Tetapi kerapkali memberikan

retensi yang jelek karena terjadi serapan oleh permukaan silica.

5. Kromatografi Adsorpsi

Metode ini banyak digunakan untuk analisis biokimia dan organik. Teknik

pelaksanaannya dilakukan dengan kolom. Sebagai fasa diam di dalam kolom dapat

dipilih salika gel atau alumina. Kekurangan metode kromatografi cair-padat ini antara

lain ialah: (a) pilihan fasa diam (adsorben) terbatas; (b) koefisien distribusi untuk

serapan seringkali tergantung pada kadar total. sehingga pemisahannya kurang

sempurna.

Pembagian kromatografi berdasarkan jenis pendukungnya adalah sebagai berikut:

1. Kromatografi Lapis Tipis

Pelaksaanan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika

atau alumina yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik yang

keras. Jel silika (atau alumina) merupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi

32

lapis tipis seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat pendarflour. Fase

gerak merupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai.

Kromatogram

Sebuah garis menggunakan pinsil digambar dekat bagian bawah lempengan

dan setetes pelarut dari campuran pewarna ditempatkan pada garis itu. Diberikan

penandaan pada garis di lempengan untuk menunjukkan posisi awal dari tetesan. Jika

ini dilakukan menggunakan tinta, pewarna dari tinta akan bergerak selayaknya

kromatogram dibentuk.

Ketika bercak dari campuran itu mengering, lempengan ditempatkan dalam

sebuah gelas kimia bertutup berisi pelarut dalam jumlah yang tidak terlalu banyak.

Perlu diperhatikan bahwa batas pelarut berada di bawah garis dimana posisi bercak

berada.

Alasan untuk menutup gelas kimia adalah untuk meyakinkan bawah kondisi

dalam gelas kimia terjenuhkan oleh uap dari pelarut. Untuk mendapatkan kondisi ini,

dalam gelas kimia biasanya ditempatkan beberapa kertas saring yang terbasahi oleh

pelarut. Kondisi jenuh dalam gelas kimia dengan uap mencegah penguapan pelarut.

Karena pelarut bergerak lambat pada lempengan, komponen-komponen yang

berbeda dari campuran pewarna akan bergerak pada kecepatan yang berbeda dan

akan tampak sebagai perbedaan bercak warna.

33

Gambar lempengan setelah pelarut bergerak setengah dari lempengan

Pelarut dapat mencapai sampai pada bagian atas dari lempengan. Ini akan

memberikan pemisahan maksimal dari komponen-komponen yang berwarna untuk

kombinasi tertentu dari pelarut dan fase diam.

Perhitungan nilai Rf

Sering kali pengukuran diperoleh dari lempengan untuk memudahkan

identifikasi senyawa-senyawa yang muncul. Pengukuran ini berdasarkan pada jarak

yang ditempuh oleh pelarut dan jarak yang tempuh oleh bercak warna masing-

masing.

Ketika pelarut mendekati bagian atas lempengan, lempengan dipindahkan dari gelas

kimia dan posisi pelarut ditandai dengan sebuah garis, sebelum mengalami proses

penguapan. Pengukuran berlangsung sebagai berikut:

34

Nilai Rf untuk setiap warna dihitung dengan rumus sebagai berikut:

Rf= jarak yang ditempuh oleh komponen

jarak yang ditempuh oleh pelarut

Jika substansi yang ingin dianalisis tidak berwarna, ada dua cara untuk

menyelesaikan analisis sampel tersebut :

Menggunakan pendarflour

Fase diam pada sebuah lempengan lapis tipis seringkali memiliki substansi

yang ditambahkan kedalamnya, supaya menghasilkan pendaran flour ketika diberikan

sinar ultraviolet (UV). Itu berarti jika diberikan sinar dengan sinar UV, akan

berpendar.

Pendaran ini ditutupi pada posisi dimana bercak pada kromatogram berada,

meskipun bercak-bercak itu tidak tampak berwarna jika dilihat dengan mata. Itu

berarti bahwa jika anda menyinarkan sinar UV pada lempengan, akan timbul

pendaran dari posisi yang berbeda dengan posisi bercak-bercak. Bercak tampak

sebagai bidang kecil yang gelap.

