Konstruksi Vektor Ekspresi

7
Amplifikasi fragmen gen PerL Konstruksi vektor ekspersi pGWB502-PerL Introduksi pGWB502-PerL ke dalam Agrobacterium tumefaciens LBA4044 Transformasi genetik Nicotiana tabacum SR1 Identifikasi Nicotiana tabacum SR1 transgenik METODE KERJA

description

Konstruksi Vektor Ekspresi

Transcript of Konstruksi Vektor Ekspresi

  • Amplifikasi fragmen gen PerL

    Konstruksi vektor ekspersi pGWB502-PerL

    Introduksi pGWB502-PerL ke dalamAgrobacterium tumefaciens LBA4044

    Transformasi genetik Nicotiana tabacumSR1

    Identifikasi Nicotiana tabacum SR1 transgenik

    METODE KERJA

  • KONSTRUKSI VEKTOR EKSPRESI GEN Peroksidase

    Sistem Gateway Cloning

    Fragmen PerL diamplifikasi dari pGEM-PerL dengan primer yang ditambah situs CACC pada ujung 5 forward

    M 1

    Purifikasi denganelusi

    PerL pENTR-F 5-CAC CAT GCA TTT CTC TTC GTC-3Atprx-R 5-GTT CTG AAG TAA ACG TCT TGA GAG -3

    1100bp

  • RESULT

    Pengklonan Entry Vektor pENTR-PerL dengan VektorEkspresi pGWB502

    PCR Koloni dengan primer 35SF dan AtprxR

    1 2 3 4 M

    1500bp

    Hasil restriksi dengan enzim spe1 dan sac1

    M 1 2

    Spe1

    RB 35S-P PerL Tnos LB

    Sac1

    Tnos:NPTII:Pnos

    1000 Bp

    1100 bp

    1500 bp35SF AtprxR

  • Plasmid rekombinanpGWB502-PerL

    Introduksi pGWB502-

    PerL ke A. tumefaciens

    Triparental mating

    E. coliDH5

    A. tumefaciens

    Media LA

    tanpa

    antibiotik

    Media LA dengan

    antibiotik

    spectinomisin dan

    streptomisin

    pRK2013

    E. coliDH1

    PCR koloni dengan primer

    35SF dan AtprxR

  • RESULT

    Introduksi pGWB502-PerL ke dalam A. tumefaciens LBA4404

    1 2 M

    1500 bp

    RB 35S-P PerL TnosLBTnos:NPTII:Pno

    s

    1500 bp35SF AtprxR

  • Transformasi genetik Nicotiana tabacum

    Daun dipotong

    dan direndam

    A. tumefaciensLBA 4404

    transformanMedia kokultivasi

    Media induksi

    kalus

    Seleksi hyg 30 mg/L

    Media induksi

    akar (5 minggu)

    Media induksi

    akar (8 minggu)

    PCR

  • RESULT

    Identifikasi Nicotiana tabacum SR1Transgenik

    1500bp

    M 1 2

    RB 35S-P PerL Tnos LBTnos:NPTII:Pnos

    1500 bp35SF AtprxR