Konstruksi Vektor Dan Transformasi Bakteri

7/26/2019 Konstruksi Vektor Dan Transformasi Bakteri

http://slidepdf.com/reader/full/konstruksi-vektor-dan-transformasi-bakteri 1/16

MAKALAH

PRODUKSI L-ASPARAGINASE DARI Citrobacter C6 DALAM INDUSTRI

Mata Kuliah Teknologi Eni! "an In"u#t$i

Oleh %

Hanni T#aa&i'ah

(TK) P*+,,+**,

PROGRAM STUDI (IOTEKNOLOGI

SEKOLAH PASCASAR.ANA

INSTITUT PERTANIAN (OGOR

/*,6



PENDAHULUAN

,0 Lata$ (elakang

Konstruksi plasmid merupakan hal yang cukup krusial dalam bidang

molekuler terutama untuk manipulasi genetik. Dalam banyak kasus, plasmid

dikonstruksi secara in vitro dengan digesting (pemotongan) fragmen DNA

menggunakan enzim restriksi pada situs spesifik dan meligasi (penyambungan)

fragmen yang dihasilkan. Konstruksi DNA biasanya diamplifikasi dalam E. coli

untuk menganalisis strukturnya (hino, !"#").

$lasmid biasanya %uga digunakan dalam teknologi DNA rekombinan

menggunakan E. coli sebagai inang, sehingga dalam rekayasa genetika plasmid

sering digunakan sebagai vektor untuk memba&a gen'gen tertentu yang diinginkan

ke dalam suatu sel inang. en'gen tersebut selan%utnya akan mengekspresikan

produk komersial tertentu seperti insulin, interferon, dan berbagai enzim (tanfield,

#**+). $enggunaan plasmid dalam DNA rekombinan dilakukan karena plasmid

memiliki tiga region yang berperan penting untuk DNA kloning, yaitu replication

origin, marker yang memungkinkan adanya seleksi (biasanya gen resisten

antibiotik), dan daerah yang mampu disisipi oleh fragmne DNA dari luar (odish,

!""").

-enurut %o (!""*), plasmid didistribusi secara luas pada seluruh prokariota

dengan ukuran bervariasi dari ≤ # / #"+ D sampai ukuran !"" / #"+ D. $lasmid

adalah materi genetik otonom yang dapat bereplikasi secara independen dari

kromosom utama serta dapat dipisahkan secara fisik dari kromosom. $lasmid

umumnya bersifat tidak esensial bagi pertumbuhan dan kelangsungan hidup

individu bakteri, tetapi sering menyandikan sifat tambahan untuk sel, seperti untuk

resistensi terhadap antibiotik dan aktifitas metabolit. $lasmid bakteri sebagian besar

berbentuk dsDNA sirkuler yang ditutup secara kovalen di masing'masing untai

(0oyston, #*1!).

De&asa ini telah berkembang teknologi DNA rekombinan. 2eknologi tersebut

dapat diterapkan sebagai pendekatan dalam mengatasi masalah sulitnya

memurnikan protein dan materi lainnya dari suatu organisme dalam %umlah besar.

alah satu teknik yang digunakan adalah teknik restriksi DNA. -olekul DNA



rekombinan dapat diperoleh dengan cara memotong DNA vektor pada tempat

tertentu yang memiliki daerah pemotongan yang sama dengan hasil pemotongan

DNA kromosom. -anipulasi pemotongan DNA dilakukan oleh enzim yang disebut

endonuklease restriksi. elan%utnya vektor yang telah direstriksi akan disambung

dengan potongan DNA menggunakan enzim ligasi. $enemuan tentang teknologi

DNA rekombinan memungkinkan pengisolasian individual gen untuk dimanipulasi

serta dipindahkan dari satu organisme ke organisme lain atau disebut dengan

transformasi (-uladno, !""!).

