makalah analisis pangan : kromatografi

8/11/2019 makalah analisis pangan : kromatografi

1/27

TUGAS MAKALAH ANALISIS PANGAN

Analisis Kromatografi

Diajukan untuk memenuhi salah satu tugas mata kuliah Analisis Pangan

Disusun oleh :

Kelompok 8

Ratih Siswanina P. 240210120115

Hanni Listia F. 240210120116

Asti Arya N. 240210120117

Mahfud Ainun N. 240210120118

Rosaria Puspasari 240210120119

UNIVERSITAS PADJADJARAN

FAKULTAS TEKNOLOGI INDUSTRI PERTANIAN

JURUSAN TEKNOLOGI INDUSTRI PANGAN

JATINANGOR

2014


2/27

BAB I

PENDAHULUAN

Analisis pangan adalah salah satu subbidang ilmu pangan yang berhubungan

dengan cara-cara atau metode analitik dalam mendeteksi dan menetapkan

komponen-komponen yang terdapat dalam bahan pangan baik segar maupun

olahan. Pengetahuan tentang analisis pangan sangat dibutuhkan oleh ahli ilmu dan

teknologi pangan, terutama untuk menentukan apakah suatu bahan atau produk

pangan mengandung komponen-komponen yang berbahaya atau tidak.

Pengetahuan tentang analisis pangan menjadi lebih penting dengan adanya

perkembangan yang pesat dalam teknologi pangan.Dengan teknologi pangan,

bahan pangan dapat diproses, dimodifikasi, diperbaiki, dan dimanipulasi menjadi

suatu produk yang sifatnya sudah berubah dari aslinya. Dengan analisis pangan

diharapkan setiap perkembangan ini dapat diikuti, sehingga produ-produk yang

dihasilkan tersebut tetap dapat dipantau segi keamanannya bagi konsumen selain

dari segi mutu yang sangat mempengaruhi perdagangannya.

Salah satu metode analisis pangan yang sering digunakan adalah metode

kromatografi. Kromatografi adalah suatu istilah umum yang digunakan untuk

bermacam-macam teknik pemisahan yang didasarkan atas partisi sampel di antara

suatu fase gerak yang bisa berupa gas ataupun cair dan fase diam yang juga bisa

berupa cairan ataupun suatu padatan. Penemu kromatografi adalah Tswett yang

pada tahun 1903, mencoba memisahkan pigmen-pigmen dari daun dengan

menggunakan suatu kolom yang berisi kapur (CaSO4). lstilah kromatografi

diciptakan oleh Tswett untuk melukiskan daerah-daerah yang berwarna yang

bergerak ke bawah kolom. Metode analisis kromatografi memiliki banyakmanfaat, di antaranya yaitu pemisahan campuran, identifikasi, analisis kuantitatif,

dan analisis preparatif.


3/27

BAB II

PRINSIP DAN JENIS-JENIS KROMATOGRAFI

2.1.

Prinsip Kromatografi

Kromatografi adalah teknik untuk memisahkan campuran menjadi

komponennya dengan bantuan perbedaan sifat fisik masing-masing komponen.

Alat yang digunakan terdiri atas kolom yang di dalamnya diisikan fase stasioner

(padatan atau cairan). Campuran ditambahkan ke kolom dari ujung satu dan

campuran akan bergerak dengan bantuan pengemban yang cocok (fase mobile).

Pemisahan dicapai oleh perbedaan laju turun masing-masing komponen dalam

kolom, yang ditentukan oleh kekuatan adsorpsi atau koefisien partisi antara fase

mobil dan fase diam (stationer).

Kromatografi dapat digolongkan berdasarkan pada jenis fase-fase yang

digunakan dalam kromatografi. Fase gerak dapat berupa gas atau cair, dan fase

diam dapat berupa zat padat atau zat cair. Berdasarkan fase bergerak dan fase

diam, terdapat empat macam sistem kromatografi. Yaitu kromatografi gas-cair,

kromatografi gas-padat, kromatografi cair-padat, dan kromatografi cair-cair.

2.2. Jenis-jenis Kromatografi

Kromatografi adalah istilah umum yang diterapkan pada berbagai macam

teknik pemisahan berdasarkan partisi atau distribusi sampel (zat terlarut) antara

fase gerak dengan fase tetap atau stasioner. Interaksi relatif dari zat terlarut

dengan dua fase ini dijelaskan oleh koefisien partisi (K) atau distribusi (D), yaitu

rasio konsentrasi zat terlarut dalam fase diam untuk konsentrasi zat terlarut dalam

fase gerak. Fase gerak dapat berupa gas (GC) atau cairan (LC) atau fluidasuperkritis. Fase diam dapat berupa cair atau biasanya berupa padat. Kromatografi

dapat dibagi dalam beberapa cara yang berbeda, sesuai dengan prinsip-prinsip

fisika yang terlibat dalam pemisahan atau sesuai dengan berbagai teknik yang

diterapkan. Tabel berikut meringkas beberapa prosedur kromatografi atau metode

yang telah dikembangkan atas dasar kombinasi fase gerak-stasioner yang berbeda.

Sejauh sifat interaksi antara molekul zat terlarut dan fase gerak atau stasioner

berbeda, metode ini memiliki kemampuan untuk memisahkan berbagai jenis


4/27

molekul.

