1. CARA KERING

@ Kolom diisi adsorben kering kemudian dialiri pe-

larut sampai tidak ada gelembung udara yang ter-

perangkap.

@ Kolom adsorben dibiarkan mampat dan rata (= 1

malam sambil terus dialiri pelarut, sebelum

digunakan.

2. CARA BASAH

@ “Slurry” adsorben dimasukan ke dalam kolom yang

sebagian telah diisi pelarut, sambil pelarut tersebut

dibiarkan tetap mengalir.

@ Setelah cukup berisi adsorben, kolom terus di-

kondisikan dengan mengalirkann pelarut sampai

adsorben memadat, rata dan bebas gelembung

udara.

FUNGSI PELARUT

@ Melarutkan sampel.

@ Mengakibatkan terjadinya pemisahan.

@ Mengelusi komponen-komponen/zone yang telah

terpisahkan.

DASAR PEMILIHAN PELARUT

@ Polaritas.

@ Kelarutan zat sampel.

PELARUT YANG BAIK UNTUK KR. ADSORPSI

@ Sampel dilarutkan dalam pelarut non-polar.

@ Untuk mengelusi fraksi-fraksi terakhir digunakan

alkohol.

@ Pelarut yang tidak mudah menguap.

@ Pertimbangkan juga viskositas pelarut.

Pelarut Parameter Kekuatan

Pelarut (g0)

N-Pentana 0,00

Iso-oktana 0,01

Sikloheksana 0,04

Karbon tetraklorida 0,18

Ksilena 0,26

Toluena 0,29

Benzena 0,32

Pelarut Parameter Kekuatan

Pelarut (g0)

Etil eter 0,38

Kloroform 0,40

Metilen klorida 0,42

Tetrahidrofuran 0,45

Aseton 0,56

Metil asetat 0,60

Anilin 0,62

Pelarut Parameter Kekuatan

Pelarut (g0)

Asetonitril 0,65

i-Propanol,n-propanol 0,82

Etanol 0,88

Metanol 0,95

Etilen glikol 1,11

Asam asetat Besar

L.R. Snyder, J. Chromatog., 16,55 (1964)

@ Sampel dilarutkan dalam sedikit mungkin pelarut

(larutan pekat).

@ Larutan dimasukan ke dalam kolom (di atas

permukaan adsorben) dengan menggunakan pipet.

@ Kran dibuka sehingga pelarut mengalir dan

sampel tepat masuk ke dalam adsorben.

@ Aliran pelarut dari reservoir sampai terjadi

pemisahan.

@ Eluat ditampung (berdasarkan volume atau waktu).

@ Eluat diidentifikasi.

@ Afinitas antara solute dan adsorben.

@ Adsorpsi pelarut oleh adsorben (kompetisi antra pe-

larut dengan solute.

@ Adsorben harus mengadsorpsi solute secara reversi-

bel dan memperlihatkan afinitas selektif terhadap

berbagai solute.

@ Pelarut harus melarutkan solute-solute dan me-

rupakan daya penggerak (driving force) bagi migrasi

solute.

1. Analisis frontal.

2. Analisis pengusiran (displacement analysis).

3. Analisis elusi.

4. Analisis gradien.

@ Diperkenalkan oleh Tiselius (1940).

@ Larutan sampel ditambah secara kontinu ke dalam

kolom adsorben.

@ Plot antra konsentrasi solute dalam efulen terhadap

volume eflluen adalah sbb :

@ Komponen A, yang diadsorpsi paling lemah akan ber-

gerak cepat melewati kolom dan muncul paling depan

dalam efluen.

@ Komponen berikutnya (B) yang agak kuat diikat akan

muncul dalam efluen setelah itu, dan seterusnya.

@ Dalam kurva elusi, untuk setiap zat solute yang muncul

dalam efluen akan diperoleh satu tahapan.

@ Efluen akan merupakan campuran solute, setelah kom-

ponen B muncul dan kemudian akan semakin kompleks

@ Efluen akan merupakan campuran solute, setelah kom-

ponen B muncul dan kemudian akan semakin kom-

pleks dengan munculnya solute baru berikutnya,

sampai komposisi efluen sama dengan zat sampel.

@ Garis putus-putus menyatakan penurunan konsentasi

solute dalm setiap tahap.

@ Dapat mengetahui jumlah minimum komponen sampel

dari jumlah tahapan yang ada.

@ Solute tidak harus terelusi sehingga dapat digunakan

bila terjadi adsorpsi yang tak reversibel.

@ Tidak efektif untuk memisahkan campuran karena

banyaknya komponen yang paling lemah diadsorpsi

hanya sedikit sekali yang dapat diisolasi.

@ Juga diperkenalkan oleh Tiselius (1943).

@ Solute -solute yang akan dipisahkan diadsorpsi dari se-

sedikit volume sampel, diujung atas kolom adsorben.

@ Kemudian diikuti oleh larutan zat yang mempunyai

afinitas yang lebih tinggi terhadp adsorben dibanding-

kan dengan setiap komponen sampel.

@ Kromatogram terjadi setelah larutan tersebut dialirkan

ke dalam kolom.

@ Dalam hal ini larutan pengembangan tersebut meng-

usir semua solute yang teradsorpsi, yang pada giliran-

@ -nya mengusir satu dari yang lainnya.

@ Jika kolom adsorben cukup panjang untuk tercapai-

nya kesetimbangan maka setiap komponen akan ber-

gerak lewat kolom sebagai suatu zone zat murni.