-enurut -iza&arti (!""3), kloning merupakan suatu prosedur untuk

memperoleh replika yang dapat sama dari sel atau organisme tunggal. Kloning

dilakukan dengan mentransformasikan atau memasukkan fragmen DNA

rekombinan dari penggabungan fragmen DNA dengan vektor, biasanya adalah

plasmid, ke dalam sel kompeten atau sel bakteri. el bakteri yang banyak

digunakan sebagai sel kompeten dalam kloning adalah E. coli D456 yang

merupakan salah satu %enis E. coli yang telah !" mengalami rekayasa sehingga

mampu mengenali gen bla (7'laktamase) sebagai penanda resistensi ampisilin

(8ibo&o, !""!).

Di dalam biologi molekuler, terdapat gen pelapor yang berfungsi untuk

melaporkan apakah suatu transformasi dapat ber%alan atau tidak. 9ntuk proses

eksperimen rekayasa genetika, konfirmasi transformasi dan ekpresi suatu gen asing

ke dalam sel inang sangatlah penting. :agi para peneliti sangatlah penting untuk

dapat mengetahui dengan cepat apakah proses transformasi telah berlangsung bik

atau tidak, dan apakah gen target dapat diekspresikan tanpa masalah. Dari itu di

dalam biologi molekuler dikenal adanya gen pelapor yaitu gen yang dapat berperan

sebagai indikasi keberhasilan upaya kloning (Koerniati, !"#!).leh karena itu konstruksi suatu plasmid dinilai sebagai hal yang cukup

penting dalam rekayasa genetika karena dengan mengkonstruksi plasmid tertentu

kita dapat mendapatkan suatu plasmid yang memiliki karakter tertentu dengan sifat

yang kita inginkan untuk dapat dipindahkan dari organisme satu ke organisme lain

dengan cepat dan efisien. :erdasarkan hal tersebut, praktikum ini bertu%uan untuk

mempela%ari teknik konstruksi plasmid serta transformasi bakteri. $lasmid yang

digunakan pada praktikum ini adalah p;-'2 ;asy yang berasal dari



bakteri Escherichia coli. <ektor ini berukuran 3"#= pb (pasang basa) dan memiliki

poly A>2 (AAAAAAAA>22222222) ($romega, !""+). edangkan teknik

transformasi terdilakukan dengan memasukkan vektor kloning (p;-'2 ;asy yang

mengandung gen #+) dan vektor ekspresi (p;-'2 ;asy yang mengandung gen

p) selan%utnya ditransformasikan ke dalam bakteri E. coli DH5α (kompeten).

/0 Tu1uan

$raktikum ini bertu%uan untuk mengetahui dan mempela%ari teknik isolasi

plasmid, restriksi plasmid, pembuatan sel kompeten serta transformasi bakteri.

elain itu dapat membedakan hasil ekspresi antara sel yang telah disisipi vektor

kloning (mengandung gen #+) dengan vektor ekspresi (mengandung gen p).

METODOLOGI

,0 2aktu "an Te!3at P$aktiku!

$raktikum acara isolasi plasmid dilakukan pada tanggal #1 dan !? @ebruari

!"#+, sedangkan pembuatan sel kompeten dan transformasi pada tanggal !

-aret !"#+. eluruh kegiatan dilakukan di aboratorium :iorin $usat Antar

9niversitas $:.

/0 Alat "an (ahan

Alat yang digunakan pada praktikum ini yaitu collection tube, tube $0,

mikropipet (ukuran !$, !"$, !""$ dan #"""$) dan tip, erlenmeyer, setrifuge,

inkubator, pengering vakum, vorte/, alat spin down, Thermocycler , heat block,

timbangan, hot plate, comb, cetakan agar, dan gel doc.

:ahan yang digunakan pada praktikum antara lain kultur Escherichia coli

yang mengandung p;-'2 ;asy, kultur Escherichia coli DH5α, vektor kloning

pSL1 , vektor ekspresi p, media : dan ampisilin, larutan A (suspensi),

larutan : (lisis solution), larutan (neutralizing), !henol "hloro#om

$soamilalcohol ($), NaAc (!-B p4 5,!), ;t4 absolut dan 1"C, dd4 !,

0NAse, enzim Eco%# & agarose, buffer 2A; # /, buffer 2@:, D-, dan

arabinosa.