Tabel 1. Karakteristik Metode Kromatografi

MetodeFase Gerak/Fase

StasionerRetensi bervariasi dengan

Gas-liquid

chromatographyGas/cairan Ukuran molekul/polaritas

Gas-solid

chromatographyGas/padat Ukuran molekul/polaritas

Supercritical fluid

chromatographyFluida superkritis/padat Ukuran molekul/polaritas

Reversed-phase

chromatography

Cairan polar/cairan atau

padatan nonpolarUkuran molekul/polaritas

Normal-phase

chromatography

Cairan kurang

polar/cairan atau padat

yang lebih polar

Ukuran molekul/polaritas

Ion-exchange

chromatographyCairan polar/padat ionik Pertukaran molekul

Size-exclusion

chromatographyCairan/padatan Ukuran molekul

Hydrophobic-interaction

chromatography

Cairan polar/cairan atau

padatan nonpolarUkuran molekul/polaritas

Affinity chromatography Air/binding sites Struktur spesifik(Sumber : Nielsen, 2003)

Berdasarkan prinsip pemisahannya, terdapat lima macam kromatografi

antara lain sebagai berikut.

1. Kromatografi Adsorpsi (Adsorption Chromatography)

Fase diam pada kromatografi ini berupa padatan yang telah dihaluskan

(untuk memaksimalkan luas permukaan) dan fase gerak dapat berupa gas atau

cairan. Fase diam (adsorben) dipilih untuk memungkinkan interaksi diferensial

dengan komponen sampel yang akan dianalisis. Gaya yang terjadi antarmolekul

pada kromatografi adsorpsi ini meliputi gaya Van der Waals, gaya elektrostatik,

ikatan hidrogen, dan interaksi hidrofobik. Urutan elusi senyawa dari fase-fase

stasioner dapat diprediksi berdasarkan polaritas relatifnya. Senyawa polar yang

paling kuat pada adsorben polar akan dielusi terakhir. Zat terlarut nonpolar yang

kurang baik akan dielusi pertama. Kromatografi adsorpsi digunakan untuk

memisahkan senyawa nonpolar aromatik atau alifatik, seperti lipid, terutama

sesuai dengan jenis dan jumlahnya. Kromatografi adsorpsi juga telah digunakan

untuk analisis vitamin yang larut dalam lemak. Kromatografi ini sering digunakan

untuk menghilangkan kotoran dari sampel sebelum analisis lainnya. Misalnya


5/27

digunakan untuk analisis makanan, seperti lipid dalam minyak kedelai, karotenoid

dalam buah jeruk, dan vitamin E pada biji.

2.

Kromatografi Partisi (Partition Chromatography)

Prinsip kromatografi partisi dapat dijelaskan dengan hukum partisi yang

dapat diterapkan pada sistem multi komponen yang telah dibahas di bagian

sebelumnya. Dalam kromatografi partisi ekstraksi terjadi berulang-ulang dalam

satu proses. Dalam percobaan zat terlarut didistribusikan antara fase stasioner dan

fase mobile. Fase stasioner dalam banyak kasus pelarut diabsorpsikan pada

adsorben dan fase mobile adalah molekul pelarut yang mengisi ruang antara

partikel yang teradsorbsi. Contoh kromatografi partisi adalah kromatografi kolom,

yang digunakan luas karena sangat efisien untuk pemisahan senyawa organik.

3. Kromatografi Pertukaran Ion (Ion-Exchange Chromatography)

Kromatografi pertukaran ion-ion (ion exchange chromatography) biasanya

digunakan untuk penurunan materi biologis, seperti asam amino, peptida, dan

protein. Metode ini dapat dilakukan dalam kolom maupun ruang datar (planar).

Terdapat dua tipe penukaran ion yaitu penukaran kation (cation exchange) dan

pertukaran anion (anion exchange). Pada pertukaran kation, fase stasioner

bermuatan negatif. Sedangkan pada fase anion, fase stasioner bermuatan positif.

Molekul bermuatan yang berada pada fase cair akan melewati kolom diperlukan

penambahan larutan dengan pH dan kekuatan ionik tertentu. Pemisahan dengan

menggunakan metode ini sangat selektif dan biasa digunakan pada awal proses

keseluruhan karena biaya untuk menjalankan metode ini murah serta kapasitasnya

tinggi.

4. Size-Exclusion Chromatography (SEC)

SEC juga dikenal sebagai kromatografi gel permeasi (GPC) dankromatografi gel filtrasi (GFC), merupakan metode yang paling mudah untuk

dilakukan dan dipahami. Hal ini banyak digunakan dalam ilmu biologi untuk

resolusi makromolekul, seperti protein dan karbohidrat, dan juga digunakan untuk

fraksinasi dan karakterisasi polimer sintetis. Dalam sistem SEC ideal, molekul

dipisahkan hanya berdasarkan ukurannya, yaitu tidak ada interaksi yang terjadi

antara zat terlarut dan fase diam. Fase diam di SEC terdiri dari bahan kemasan

kolom yang berisi pori-pori sebanding dalam ukuran molekul yang akan


6/27

difraksinasi. SEC dapat digunakan untuk fraksinasi campuran secara langsung

atau untuk memperoleh informasi tentang zat terlarut secara tidak langsung.

5.

KromatografiAfinitas (Affinity Chromatography)

Kromatografi afinitas adalah pemisahan yang didasarkan pada interaksi

spesifik dan reversibel antara molekul zat terlarut dan ligan bergerak pada fase

diam kromatografi. Kromatografi afinitas biasanya melibatkan bahan biologis tak

bergerak sebagai fase diam. Ligan yang selektif dan reversibel akan mengikat

molekul analit dalam sampel. Pemisahan memanfaatkan sistem lock and key

dalam pemisahan molekul. Prinsip-prinsip kromatografi afinitas adalah ligan

dipilih karena spesifik dan kekuatan interaksi antara dirinya dan molekul terisolasi

(analit) yang bergerak pada bahan pendukung yang sesuai. Sebagai sampel

dilewatkan melalui kolom, molekul yang saling melengkapi ligan terikat diserap

sementara komponen sampel lainnya dielusi. Ikatan dengan analit selanjutnya

dielusi melalui perubahan komposisi fase gerak .

Sedangkan berdasarkan teknik yang diterapkan, kromatografi terbagi

menjadi empat macam, antara lain sebagai berikut.