@ Solute yang paling lemah diadsorpsi akan muncul per-

tama dalam efluen, diikuti oleh komponen-komponen

sampel yang lain dengan uurtan sesuai dengan naiknya

afinitas adsorpsi.

@ Terakhir sekali, zat pengelusi akan muncul dalam

efluen tersebut.

@ Terbatas pada sistem-sistem adsorpsi reversibel.

@ Setiap komponen yang nampak dalam efluen akan

menghasilkan satu tahap dalam kurva.

@ Masing-masing komponen dapat dipisahkan dalam

bentuk murni, tapi tidak kuantitatif.

@ Pada kondisi kesetimbangan hanya sejumlah tertentu

solute yang dapat diadsorpsi per satuan berat

adsorben. Oleh karena itu bila koonsentrasi suatu

komponen naik maka panjang zone dalam

kromatografi makin panjang.

@ Penentuan kuantitatif suatu komponen dapat

dilakukan dengan mengkalibrasi volume efluen

dengan sampel standar.

@ Diperkenalkan oleh Tswett.

@ Solute-solute sampel diadsorpsi dari sesedikit volume

sampel kolom di atas kolom adsorben, kemudian

“dicuci” dengan pelarut murni.

@ Setiap komponen akan turun bermigrasi pada

kecepatan yang berbeda tergantung pada afinitas

adsorpsi.

@ Hasilnya dapat memisahkan komponen-komponen

dari campuran kompleks.

@ Memungkinkan untuk menentukan jumlah minimum

komponen sampel.

@ Komponen-komponen dapat dipisahkan secara kuantitatif dan kemudian ditentukan dengan cara konvensional.

@ Paling banyak digunakan.

@ Diperkenalkan oleh Alm, Williams dan Tiselius

(1952).

@ Solute-solute sampel diadsorpsi sebagai zone yang

kecil dekat ujung kolom.

@ Kemudian dielusi dengan campuran cairan yang

mempunyai komposisi yang diubah secara kontinu.

@ Sifat-sifat pelarut diubah sehingga daya elusinya naik,

dengan menambahkan dan mencampur suatu

komponen yang lebih polar kepada pelarut

pengembang.

@ Zone-zone yang diperoleh lebih tajam dan “tailing”

berkurang.

@ Terutama berguna untuk solute-solute yang mem-

punyai isoterm adsorpsi yang sangat melengkung.

Martin & Synge (1938) : Pemisahan asam asetilamino pada kolom pattisi

silika air kloroform.

Dasar Pemisahan

Distribusi komponen-komponen sampel antara dua fasa cair dengan polaritas yang jauh berbeda (tidak bercampur satu sama lain).

Satu cairan merupakan fasa gerak dan yang satu lagi dilapiskan pada suatu pendukung padatan sehingga merupakan cairan yang diam.

Syarat Fasa Diam

@ Pelarut yang baik bagi sampel.

@ Pelarut yang jelek (tidak bercamour) bagi fasa gerak.

SISTEM PARTISI DAHULU

@ Terjadi “bleeding”.

@ Dengan pra-saturasi fasa gerak.

@ Dengan pra-kolom (mis. Silika gel + 30-40% fasa diam.

SISTEM PARTISI SEKARANG

@ Bonded-phase HPLC.

@ Tidak terjadi “bleeding”.

ADA DUA MODE

Fasa Normal : - Fasa diam polar, fasa gerak non polar.

- Komponen-komponen polar ditahan kuat sedangkan komponen-

komponen non-polar dilewatkan.

Fasa Terbalik (Reversed-Phase) :

- Fasa diam non-polar, fasa gerak polar.

- Pemisahan senyawa non-polar.

PEMILIHAN PASANGAN PELARUT

(FASA DIAM - FASA GERAK)

@ Pilihan pasangan dengan perbedaan (parameter

kelarutan Hildebrand) yang besar tidak banyak

@ Berdasarkan sifat solute dan pasangnan pelarut

(fasa diam-fasa gerak).

@ Estimasi harga K (atau k’)’ dari solute dalam

pasangan pelarut K antra 5-10.

PARAMETER KELARUTAN HILDEBRAND

Tergantung pada :

@ Interaksi Dispersi.

@ Interaksi Dipole.

@ Kemampuan donor-aseptor proton.

PENGGUNAAN KR.PARTISI

@ Zat-zat dengan K (atau k’) rendah.

@ Pemisahan zat-zat dengan kelarutan berbeda.

PADATAN PENDUKUNG

@ Inert.

@ Tidak larut dalam kedua fasa.

@ Mengikat fasa stasioner ( 50% berat)

@ Pori-pori besar (200-500A)

@ Luas permukaan kecil (mengurangi adsorpsi).

@ Diameter partikel 50-150 µm.

@ Silika gel, keiselguhr, tanah diatomi,selulosa.

PELAPISAN PENDUKUNG

@ Metode penguapan pelarut.

@ Memompakan fasa diam ke dalam kolom lalu men- cuci kolom dengan fasa gerak yang

jenuh fasa diam.

KROMATOGRAFI FASA TERIKAT

(Bonded-phase chromatography)

• Menanggulangi keterbatasan kr. cai-cair klasik.

• Termasuk kr. cair-cair (tapi juga bisa kr.cair-padat).

• Fasa diam berupa cairan organik terikat secara kimia pada pendukung.

• Sebagai pendukung : Silika gel berpori.

Silika pelikular.

Mikropartikulat (paling banyak dipakai).