40 Ca$a Ke$1a

http://www.promega.com/




40 ,0 I#ola#i Pla#!i"

solasi plasmid dilakukan dengan metode A:. ebanyak #,5 m kultur E . coli

yang mengandung plasmid p;-'2 ;asy pemba&a gen 6 disentrifugasi dengan

kecepatan ?""" rpm selama #5 menit pada suhu ruang. upernatan dibuang, pelet

ditambahi dengan !5" solution A, dihomogenkan dengan dibolak'balik,

selan%utnya ditambahi sebanyak !5" solution :, tube dibolak'balik dan di

tambahi !5" solution , tube dibolak'balik kembali. 2ube yang berisi campuran

pellet dengan solution A: disentrifugasi kecepatan #".""" rpm selama #" menit

pada suhu ruang. upernatan yang terbentuk dipindah ke tube baru, ditambahi

NaA sebanyak ",# / vol dan ;t4 absolut sebanyak ! / vol. 2ube yang berisi

campuran supernatan, NaA dan ;t4 di masukkan dalam freezer selama ! %am.

Kemudian di sentrifugasi dengan kecepatan #".""" rpm selama !5 menit pada suhu

?E, pellet yang terbentuk ditambahi dengan +"" ;t4 1"C. 2ube di

sentrifugasi kecepatan #".""" rpm selama #5 menit pada suhu ?E. upernatan

dibuang dan tube dikeringkan dengan 'acuum dryer selama 3" menit di inkubator

suhu 31 E. 2ube kering yang mengandung pellet kemudian ditambahi dd4 !

sebanyak =" dan 3 0NAse, tube diinkubator selama #" menit pada suhu

31E, kemudian didinginkan di freezer.

40 /0 Elekt$o'o$e#i# Ha#il I#ola#i

ebanyak ",3 gram agarose ditimbang dan dilarutkan dalam 3" m 2A; # kali.

el agarose tersebut dipanaskan ke dalam microwa'e, lalu gel didinginkan sampai

suam'suam kuku. el dituang ke dalam tangki pencetak yang sudah dilengkapi

dengan comb. Apabila gel sudah padat, comb ditarik dan gel siap untuk digunakan.

el diletakkan pada alat elektroforesis dengan posisi yang tepat, sebanyak 5 plasmid hasil isolasi ditambah dengan # loading dye, disuspensi di parafilm.

elan%utnya dipipet dan dimasukkan ke dalam sumuran. 2angki elektroforesis

ditutup dan diatur voltase dan &aktunya. el di stainning di dalam larutan ;t:r

selama #5 menit, kemudian direndamdlam air selama #" menit. gel tersebut

diletakkan pada gel doc untuk di cek hasil elektroforesisnya.

40 40 Re#t$ik#i "an Liga#i



0estriksi dilakukan dengan menggunakan enzim restriksi Eco%# (5 9> tiap

reaksi) dengan komposisi reaksi pemotongan atau digest pada tabel #. ampuran

reaksi (tabel #) dimasukkan ke dalam collection tube dan diinkubasi pada suhu

31E selama semalam. 4asil restriksi diketahui menggunakan elektroforesis.

2abel #. Komposisi digest dengan enzim Eco%# untuk # kali reaksi

Komposisi Fumlah

DNA SL1 3

Eco%# ".5

:uffer Eco%# #"/ !

dd4! #?.5

2otal 0eaksi !"

40 50 Pe!uatan Ko!3eten #el

$embuatan sel kompeten dilakukan berdasarkan metode ambrook dkk . (#*=*).