1. Kromatografi Kertas

Kromatografi kertas diperkenalkan pada tahun 1944. Meskipun adsorpsi

dengan kertas itu sendiri telah digunakan, kertas umumnya hanya berfungsi

sebagai pendukung untuk fase diam cair (kromatografi partisi). Fase diam dalam

kromatografi partisi kertas biasanya air. Namun, kertas tersebut dapat diresapi

oleh pelarut organik nonpolar dan dilanjutkan dengan pelarut polar atau air

(kromatografi kertas fase terbalik). Untuk melaksanakan teknik ini, sampel yang

telah dilarutkan diteteskan satu setengah inci atau lebih dari tepi strip kertas filter

(biasanya selulosa) dan dibiarkan kering. Strip kemudian disuspensikan dalamwadah tertutup, dalam suasana yang jenuh oleh pelarut (fase gerak). Sampel

ditempatkan dalam kontak dengan pelarut, yang kemudian pelarut akan bergerak

naik atau turun pada kertas akibat gaya kapiler, memisahkan komponen sampel

selama proses berlangsung.

2. Kromatografi Layar Tipis (TLC)

TLC, pertama kali dijelaskan pada tahun 1938, telah menggantikan

kromatografi kertas karena lebih cepat, lebih sensitif, dan lebih direproduktif.


7/27

Resolusi di TLC lebih besar daripada kromatografi kertas karena partikel di piring

yang lebih kecil dan lebih teratur dari serat kertas. TLC diterapkan di berbagai

bidang, termasuk lingkungan, klinis, forensik, farmasi, makanan, rasa, dan

kosmetik. Dalam industri makanan, TLC dapat digunakan untuk pengendalian

kualitas. Misalnya, jagung dan kacang tanah yang diuji untuk aflatoksin atau

mikotoksin sebelum dilakukan pengolahan menjadi tepung jagung dan selai

kacang.

3. Kromatografi Kolom Cairan (Column Liquid Chromatography)

Kromatografi kolom adalah metode yang paling berguna untuk memisahkan

senyawa dalam campuran. Fraksinasi zat terlarut terjadi sebagai akibat dari

migrasi diferensial melalui tabung tertutup dari fase diam, dan analit dapat

dipantau sementara pemisahan sedang berlangsung.

4. Supercritical Fluid Chromatography(SFC)

Sebuah fluida superkritis adalah suatu fluida yang berada di atas kedua

tekanan kritis dan temperatur kritis (kombinasi dari mereka dikenal sebagai titik

kritis). SFC menawarkan berbagai penyesuaian selektivitas karena k'dan dapat

diubah oleh perubahan komposisi fase gerak dan fase diam. Selain itu, SFC

memungkinkan pemisahan nonvolatil, senyawa termal labil yang tidak dapat

dilakukan pada GC. SFC telah digunakan terutama untuk senyawa nonpolar.

Lemak, minyak, dan lipid lainnya adalah senyawa yang dipisahkan menggunakan

SFC.


8/27

BAB III

HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

HPLC (High Performance Liquid Chromatography) atau disebut sebagai

Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) adalah sebuah instrumen yang

menggunakan prinsip kromatografi (pemisahan) dengan menggunakan fase gerak

cair yang dialirkan melalui kolom yang merupakan fase diam menuju ke detektor

dengan bantuan pompa. Sampel dimasukkan ke dalam aliran fase gerak dengan

cara penyuntikan. Prinsip dasar metode HPLC adalah memisahkan setiap

komponen dalam sampel yang selanjutnya akan diidentifikasi (kualitatif) dan

dihitung konsentrasi dari masing-masing komponen (kuantitatif).

HPLC merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik

untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. HPLC berbeda dengan kromatografi

lainnya karena pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fase

gerak. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya dan kecepatannya

untuk sampai ke detektor, sehingga waktu retensinya yang didapat akan berbeda,

hal ini akan teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya terpisah. Berikut

merupakan diagram alir dari HPLC.

Gambar 1. Diagram Alir HPLC

(Sumber : chem-is-try.org)

Komponen-komponen yang digunakan dalam metode HPLC adalah sebagai

berikut.

1.

Pompa

Pompa yang digunakan adalah kinerja konstan (constant pressure) dan

pemindahan konstan (constant displacement). Pemindahan konstan dapat


9/27

dibagi lagi menjadi dua jenis, yaitu pompa reciprocatingdan pompasyringe.

Pompa reciprocating menghasilkan suatu aliran yang berdenyut teratur

(pulsating), oleh karena itu membutuhkan peredam pulsa atau peredam

elektronik untuk menghasilkan garis dasar (base line) detektor yang stabil,

bila detektor sensitif terhadapan aliran. Keuntungan utama dari pompa ini

adalah ukuran reservoir tidak terbatas. Pompa syringe memberikan aliran

yang tidak berdenyut, tetapi ukuran reservoir terbatas. Pompa yang ideal

digunakan memiliki syarat-syarat tertentu, yaitu mampu membangkitkan

tekanan tinggi, control laju alir yang akurat, tahan korosi, terbuat dari bahan

yang tahan terhadap fase gerak, dapat menyalurkan fase gerak pada rentang

kecepatan dan tekanan lebar, dapat bekerja pada tekanan sampai 6000 psi

(400 atm).

2. Injektor

Injektor merupakan tempat untuk memasukkkan sempel ke kolom.

Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju

detektor disebut sebagai waktu retensi. Waktu retensi diukur berdasarkan

waktu di mana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian

puncak yang maksimum dari senyawa itu. Ada tiga tipe dasar injektor yang

dapat digunakan, yaitu :

a. Stop-Flow : Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir,

sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan

karena difusi di dalam cairan kecil clan resolusi tidak dipengaruhi

b. Septum : Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60 -70

atmosfir, tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut

Kromatografi Cair. Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibatjarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.

c. Loop Valve : Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi

volume lebih besar dari 10 dan dilakukan dengan cara automatis

(dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil

dapat diinjeksifan secara manual). Pada posisi LOAD, sampel diisi

kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila VALVE difungsikan, maka

sampel akan masuk ke dalam kolom.