35

Sementara UV tetap disinarkan pada lempengan, anda harus menandai posisi-posisi

dari bercak-bercak dengan menggunakan pinsil dan melingkari daerah bercak-bercak

itu. Seketika anda mematikan sinar UV, bercak-bercak tersebut tidak tampak

kembali.

Penunjukkan bercak secara kimia

Dalam beberapa kasus, dimungkinkan untuk membuat bercak-bercak menjadi

tampak dengan jalan mereaksikannya dengan zat kimia sehingga menghasilkan

produk yang berwarna. Sebuah contoh yang baik adalah kromatogram yang

dihasilkan dari campuran asam amino.

Kromatogram dapat dikeringkan dan disemprotkan dengan larutan ninhidrin.

Ninhidrin bereaksi dengan asam amino menghasilkan senyawa-senyawa berwarna,

umumnya coklat atau ungu.

36

Dalam metode lain, kromatogram dikeringkan kembali dan kemudian

ditempatkan pada wadah bertutup (seperti gelas kimia dengan tutupan gelas arloji)

bersama dengan kristal iodium.

Uap iodium dalam wadah dapat berekasi dengan bercak pada kromatogram,

atau dapat dilekatkan lebih dekat pada bercak daripada lempengan. Substansi yang

dianalisis tampak sebagai bercak-bercak kecoklatan.

Dalam metode lain, kromatogram dikeringkan kembali dan kemudian

ditempatkan pada wadah bertutup (seperti gelas kimia dengan tutupan gelas arloji)

bersama dengan kristal iodium.

Uap iodium dalam wadah dapat berekasi dengan bercak pada kromatogram,

atau dapat dilekatkan lebih dekat pada bercak daripada lempengan. Substansi yang

dianalisis tampak sebagai bercak-bercak kecoklatan.

Penggunaan kromatografi lapis tipis untuk mengidentifikasi senyawa-senyawa

Anggaplah anda mempunyai campuran asam amino dan ingin menemukan

asam amino-asam amino tertentu yang terkandung didalam campuran tersebut. Untuk

sederhananya, mari kira berasumsi bahwa anda mengetahui bahwa campuran hanya

mungkin mengandung lima asam amino.

Setetes campuran ditempatkan pada garis dasar lempengan lapis tipis dan

bercak-bercak kecil yang serupa dari asam amino yang telah diketahui juga

ditempatkan pada disamping tetesan yang akan diidentifikasi. Lempengan lalu

ditempatkan pada posisi berdiri dalam pelarut yang sesuai dan dibiarkan seperti

sebelumnya. Bagian kiri gambar menunjukkan lempengan setelah pelarut hampir

mencapai bagian atas dari lempengan. Bercak-bercak masih belum tampak. Gambar

kedua menunjukkan apa yang terjadi setelah lempengan disemprotkan ninhidrin.

37

Tidak diperlukan menghitung nilai Rf karena anda dengan mudah dapat

membandingkan bercak-bercak pada campuran dengan bercak dari asam amino yang

telah diketahui melalui posisi dan warnanya. Dalam contoh ini, campuran

mengandung asam amino 1, 4 dan 5.

Bagaimana jika campuran mengandung lebih banyak asam amino daripada

asam amino yang digunakan sebagai perbandingan? Ini memungkinkan adanya

bercak-bercak dari campuran yang tidak sesuai dengan asam amino yang dijadikan

perbandingan itu. Anda sebaiknya mengulangi eksperimen menggunakan asam amino

lain sebagai perbandingan.

Bagaimana kromatografi lapis tipis berkerja?

Fase diam-jel silika

Jel silika adalah bentuk dari silikon dioksida (silika). Atom silikon

dihubungkan oleh atom oksigen dalam struktur kovalen yang besar. Namun, pada

permukaan jel silika, atom silikon berlekatan pada gugus -OH.

Jadi, pada permukaan jel silika terdapat ikatan Si-O-H selain Si-O-Si. Gambar

ini menunjukkan bagian kecil dari permukaan silika.

38

Permukaan jel silika sangat polar dan karenanya gugus -OH dapat membentuk ikatan

hidrogen dengan senyawa-senyawa yang sesuai disekitarnya, sebagaimana halnya

gaya van der Waals dan atraksi dipol-dipol.