Kultur E.coli DH56 diinkubasi semalam pada suhu 31 E. ebanyak ",3 m

subkultur E.coli ditumbuhkan pada media : cair kemudian diinkubasi kembali

pada shaker incubator suhu 31 E selama 3 %am. $ertumbuhan sel dipantau melalui

pembacaan densitas optik (D) pada pan%ang gelombang +"" nm (D+"") hinggamencapai angka ",?'",+ dengan spektrofotometer.

ebanyak #,5 m hasil subkultur E.coli dipindahkan pada collection tube dan

diinkubasi pada es selama #" menit. tabung kemudian disentrifugasi selama #"

menit pada kecepatan 5""" rpm, suhu ? E. $ellet yang terbentuk ditambahi dengan

?*5 buffer 2@: (Trans#ormation (u##er ) kemudian diinkubasi dalam es selama

#" menit. 2ube disentrifugasi kembali dengan kecepatan 5""" rpm selama #" menit

pada suhu ? E. $elet kemudian diresuspensi dalam ?#,!5 buffer 2@: ( G /

buffer 2@:) dan 3,3 larutan D- (=C / G buffer 2@:), lalu diinkubasi dalam

es selama #" menit.

40 +0 T$an#'o$!a#i

$roses transformasi dilakukan berdasarkan ambrook dkk . (#*=*). ebanyak

5" sel kompeten dicampur 3 vektor kloning (p#+) atau 5 vektor

ekspresi (p) dan diinkubasi dalam es selama !5 menit. $roses heat shock



dilakukan pada suhu ?! E selama ?5 detik menggunakan heatblock dan tabung

langsung dimasukkan dala es selama 5 menit. sel kemudian dipulihkan dengan

menambahkan #"" medium Heast 2ripton atau medium : cair dan diinkubasi

pada shaker pada suhu 31 E selama !" menit dengan kecepatan !5" rpm.

elan%utnya ditambahi dengan 5" arabinosa untuk vektor ekspresi p)L*.

eluruh campuran kemudian ditumbuhkan dalam media : padat yang

mengandung antibiotik ampisilin dan diinkubasi selama semalam pada suhu 31E.

elain itu dibuat kontrol positif dan negatif. Kontrol positif adalah bakteri E.

coli DH5α (tidak mengandung plasmid) yang ditumbuhkan pada medium : tanpa

antibiotik sedangkan kontrol negatif adalah bakteri E. coli DH5α (tidak

mengandung plasmid) yang ditumbuhkan pada medium : dengan antibiotik

(ampisilin), kedua kontrol diinkubasi selama semalam pada suhu 31E. Koloni

yang terbentuk diamati pada hari selan%utnya.

HASIL DAN PEM(AHASAN

,0 I#ola#i Pla#!i"

$ada praktikum ini dilakukan isolasi plasmid p;-'2 ;asy yang mengandung

gen α pada E. coli DH5 α . nti dari isolasi plasmid adalah menghancurkan

membran sel sehingga semua organel sel dapat keluar sehingga didapat DNA

kromosomal serta DNA ekstrakromosomal (plasmid). Dalam proses mengisolasi

plasmid dari bakteri, ada tiga tahap penting yang dilakukan, yaitu melisis membran

sel bakteri, ektraksi DNA, pengendapan DNA.

ambar #. 2ahapan lisis sel dan penghilangan debris sel pada isolasi plasmid

$raktikum ini menggunakan metode A: dalam melakukan isolasi plasmid

dimana digunakan larutan A, larutan :, dan larutan . $ada tahap pertama larutan A



mengandung 2ris l, ;D2A dan glukosa untuk meresuspensi membran sel bakteri.

;D2A akan mengikat ion logam dan glukosa akan membuat larutan men%adi

hipertonis, sehingga sel mulai menggembung, integritas membran mulai terganggu.

$roses lisis dia&ali dengan pemberian larutan : yang mengandung D I Na4

dimana D (Sodium Dodesil Sulphate) merupakan detergen yang berperan untuk

melisis dinding atau membtan sel yang terdiri dari lipid (fosfolipid) dan Na4

sebagai larutah basa berfungsi untuk denaturasi protein atau DNA. 2er%adinya lisis

ditandai dengan terbentuknya lendir.