10/27

3. Kolom (column)

Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom KCKT dapat

digunakan kembali (reusable). Kolom diisi dengan partikel padatan yang

berukuran kecil dilapisi secara kimia oleh suatu cairan yang berfungsi sebagai

fase diam. Komponen-komponen sampel dibawa oleh cairan fase gerak yang

dialirkan dengan bantuan tekanan tinggi melewati kolom fase diam.

Komponen-komponen dipisahkan berdasarkan partisi antara fase diam dan

fase gerak yang satu sama lain tidak bercampur.

Efisiensi kolom sangat tegantung dari besarnya partikel fase stasioner,

bila ukuran fase stasioner lebih kecil, maka tinggi plat teoritik akan

berkurang, sehingga jumlah plat teoritik akan bertambah, yang meningkatkan

efisiensi kolom. Kolom yang pendek dan efisiensi, yang tinggi pemisahan

akan berjalan dengan cepat. Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok :

a. Kolom analitik : Diameter dalam 2-6 mm. Panjang kolom tergantung

pada jenis material pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular, panjang

yang digunakan adalah 50-100 cm. Untuk kemasan poros

mikropartikulat, 10-30 cm. Dewasa ini ada yang berukuran 5 cm.

b.

Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar

dan panjang kolom 25 -100 cm.

Kolom umumnya dibuat dari stainless steel dan biasanya dioperasikan

pada temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi,

terutama untuk kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi.

4. Detektor (detector)

Detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di

dalam kolom (analisis kualitatif) dan menghitung kadarnya (analisiskuantitatif). Detektor yang bagus memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan

(noise) yang rendah, kisar respons linier yang luas, dan memberi respons

untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan yang rendah terhadap aliran dan

fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh.

Detektor HPLC yang umum digunakan adalah detektor UV 254 nm.

Variabel panjang gelombang dapat digunakan untuk mendeteksi banyak

senyawa dengan range yang lebih luas. Detektor indeks refraksi juga


11/27


12/27

ada kontaminan), tidak bereaksi dengan wadah, sesuai dengan detektor, dapat

melarutkan sampel, memiliki viskositas rendah, memudahkan sample

recovery, harganya murah.

HPLC merupakan salah satu jenis dari kromatografi cair yang menggunakan

prinsip kromatografi (pemisahan) dengan menggunakan fase gerak cair yang

dialirkan melalui kolom yang merupakan fase diam menuju ke detektor dengan

bantuan pompa, sedangkan pada kromatografi cair lain tidak digunakan pompa.

Keunggulan HPLC adalah :

a.

HPLC dilengkapi dengan adanya pompa. Pompa ini menghasilkan tekanan

sekitar 400 atm untuk mengalirkan eluen dengan tekanan tinggi dan konstan

sehingga memperingan kerja kolom dan juga pemisahan sehingga waktu

lebih sedikit. Pada pompa dikenal dua sistem dalam teknik pemisahan yaitu

isokratik dan gradient, namun gradient lebih bersifat akurat karena masing-

masing pompa mengatur laju alir larutan yang berbeda.

b.

HPLC memiliki keunggulan kolom, di mana kolom HPLC ini lebih pendek

dan lebih kecil dibanding GC misalnya. Diameter untuk internal kolom

HPLC 4.6 mm sehingga dapat memberikan permukaan kontak yang lebih

luas diman mempengaruhi sempurnanya pemisahan yang semakin baik. Dan

panjang kolom HPLC adalah 150-250 mm. dan yang perlu diingat adalah

kolom HPLC dapat digunakan kembali dengan cara direnerasi dengan

mencucinya hingga bersih dengan pelarut yang sesuai.

c. HPLC mempunyai detektor yang amat sangat sensitif dan peka. HPLC

memiliki beberapa detector misalnya: Detektor ultraviolet, detektor

fluorometrik, dan detektor elektrokimia.

d.

Waktu retensi, waktu yang dibutuhkan senyawa untuk melalui kolom hinggake detektor disebut waktu retensi yang diukur berdasarkan waktu dimana

sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang

maksimum dari senyawa itu. Biasanya dipengaruhi oleh : tekanan yang

digunakan, kondisi dari fase diam, komposisi pelarut yang tepat, dan

temperatur kolom.

e. Kromatogram, kromatogram menunjukkan hasil yang didapat. Kromatogram

yang diinginkan adalah kromatogram yang lurus tinggi dengan lebar sekecil


13/27

mungkin. Bukan dengan bentuk lainnya, karena bentuk tersebut menandakan

pemisahan dilakukan dengan sangat baik. Namun dalam kromatogram kita

menemukan beberapa puncak kecil atau yang mengganggu dan disebut denga

noise. Noise muncul jika sampel ataupun pelarut yang digunakan belum

belum murni dari pengotor-pengotor yang mungkin tidak sengaja masuk ke

dalamnya.

HPLC digunakan untuk untuk penentuan kualitatif dan penentuan

kuantitatif. Pada penentuan kualitatif, HPLC digunakan untuk analisa kualitatif

didasarkan pada waktu retensi untuk identifikasi. Identifikasi dapat diandalkan

apabila waktu retensi sampel dibandingkan dengan larutan standar. Beberapa

aplikasi HPLC dalam kehidupan adalah sebagai berikut.

1. HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi

dan pestisida.

2. Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar

dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.

3. Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang

dikombinasikan dengan kolom butiran berlapis zat berpori.

4.

Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-

SAX.

5. Dapat memisahkan vitamin-vitamin yang larut dalam air.

6. Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah

biokimia.