Fase diam lainnya yang biasa digunakan adalah alumina-aluminium oksida.

Atom aluminium pada permukaan juga memiliki gugus -OH. Apa yang kita sebutkan

tentang jel silika kemudian digunakan serupa untuk alumina.

Apa yang memisahkan senyawa-senyawa dalam kromatogram?

Ketika pelarut mulai membasahi lempengan, pelarut pertama akan melarutkan

senyawa-senyawa dalam bercak yang telah ditempatkan pada garis dasar. Senyawa-

senyawa akan cenderung bergerak pada lempengan kromatografi sebagaimana halnya

pergerakan pelarut.

Bagaimana cepatnya senyawa-senyawa dibawa bergerak ke atas pada

lempengan, tergantung pada:

Bagaimana kelarutan senyawa dalam pelarut. Hal ini bergantung pada

bagaimana besar atraksi antara molekul-molekul senyawa dengan pelarut.

Bagaimana senyawa melekat pada fase diam, misalnya jel silika. Hal ini

tergantung pada bagaimana besar atraksi antara senyawa dengan jel silika.

39

Anggaplah bercak awal mengandung dua senyawa, yang satu dapat

membentuk ikatan hidrogen, dan yang lainnya hanya dapat mengambil　bagian

interaksi van der Waals yang lemah.

Senyawa yang dapat membentuk ikatan hidrogen akan melekat pada jel silika

lebih kuat dibanding senyawa lainnya. Kita mengatakan bahwa senyawa ini terjerap

lebih kuat dari senyawa yang lainnya. Penjerapan merupakan pembentukan suatu

ikatan dari satu substansi pada permukaan. Penjerapan bersifat tidak permanen,

terdapat pergerakan yang tetap dari molekul antara yang terjerap pada permukaan jel

silika dan yang kembali pada larutan dalam pelarut.

Dengan jelas senyawa hanya dapat bergerak ke atas pada lempengan selama

waktu terlarut dalam pelarut. Ketika senyawa dijerap pada jel silika-untuk sementara

waktu proses penjerapan berhenti-dimana pelarut bergerak tanpa senyawa. Itu berarti

bahwa semakin kuat senyawa dijerap, semakin kurang jarak yang ditempuh ke atas

lempengan.

Dalam contoh yang sudah kita bahas, senyawa yang dapat membentuk ikatan

hidrogen akan menjerap lebih kuat daripada yang tergantung hanya pada interaksi

van der Waals, dan karenanya bergerak lebih jauh pada lempengan.

Bagaimana jika komponen-komponen dalam campuran dapat membentuk

ikatan-ikatan hidrogen? Terdapat perbedaan bahwa ikatan hidrogen pada tingkatan

yang sama dan dapat larut dalam pelarut pada tingkatan yang sama pula. Ini tidak

hanya merupakan atraksi antara senyawa dengan jel silika. Atraksi antara senyawa

dan pelarut juga merupakan hal yang penting-hal ini akan mempengaruhi bagaimana

mudahnya senyawa ditarik pada larutan keluar dari permukaan silika.

Bagaimanapun, hal ini memungkinkan senyawa-senyawa tidak terpisahkan

dengan baik ketika anda membuat kromatogram. Dalam kasus itu, perubahan pelarut

dapat membantu dengan baik termasuk memungkinkan perubahan pH pelarut.

40

2. KLT Preparatif

KLT preparatif pada dasarnya, prinsip kerjanya sama dengan KLT. Tetapi,

tujuan dilakukannya berbeda, yaitu untuk memisahkan senyawa dari fraksinya

(pemisahan isolat). Perbedaan lainnya terletak pada ketebalan pelat atau lapisan

absorbannya, di mana pada KLT biasa untuk analisis ukurannya berkisar antara 0,1-

0,25 mm, sedangkan untuk KLT preparatif berkisar antara 0,5-2,0 mm.

Prinsip dari KLT preparatif ini yaitu berdasarkan perbedaan kemampuan

masing-masing senyawa dalam berinteraksi dengan fase diam dan kelarutan dalam

pengembann yang digunakan. Pengembang yang digunakan biasanya merupakan

campur an dari berbagai jenis pelarut dengan tujuan melakukan pemisahan

berdasarkan kepolaran dan kelarutan terhadap pengembang tersebut.