2ahap selan%utnya adalah penambahan larutan yang terdiri dari 43K

dan asam asetat glasial yaitu untuk menciptakan kondisi netral yang sebelumnya

basa. -aka dilakukan pemisahan dengan larutan $ ( !henol+"hloro#orm+$soamyl ,lcohol ) yang berfungsi sebagai pelarut dari senya&a organk dan komponen lipid.

$roses ekstraksi dengan $ (!5J!?J#) akan memberikan hasil terbentuknya 3 fase,

yaitu fase atas (DNA dan 0NA), fase tengah (protein) dan fase ba&ah ( fenol'

kloroform). ;kstraksi dilakukan karena terdapat senya&a selain DNA plasmid

seperti 0NA, protein, senya&a organik dan beberapa komponen lipid. $enambahan

etanol 1"C berfungsi untuk mengikat air. elan%utnya ditambah dengan 0NAse

untuk menghilangkan sisa'sisa fragmen 0NA.

ambar !. ;lektroforegram hasil isolasi plasmid dari E.coli yang mengandung plasmid

pS1 pemba&a gen α dengan marker λ ! dan 3.

4asil elektroforegram menu%ukkan bah&a pita plasmid terlihat pada sebagian

kelompok yaitu kelompok 5, =. ## dan #! yang artinya isolasi plasmid telah

berhasil. 9ntuk kelompok lain tidak terlihat adanya pita plasmid yang menandakan

bah&a isolasi plasmid tidak berhasil. 4al tersebut dimungkinkan karena pelet yang

terbentuk kurang banyak sehingga plasmid tidak diperoleh. $ada praktikum ini

uperheliks

inier

pen sirkuler



tidak ter%adi kesalahan pada proses running elektroforesis karena marker yang

dipakai terlihat %elas.

Dari hasil elektroforesis dari kelompok yang berhasil, DNA plasmid yang

terbentuk ada beberapa macam karena terbentuknya lebih dari # pita. Kemungkinan

pita'pita tersebut adalah DNA plasmid dimana plasmid berbentuk superheliks (ccc

"o'alently "losed "ircular ) yang bermigrasi paling %auh dari sumur, pita DNA

plasmid yang berada di tengah berbentuk linear, sedangkan yang bermigrasi paling

dekat dengan sumur adalah pita DNA plasmid yang berbentuk open sirkuler.

emakin kompak suatu DNA maka akan bermigrasi semakin cepat sehingga pada

saat yang bersamaan akan bermigrasi lebih %auh dibandingkan dengan bentuk yang

kurang kompak. DNA superheliks lebih kompak dibandingkan dengan DNA plasmid dalam keadaan open sirkuler atau linier.

/0 Re#t$ik#i Pla#!i"

;nzim restriksi merupakan endonuklease yang memecah ikatan fosfodiester

pada situs pengenalan spesifik (8ong, #**1). $ada praktikum ini digunakan enzim

restriksi Eco%# yang memiliki tipe pemotongan sticky end . Eco% yang ditemukan

pada strain Escherichia coli yang mengenali urutan DNA 5L'AA22'3L.

ambar 3. ;lektroforegram hasil restriksi plasmid p#+ menggunakan enzim Eco%#B

marker DNA ladder # kb (-).

4asil elektroforegram menun%ukkan bah&a plasmid p#+ yang disediakan

berhasil dipotong oleh enzim retriksi Eco%#. DNA plasmid yang merupakan DNA

sirkuler telah berhasil dipotong men%adi DNA linier yang ditun%ukkan dengan

munculnya ! pita pada sumuran.

en #+

$lasmid p;-'

2 ;asy

K



4asil pemotongan plasmid p#+ yang mengandung gen 6 dengan enzim

restriksi Eco%# menghasilkan ! pita dengan ukuran basa yang berbeda. @ragmen

pertama berukuran M 3""" pb dan fragmen kedua berukuran M #5"" pb.$ita yang

berukuran M 3""" pb merupakan fragmen dari plasmid p;-'2 ;asy sedangkan

fragmen DNA yang berukuran M #5"" pb merupakan fragmen dari gen SL1 .