7. Analisis Anion Nitrat (NO3-)

Kandungan nitrat dalam jumlah tertentu akan sangat mempengaruhi

kualitas air. Dengan menggunakan HPLC sebagai instrumen analisis dandengan pengembangan metode dapat diketahui validitas penggunaan HPLC

untuk analisis anion nitrat.

8. Analisis Vitamin C

Metode HPLC juga dapat digunakan sebagai dasar dari analisis vitamin

C, yakni dalam menentukan susunan kimianya.

9. Analisis Ekstrak Etanol Rimpang TanamanZingiberaceae

Banyaknya komponen kandungan dalam rimpang dengan berbagai


14/27

polaritas menuntut penggunaan metoda analisis kromatografi instrumental

HPLC dengan selektifitas (resolusi) yang tinggi untuk komponen yang

termolabil. Untuk mendapatkan metoda HPLC dengan resolusi tinggi

dibutuhkan cara eluasi gradient, dengan program menurun polaritasnya, yaitu

mulai dari 10% metanol sampai metanol 100% dan pada umumnya

ditambahkan asam fosfat sebagai cara untuk menekan ionisasi senyawa

metabolit sekunder tanaman yang umumnya bersifat asam, seperti prinsip

pasangan ion.

10.

Pengukuran Tingkat Kematangan Buah Manggis

Bila ingin menentukan mutu bagian dalam buah harus digunakan cara

kimia basah (HPLC) yang bersifat merusak. Dalam menanggulangi masalah

ini perlu dilakukan suatu penelitian mengenai teknologi tertentu yang dapat

dimanfaatkan untuk menentukan mutu bagian dalam buah-buahan secara

tidak merusak.

11.

Pendugaan Kandungan Senyawa Bioaktif Atau Senyawa Penciri Beberapa

Tanaman Obat

Secara kualitatif dan kuantitatif suatu senyawa aktif dapat diketahui

antara lain melalui metode HPLC dan FTIR (Fourier Transfrorm Infrared).

Penentuan kandungan senyawa aktif dilakukan melalui proses penghancuran

bahan, pelarutan, dan pengukuran dengan HPLC dan FTIR. Proses ini

memerlukan waktu dan biaya yang relatif mahal. Untuk itu sangat diperlukan

metode yang handal tetapi relatif mudah untuk dioperasikan. Alternatif cara

penentuan lain yang menyatakan hubungan antara kandungan senyawa aktif

atau penciri hasil pengukuran HPLC dengan data hasil pengukuran FTIR

(absorban).


15/27

BAB IV

GAS CHROMATOGRAPHY (GC)

GC (gas chromatography) merupakan jenis kromatografi yang digunakan

dalam kimia organik untuk pemisahan dan analisis dengan menggunakan

gas sebagai fase penggerak. Kromatografi gas dapat digunakan untuk

mengidentifikasi komponen-komponen hasil pemisahan dan mengukur

konsentrasinya berdasarkan afinitas selektif komponen terhadap baha adsorben

(Agilent Technologies, 2002). Sampel yang akan dianalisis dimasukkan dalam

bentuk cair atau gas dengan jarum suntik ke dalam port injeksi kromatografi gas.

Sampel tersebut akan menguap pada suhu yang telah diatur kemudian melewati

kolom yang berisi fase diam dengan bantuan fase gerak yang mengalir terus dan

dipisahkan. Senyawa yang kurang larut dalam fasa diam akan keluar lebih dahulu.

Hasil pemisahan akan terdeteksi oleh detektor dan divisualisasikan ke komputer

dalam bentukpeak.

Kromatografi gas pada prinsipnya sama dengan kromatografi lainnya, tetapi

memiliki beberapa perbedaan misalnya pada proses pemisahan menggunakan

kromatografi gas, fase stasionernya berupa cairan dan fase geraknya berupa gas.

Sedangkan pada kromatografi lain seperti kromatografi kolom, fase stasioner dan

fase gerak berupa cairan. Selain itu, pada kromatografi gas temperatur gas yang

digunakan dapat diatur sedangkan pada kromatografi kolom tidak memiliki

kontrol suhu. Kromatografi gas juga hampir sama dengan proses pemisahan

secara destilasi, karena keduanya memisahkan komponen dari campuran

berdasarkan titik didih. Hanya saja pemisahan secara destilasi biasanya digunakan

untuk memisahkan campuran pada skala besar, sedangkan kromatografi gas dapatdigunakan pada skala yang kecil.

Bagian-bagian penting dari kromatografi gas meliputi: sumber gas sebagai

fase gerak, inlet untuk memasukkan sampel ke kolom, kolom di mana terjadi

pemisahan, oven yang dilengkapi termostat untuk kolom, detektor untuk

mendeteksi bahan kimia di kolom, dan sistem data untuk merekam dan

menampilkan kromatogram. Selain itu, beberapa fasilitas diperlukan agar suhu

dari berbagai komponen dapat diketahui secara akurat dan dikendalikan (Eiceman,


16/27

2006). Berikut ini merupakan diagram alir dari kromatografi gas.

Gambar 2. Diagram Alir Kromatografi Gas

(Sumber : Agilent Technologies)

Komponen-komponen yang digunakan dalam metode GC adalah sebagai

berikut.

1. Gas supplies /Gas source

Fase gerak yang berupa gas pembawa dipasok dari tanki melalui

pengaturan pengurangan tekanan. Kemudian membawa sampel langsung ke

dalam kolom. Jika hal ini terjadi, sampel tidak menyebar sebelum proses

pemisahan. Cara ini cocok untuk sampel yang mudah menyerap. Gas

pembawa yang digunakan harus bersifat inert dan harus sangat murni.

Seringkali gas pembawa ini harus disaring untuk menahan debu, uap air, dan

oksigen. Adanya kontaminan dapat bereaksi dengan sampel atau kolom dan

menghasilkan kromatogram palsu. Gas yang sering digunakan adalah N2, H2,

He, dan Ar.