3. Kromatografi Kertas

Mekanisme pemisahan dengan kromatografi kertas prinsipnya sama dengan

mekanisme pada kromatografi kolom. Adsorben dalam kromatografi kertas adalah

kertas saring, yakni selulosa. Sampel yang akan dianalisis ditotolkan ke ujung kertas

41

yang kemudian digantung dalam wadah. Kemudian dasar kertas saring dicelupkan

kedalam pelarut yang mengisi dasar wadah. Fasa mobil (pelarut) dapat saja beragam.

Air, etanol, asam asetat atau campuran zat-zat ini dapat digunakan.

Kromatografi kertas diterapkan untuk analisis campuran asam amino dengan

sukses besar. Karena asam amino memiliki sifat yang sangat mirip, dan asam-asam

amino larut dalam air dan tidak mudah menguap (tidak mungkin didistilasi),

pemisahan asam amino adalah masalah paling sukar yang dihadapi kimiawan di akhir

abad 19 dan awal abad 20. Jadi penemuan kromatografi kertas merupakan berita

sangat baik bagi mereka.

Kimiawan Inggris Richard Laurence Millington Synge (1914-1994) adalah

orang pertama yang menggunakan metoda analisis asam amino dengan kromatografi

kertas. Saat campuran asam amino menaiki lembaran kertas secara vertikal karena

ada fenomena kapiler, partisi asam amino antara fasa mobil dan fasa diam (air) yang

teradsorbsi pada selulosa berlangsung berulang-ulang. Ketiak pelarut mencapai ujung

atas kertas proses dihentikan. Setiap asam amino bergerak dari titik awal sepanjang

jarak tertentu. Dari nilai R, masing-masing asam amino diidentifikasi.

Kromatografi kertas dua-dimensi (2D) menggunakan kertas yang luas bukan

lembaran kecil, dan sampelnya diproses secara dua dimensi dengan dua pelarut.

Gambar Contoh hasil kromatografi kertas pigmen

42

4. Kromatografi Kolom

Kromatografi kolom adalah teknik pemisahan dimana fase diam berada dalam

tabung berupa cairan. Partikel dari fase diam padat atau dilapisi pendukung dengan

fase diam cair dapat mengisi semua volum dari tabung (packed volumn) atau

terkonsentrasi sepanjang dinding tabung meninggalkan bekas yang terbatas dari fase

gerak pada bagian tengah tabung. Teknik ini dilakukan berdasarkan perbedaan

kecepatan gerak senyawa melewati medium (fase diam).

Kromatografi ini dilakukan untuk memisahkan atau menganalisa senyawa dari

fraksi yang telah dipisahkan dari tumbuhan, dimana senyawa tersebut bersifat

nonvolatil dalam jumlah lebih besar.

5. Kromatografi Cair Vakum

Kromatografi Cair Vakum (KCV) biasa disebut juga sebagai “fast

chromatography”. KCV adalah Kromatografi kolom yang dipercepat dengan

penggunaan vakum/penyedot. Efek dari vakum atau pompa ini akan mengurangi

tekanan dan meningkatkan kecepatan alir dari pelarut. Kromatografi ini dilakukan

43

berdasarkan perbedaan kemampuan migrasi diferensial senyawa melewati fase diam.

Di dalam kolom karena perbedaan kemampuan partisi dan kelarutan senyawa

menyebabkan pemisahan melewati fase diam berupa pita-pita kemudian keluar

meninggalkan kolom dan ditampung kemudian dideteksi. KCV biasa digunakan

untuk pengisolasian/pemurnian senyawa, analisis kualitatif dan kuantitatif senyawa,

dan cocok untuk senyawa nonvolatil.

6. HPLC (HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY)

Liquid chromatography atau LC atau kromatografi cair merupakan teknik

pemisahan yang meliputi penempatan (injeksi) volume kecil dari sampel cair (liquid)

ke dalam sebuah tabung dengan partikel yang terserap (fase diam) di mana komponen

individual dari sampel bergerak sepanjang tabung (kolom) yang terisi oleh cairan

dengan gaya gravitasi.