:erdasarkan hasil elektroforegram, dapat diketahui bah&a Eco% memiliki dua

situs pengenalan restriksi dimana satu situs pengenalan restriksi terdapat pada

tempat yang sama.

ambar ?. "ircle -ap vektor p;-'2 ;asy ($romega, !"##)

$ada gambar terlihat bah&a vektor linier p;-'2 ;asy memiliki beberapa

situs enzim restriksi yang spesifik dapat melepas insert yang masuk, baik dengan

menggunakan # enzim ( single digest ) maupun ! enzim. $ada praktikum ini

melakukan single digest dengan enzim restriksi Eco%#.

De&asa ini sering digunakan plasmid p;-'2 ;asy dalam teknologi DNA

rekombinan. $lasmid ini merupakan suatu vektor linear yang memiliki tambahan

nukleotida 2 pada kedua u%ung 3 atau u%ung O2P o'erhang . $lasmid ini memiliki

ukuran 3"#5 pasang basa dengan dua promotor yaitu $+ 0NA polimerase

promotor dan 21 2NA polimerase promotor. $lasmid p;-'2 ;asy memiliki gen

lac+ yang dapat menyandi enzim β ' galkturosidase yang dapat merubah

sopropil' β 'galaktopiranosida ($2) dan 5'bromo'?'kloro'3'indolyl' β '

galaktopiranosida (Q'gal) yang ditambahkan men%adi ber&arna biru. -

( -ultiple "loning Site) pada plasmid merupakan bagian dari lac+ . Apabila gen

lac+ tersisipi oleh fragmen DNA lain, maka akan merusak susunan basa gen lac+



sehingga tidak tersisipi sehingga tidak dapat diekspresikan dan menyebabkan

koloni ber&arna putih (ambrook, #*=*).

40 Pe!uatan Sel Ko!3eten

2ahap ini menggunakan kultur E.coli D456 untuk membuat sel kompeten.

$embuatan sel kompeten dia&ali dengan pencampuran subkultur E.coli DH5α D

(",?'",+) dengan 2@: (Trans#ormation (u##er ) yang mengandung al!. arutan

2@: berfungsi untuk mengganggu keseimbangan kalsium dalam membran

sehingga sel bakteri sehingga membran berhasil terbuka dan DNA insert dapat

masuk. elain 2@:, digunakan %uga larutan D- ( Dimetyl Sul#oksida) yang

merupakan pelarut polaritas aprotik yang efektif melarutkan berbagai bahan kimia

organik dan anorganik. -enurut Rhiming (!""5), penambahan D- dapat

meningkatkan efisiensi transformasi.

el kompeten adalah sel (dalam praktikum ini E. coli DH5α) yang telah

mengalami perubahan dalam hal tingkat permeabilitasnya. Artinya, membran sel

dari E. coli tersebut mampu dile&ati oleh plasmid DNA, sehingga DNA yang telah

masuk tersebut akan bertambah dan bertambah seiring pembelahan sel mikroba

tersebut.

50 T$an#'o$!a#i

$ada praktikum ini digunakan E. coli DH56 sebagai sel inang, merupakan

strain umum yang sering digunakan untuk tu%uan kloning karena menghasilkan

efisiensi transformasi yang cukup tinggi dan stabil. elain itu pada strain tersebut

memungkinkan dilakukan seleksi koloni biru'putih karena kemampuannya

melakukan 6'complementation dimana subunit 6 dari enzim β 'galakturosidase

yang disandi oleh gen lac+ yang mengalami transkripsi (ambrook, !""#).