Gambar 3. Gas Source


Pemilihan gas pembawa sangat penting untuk diperhatikan. Gas yang

paling umum digunakan adalah hidrogen dan helium. Hidrogen digunakan

karena efisien dan memberikan pemisahan terbaik. Sedangkan helium

memiliki laju aliran dengan kisaran yang lebih besar, tidak mudah terbakar,


17/27

dan bekerja dengan lebih banyak detektor.

2. Sistem Injeksi Sampel (Inlet)

Inlet akan memasukkan sampel yang ke dalam kolom bersama dengan

fase gerak, yaitu gas pembawa. Sampel yang akan dianalisis harus berupa

cairan dan mudah menguap agar dapat dianalisis oleh kromatografi gas. Inlet

yang paling umum digunakan adalah port injeksi (injection ports) dan katup

pengambilan sampel (sampling valves).

a. Injection ports

Digunakan untuk menginjeksi sampel berupa gas atau cairan. Untuk

sampel cair, harus dipanaskan untuk menguapkan sampel. Desain dan

pemilihan port injeksi tergantung pada jenis dan diameter kolom. Jarum

suntik yang digunakan untuk memasukkan sampel akan menginjeksikan

melalui septum ke dalam aliran gas pembawa (fase gerak).

Gambar 4. Injection Port


b.

Sampling valves

Sampel dialirkan keluar dari sebuah loopke dalam aliran gas pembawa.

Katup pengambilan sampel yang digunakan untuk sampel cair berbeda

dengan sampel gas/uap, karena biasanya volume sampel berbeda.

Gambar 5. Katup Pengambilan Sampel



18/27

Pemasukkan sampel ke dalam kolom dapat dilakukan dengan cara

diinjeksi langsung (direct injection) maupun dengan cara diinjeksi tidak

langsung (indirect injection). Injeksi sampel secara langsung dilakukan

dengan memasukkan sampel ke dalam kolom tanpa terjadi kontak dengan

bagian-bagian lain dari kolom. Sedangkan injeksi sampel secara tidak

langsung dilakukan dengan memasukkan sampel ke dalam evaporator

kemudian uapnya ditransfer ke dalam kolom. Pada cara ini, diperlukan

pengaturan suhu.

3.

Kolom

Pemisahan campuran menjadi komponen-komponen kecil terjadi di

dalam kolom. Sebagian besar pemisahan campuran sangat bergantung pada

suhu, sehingga kolom ditempatkan di dalam oven yang terkendali dengan

baik. Pemilihan jenis kolom tergantung pada sifat campuran dan jenis

informasi yang diinginkan. Namun, semua kolom berfungsi menggunakan

mekanisme dasar yang sama. Ada dua jenis kolom yang digunakan dalam

kromatografi gas, yaitupacked columnsdan capillary columns.

a. Packed columns

Packed columns memiliki panjang 1,5-10 m dan memiliki diameter

dalam 2-4 mm. Kolom ini biasanya terbuat dari stainless steelatau kaca.

Di dalamnya berisi tabung-tabung kecil yang berbahan inert dan dilapisi

oleh fase stasioner. Tabung-tabung tersebut biasanya terbuat dari logam,

kaca, atau plastik. Packed column ini memiliki kapasitas sampel yang

tinggi dan paling banyak digunakan untuk sampel gas.

Gambar 6. Packed columns


b.

Capillary columns


19/27

Capillary columnsberupa tabung terbuka dengan fase stasioner melapisi

permukaan bagian dalamnya. Kolom ini memiliki diameter dalam yang

sangat kecil, berkisar antara 0,1-0,5 mm dan memiliki panjang antara 25-

60 m. Capillary columns menghasilkan peak yang sangat sempit

sehingga memungkinkan pemisahan campuran yang sangat kompleks.

Gambar 7. Capillary columns


4.

DetektorAliran gas pembawa yang berisi komponen hasil pemisahan melewati

detektor. Detektor berfungsi untuk memonitor gas pembawa yang keluar dari

kolom dan merespon perubahan komposisi yang terelusi. Detektor akan

menghasilkan sinyal listrik yang stabil (baseline) ketika tidak ada komponen

yang terdeteksi dan menghasilkan sinyal yang berbeda ketika suatu

komponen hasil pemisahan melalui detektor. Hasil pemisahan yang dideteksi

oleh detektor akan muncul pada layar dalam bentuk kromatogram. Detektor

yang paling umum digunakan dalam kromatografi gas adalahflame ionization

detector(FID) dan thermal conductivity detector(TCD).

5. Recorder

Hasil pemisahan yang dideteksi oleh detektor akan muncul pada layar

dalam bentuk grafikpeak. Fungsi recordersebagai alat untuk mencetak hasil

percobaan pada sebuah kertas yang hasilnya disebut kromatogram (kumpulan

puncak grafik).

Kromatografi gas sangat baik untuk analisis senyawa organik yang mudah

menguap seperti hidrokarbon dan ester. Efisiensi pemisahan ditentukan dengan

besarnya interaksi antara sampel dan cairannya. Beberapa aplikasi kromatografi

gas dalam kehidupan sehari-hari adalah sebagai berikut.

1. Penentuan secara kualitatif maupun kuantitatif senyawa dalam protein yang

telah dimurnikan untuk keperluan biofarmasi.

2.

Pemisahan molekul-molekul penting seperti asam nukleat, karbohidrat,

lemak, dan vitamin.


20/27

3. Mengetahui konsentrasi sianida dari sampel ar liur perokok berat.

4. Mendeteksi suatu penyakit dalam tubuh manusia melalui air kencing, darah,

dan fluida badan lainnya.

5.

Mendeteksi senyawa oksalat dalam air kencing pada pasien batu ginjal.