HPLC meliputi injeksi volume kecil dari sampel cairan (liquid) ke dalam

tabung atau kolom dengan partikel yang kecil (berdiameter 3-5 mikron (µm) disebut

44

juga sebagai fase diam) dimana komponen individual dari sampel bergerak ke bawah

pada kolom dengan cairan/liquid (fase gerak) sekuatnya/dipaksa melewati kolom

dengan tekanan tinggi dari pump (pompa). Komponen yang terpisahkan sedikit demi

sedikit oleh pemenuhan kolom yang meliputi berbagai interaksi kimia dan/atau fisika

antara molekul-molekul tersebut dan partikel packing (yang mengisi tabung).

Komponen yang dipisahkan dideteksi pada lubang keluar dari tabung tersebut

(kolom) oleh detektor yang mengukur jumlahnya. Hasil dari detektor disebut “liquid

chromatogram”. Pada prinsipnya, kerja HPLC hampir sama dengan LC kecuali pada

perbedaan kecepatan, efisiensi, sensitifitas, dan kemudahan dalam penggunaan HPLC

yang lebih unggul daripada LC.

Kegunaan metode ini :

Bagus untuk identifikasi senyawa yang nonvolatil atau senyawa yang tidak

tahan panas

Analisis kualitatif dan kuantitatif senyawa tunggal dalam sampel

Pembuatan komponen murni

Trace analysis

Gambar-gambar dari alat HPLC :

Modular HPLC System –Basic Configuration

45

Modular HPLC System – High-end configuration

Integrated HPLC System “all parts in one box”

46

BAB III

PENUTUP

Simpulan

Kromatografi adalah teknik pemisahan fisik suatu campuran zat-zat kimia yang

berdasar pada perbedaan migrasi dari masing-masing komponen campuran yang

terpisah pada fase diam di bawah pengaruh pergerakan fase gerak. Kromatografi

dapat dibagi menjadi beberapa golongan, yaitu sebagai berikut:

Berdasarkan fase gerak dan fase diamnya

Kromatografi cair-padat, kromatografi gas-padat, kromatografi cair-cair, dan

kromatografi gas-cair

Berdasarkan fase geraknya

Kromatografi gas dan kromatografi cair

Berdasrkan mekanisme pemisahan

Kromatografi adsorpsi, kromatografi partisi, kromatografi penukar ion,

kromatografi saringan gel, kromatografi eksklusi molekular

Berdasarkan jenis pendukungnya

Kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis, KLT preparatif, kromatografi

kolom, dan kromatografi cair-vakum

Berdasrakna arah pengembangannya

Kromatografi horizontal, kromatografi vertikal menaik, kromatografi vertical

menurun, kromatografi sirkular, dan kromatografi dua arah.

47

DAFTAR PUSTAKA

Clark, J. 2007. Kromatografi Gas Cair. Available online at http://www.chem-is-

try.org/materi_kimia/instrumenanalisis/kromatografi1/kromatografi_gas_cair/

Darmstadt. 2012. Kromatografi. Available online at :

http://www.merckmillipore.co.id/chemicals/ion - exchange -chromatogrphy

chromatography/c - bX2b.s1OgRsAAAEsnHJV6TsS

Harwood, Laurance M., Chistoper J. Moody. 1989. Experimental organic chemistry :

Principles and Practice. New York : WilleyBlackwell.

Rahayu, S.S .2009. Available online at http://www.chem-

is - try.org/materi_kimia/kimia- industri/utilitas-pabrik/mengoperasikan-

alat-penukar-ion/

Synder, L.R., J.J. Kirkland, dan J.L. Glajch. 1997. HPLC Method Development. New

York : John Willey & Sons.

Takeuchi,Y. 2009. Available online at http://www.chem-is -try.org/materi

kimia/kimia dasar/ pemurnian material/kromatografi/

Wiryawan, A. 2011. Kromatografi Cair (Liquid Chromatography). Available online

at: http://www.chem-is -try.org/materi kimia/kromatografi cair vakum/

pemurnian material/hldkj28875skilhg2345 y. hhjg org/

48

49