6. Menganalisis bahan-bahan kimia yang terkandung dalam bahan peledak,

seperti 2,4,6-trinitrotoluene (TNT), siklonit (RDX), tetril, pentaeritritol

tetranitrat (PETN), dan tetritol serta beberapa anion lain seperti perklorat,

klorat, klorida, nitrat, nitrit, sulfat, dan tiosianat.

7.

Berperan penting dalam environmental analysis, misalnya analisis kualitas air

dengan mengetahui jenis dan jumlah anion dan kation yang terkandung dalam

sampel air.

8. Mengetahui kandungan ion sulfat (SO42-) dan nitrogen trioksida (NO3-) yang

terdapat dalam air hujan untuk antisipasi dini terhadap hujan asam.


21/27

BAB V

REVIEW JURNAL ANALISIS KROMATOGRAFI

Jurnal yang di-reviewberjudul Penentuan Kadar Glukosa dan Fruktosa

pada Madu Randu dan Madu Kelengkeng dengan Metode Kromatografi Cair

Kinerja Tinggi. Madu randu memiliki ciri rasanya manis, legit, dan agak gurih.

Sedangkan madu lengkeng berciri rasanya manis, legit, dan berarorma tajam.

Jenis gula pereduksi dalam madu adalah glukosa, fruktosa, maltosa, dan dekstrin.

Proses produksi madu oleh lebah kompleks, sehingga ada kemungkinan besar

terjadi perbedaan kadar dan komposisi gula pereduksi dalam madu yang beredar

di masyarakat.

Madu mengandung glukosa dan fruktosa. Glukosa berfungsi untuk

memperlancar kerja jantung dan meringankan gangguan penyakit hati (liver).

Glukosa diubah menjadi glikogen untuk membantu kerja hati dalam menyaring

racun dalam tubuh. Glukosa merupakan sumber energi bagi seluruh jaringan otot.

Fruktosa disimpan sebagai cadangan dalam hati untuk digunakan bila tubuh

membutuhkan dan juga untuk mengurangi kerusakan hati. Fruktosa dapat

dikonsumsi oleh penderita diabetes karena transportasinya ke sel-sel tubuh tidak

membutuhkan insulin (tidak mempengaruhi keluarnya insulin).

Metode yang digunakan dalam penentuan kadar glukosa dan fruktosa adalah

metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT). Keuntungan metode ini

adalah dapat digunakan pada senyawa dengan bobot molekul besar dan dapat

dipakai untuk senyawa yang tidak tahan panas. Pertimbangan menggunakan

metode ini adalah pemilihan detektor, kolom, pemilihan eluen, laju alir eluen, dan

suhu kolom. Hal-hal ini dapat mempengaruhi resolusi dari tiap-tiap komponen.Bila dua puncak kromatogram dari dua komponen terpisah sempurna maka

resolusi dua komponen tersebut dapat dikatakan sempurna. Pemisahan masing-

masing komponen oleh KCKT harus dilakukan saat kondisi optimum. Pemisahan

yang baik adalah bila kromatogram masing-masing komponen tidak saling

tumpang tindih. Kondisi pemisahan dapat ditentukan saat pengukuran larutan

standar, eluen yang digunakan adalah air deionisasi pada kolom metakarb 87C

dan dideteksi dengan menggunakan detektor indeks bias.


22/27

Sampel diinjeksikan pada alat kromatografi dan sistem dibuat dengan

kondisi pemidahan terbaik, semua komponen dibiarkan terpisah. Hasil yang

diperoleh dilakukan uji kuantitatif dan uji kualitatif. Uji kualitatif dilakukan

dengan cara mencocokkan waktu retensi dari masing-masing puncak pada

kromatogram sampel dengan waktu retensi senyawa standar. Sedangkan uji

kuantitatif dilakukan dengan cara memplotkan luas area komponen-komponen

yang dianalisis ke dalam persamaan regresi linier. Plot hubungan antara

konsentrasi larutan standar dengan luas puncak dari masing-masing komponen,

hubungan antara konsentrasi dengan luas puncak persamaan regresi liniernya : y=

a+ bx.

Eluen yang digunakan adalah air deionisasi karena murah dan tidak beracun.

Selain itu, sifat kepolaran air deionisasi sesuai dengan karbohidrat dan dengan

eluen tersebut pemisahan glukosa dan gruktosa menghasilkan resolusi yang baik.

Detektor indeks bias digunakan dalam penelitian ini karena detektor tersebut

sesuai untuk pemisahan kompinen-komponen karbohidrat.

Waktu retensi glukosa lebih cepat dibandingkan fruktosa. Hal ini

disebabkan karena adanya interaksi yang lebih kuat antara fruktosa (yang

mengandung gugus keton) dengan fase diam daripada interaksi antara glukosa

(yang mengandung gugus aldehid) dengan fase diam. Semakin mirip sifat

kepolaran antara senyawa yang dipisahkan dengan fase diam maka interaksinya

akan semakin kuat sehingga waktu retensi dari senyawa tersebut akan semakin

lama.

Laju alir dipercepat atau suhu kolom ditingkatkan maka waktu retensi

komponen lebih pendek. Jika terjadi kebalikannnya maka waktu retensi

komponen lebih lama. Hasil penelitian menunjukkan bahwa saat laju alir 1ml/menit dan suhu kolom 80oC diperoleh pemisahan yang baik. Pada kondisi ini

waktu retensi yang diperoleh merupakan yang tercepat dan diperoleh resolusi

terbaik. Resolusi adalah cara untuk menjelaskan bagaimana dua puncak terpisah

satu sama lain. Bila puncak dua kromatogram dari dua senyawa terpisah sempurna

maka dapat dikatakan kedua senyawa tersebut terpisah secara sempurna. Resolusi

antara dua puncak adalah fungsi dari tiga faktor, yaitu retensi, selektifitas, dan

efisiensi kolom. Retensi merupakan lewatnya detektor dari kolom. Selektifitas


23/27

adalah ukuran kemampuan fase diam dalam membedakan dua senyawa. Efisiensi

kolom adalah ukuran luas pita-pita komponen menyebar dalam perjalanannya

sepanjang kolom. Suatu kolom yang lebih efisien akan menghasilkan puncak yang

lebih sempit dari kolom yang kurang efsien, untuk waktu retensi yang sama.

Sistem kromatografi yang digunakan dalam penelitian:

Kolom : Metacarb 87C

Eluen : Air deionisasi

Laju alir : 1 mL/menit

Suhu kolom : 80oC

Detektor : Indeks bias

Saat perlakuan sampel madu dilakukan sentrifugasi yang bertujuan untuk

memisahkan komponen larut air dan tidak larut air. Lapisan atas dari hasil

sentrifugasi disaring dan diambil filtratnya untuk kemudian diinjeksikan ke alat

KCKT.

Diagram Alir Jurnal:

Samp

Sistem dibuat dengan kondisi pemidahan terbaik

Hasi

Uji kuantitaif Uji kualitatif


24/27

Hasil

Mencocokkan waktu retensi dari masing-masing

puncak pada kromatogram sampel dengan waktu retensi

Uji Kuantitatif

Uji Kualitatif

Pola kromatogram sampel menunjukkan bahwa pemisahan glukosa dan

fruktosa dalam sampel madu dapat dilakukan dengan baik. Pola kromatogram

juga menunjukkan adanya komponen-komponen lain berupa sakarida penyusun

madu seperti sukrosa, maltosa, laktosa, dan karbohidrat lainnya. Namun,keberadaan komponen-komponen ini tidak mengganggu identifikasi komponen

utama.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa kadar fruktosa lebih tinggi

dibandingkan kadar glukosa. Kadar glukosa madu kelengkeng lebih tinggi

dibandingkan kadar glukosa madu randu, berdasarkan rata-rata kadar glukosa.

Sedangkan, rata-rata kadar fruktosa madu randu lebih tinggi dibandingkan madu

kelengkeng. Hal ini menunjukkan bahwa madu randu lebih manis dibandingkan

Hasil

Hubungan antara konsentrasi dengan luas

puncak persamaan regresi liniernya:

y = a + bx

Plot hubungan antara konsentrasi larutan standar

dengan luas puncak dari masing-masing komponen


25/27

madu kelengkeng karena fruktosa memiliki rasa manis 2,5 kali dari glukosa.

Kadar gula pereduksi menurut SII minimal 60%, kedua jenis madu sudah

memenuhi kriteria tersebut karena kadar gula pereduksi total pada madu randu

adalah 68,12% dan pada madu kelengkeng adalah 68,12%. Madu palsu kadar gula

pereduksinya kurang dari 60% karena pada madu palsu sering dilakukan

pengenceran atau penambahan komponen lain seperti pemanis buatan, gula pasir,

dan pewarna makanan. Namun, pada beberapa kasus madu palsu kadar total gula

pereduksinya mencapai 60%. Hal ini dapat disebabkan oleh proses penyimpanan

madu yang cukup lama sehingga sukrosa dalam madu terurai menjadi glukosa dan

fruktosa.


26/27

BAB VI

KESIMPULAN

Kesimpulan dari makalah ini adalah sebagai berikut.

Kromatografi adalah teknik pemisahan yang didasarkan atas partisi sampel di

antara suatu fase gerak dengan fase diam dengan bantuan perbedaan sifat fisik

masing-masing komponen.

Kromatografi dapat digolongkan menjadi empat macam sistem kromatografi,

yaitu kromatografi gas-cair, kromatografi gas-padat, kromatografi cair-padat,

dan kromatografi cair-cair.

HPLC adalah instrumen pemisahan dengan menggunakan fase gerak cair

yang dialirkan melalui kolom yang merupakan fase diam menuju ke detektor

dengan bantuan pompa.

Komponen-komponen yang digunakan dalam metode HPLC adalah pompa,

injektor, kolom, detektor, tendon (reservoir), elusi gradien, recorder, dan fase

gerak.

GC merupakan jenis kromatografi yang digunakan untuk pemisahan dan

analisis dengan menggunakan gas sebagai fase penggerak.

Pada kromatografi gas, fase stasionernya berupa cairan dan fase geraknya

berupa gas serta temperatur gas yang digunakan dapat diatur.

Komponen-komponen yang digunakan dalam metode GC adalah gas

supplies, sistem injeksi sampel (inlet), kolom, detektor,recorder

Pemisahan dan analisis kadar glukosa dan fruktosa pada madu randu dan

madu kelengkeng dapat dilakukan menggunakan teknik kromatografi cair

kinerja tinggi.

Kadar glukosa pada madu kelengkeng lebih besar daripada madu randu.

Kadar fruktosa pada madu randu lebih besar daripada madu kelengkeng.

Kadar glukosa dan fruktosa dari kedua jenis madu memenuhi syarat mutu

madu nasional (SII).


27/27

DAFTAR PUSTAKA

Agilent Technologies. 2002. Agilent Gas Chromatographs : Fundamentals of Gas

Chromatography. Agilent Technologies, Inc. : USA

Andarwulan, N., Feri K., dan Dian H. 2011. Analisis Pangan. PT. Dian Rakyat :

Jakarta

Eicemen, G.A. 2006. Instrumentation of Gas Chromatography. New Mexico State

University : USA

Khopkar, S.M. 2003. Konsep Dasar Kimia Analitik, Jakarta : UI Press

Marra, Tine. 2004. Sains Kimia. Jakarta : Bumi Aksara

Nielsen, S.S. 2003. Food Analysis Third Edition. Kluwer Academic / PlenumPublishers : New York

Sastrohamidjojo, H. 1985. Kromotografi. Yogyakarta : Liberty.

makalah analisis pangan : kromatografi

Documents

Transcript of makalah analisis pangan : kromatografi