$roses transformasi dimulai dengan pencampuran sel kompeten dengan hasil

ligasi. $raktikum ini menggunakan dua perlakuan. $ertama, sel kompeten

diligasikan dengan vektor untuk kloning (pe-'2 ;asy I gen #+) dan yangkedua sel kompeten diligasikan dengan vektor untuk ekspresi (p;-'2 ;asy I

p). 2eknik transformasi yang digunakan adalah ke%ut panas (heat shock ) yaitu

dilakukan dengan cara meletakkan campuran tersebut pada suhu ?!E selama ?5

detik dan dilan%utkan dengan inkubasi pada suhu dingin selama #" menit untuk

meningkatkan efisiensi dari transformasi (ingh, !"#").

aat diberi ke%ut panas diharapkan materi genetik yang berada di sekitar sel

kompeten akan melekat pada membran sel kompeten tersebut. $erlakuan ke%ut

panas diketahui bertu%uan untuk membuka pori pada dinding sel bakteri. nkubasi



dengan plasmid akan menyebabkan masuknya plasmid ke dalam sel. $enambahan

media : setelah perlakuan ke%ut panas berfungsi untuk memenuhi kebutuhan

nutrisi dari bakteri setelah mengalami perlakuan yang ekstrem.

9ntuk mengetahui sel yang telah mengalami transformasi maka dilakukan

seleksi transforman dengan memanfaatkan sifat yang diba&a sebagai marka seleksi.

:akteri ditumbuhkan pada medium yang mengandung ampisilin. Dengan adanya

ampisilin, maka sel E. coli yang dapat tumbuh hanya sel transforman atau sel yang

telah memasukkan plasmid. nkubasi selama #= %am akan menumbuhkan koloni

bakteri yang berasal dari sel tunggal. emua bakteri yang tumbuh dalam koloni

tersebut akan memiliki sifat yang sama sebagai bakteri transforman.

9ntuk itu pada praktikum ini dibuat kontrol positif dan negatif untuk seleksi

transforman sekaligus memastikan bah&a medium yang dipakai benar'benar

berfungsi. 9ntuk kontrol positif dibuat dengan menumbuhkan E. coli DH5α tanpa

plasmid pada medium : tanpa ampisilin. edangkan untuk kontrol negatif

dilakukan dengan menumbuhkan Kontrol E. coli DH5α tanpa plasmid pada

medium : dengan ampisilin. 9ntuk transformasi pada vektor p dilakukan

penambahan arabinosa sebagai substrat yang nantinya ketika koloni tumbuh, koloni

tersebut akan berpendar di ba&ah sinar u'.

el transforman adalah sel yang berhasil menyerap DNA plasmid, sedangkan

sel non'transforman adalah sel yang tidak memba&a DNA plasmid. 4asil

dari penumbuhan hasil transforman pada media : baik untuk kontrol I, kontrol ',

ligasi dengan p#+ maupun ligasi dengan p dapat dilihat pada gambar ?.

Kontrol positif Kontrol negatif



<ektor p <ektor p#+

ambar ?. 4asil penumbuhan kontrol I dan transforman pada medium : I ampisilin dan

kontrol S pada medium : tanpa ampisilin.

:erdasarkan hasil tersebut menandakan proses transformasi berhasil karena

terdapat koloni sel yang tumbuh. Koloni yang tumbuh adalah sel yang telah

dimasuki oleh vektor plasmid rekombinan (hasil ligasi). $ada praktikum ini

digunakan ! macam vektor rekombinan. $ertama, plasmid p;-'2 ;asy yang

telah diligasikan dengan gen #+ yang selan%utnya disebut sebagai vektor kloning.

Kedua adalah p;-'2 ;asy yang telah diligasikan dengan p yang selan%utnya

disebut sebagai vektor ekspresi.

$ada kontrol positif menandakan koloni non'transforman (tidak tersisipi

plasmid) tumbuh pada medium : tanpa ampisilin. ebaliknya untuk kontrol

negatif koloni non'transforman (tidak tersisipi plasmid) tidak tumbuh pada medium

: dengan ampisilin karena sel ini tidak memiliki karakter resisten terhadap

antibiotik yang diba&a oleh plasmid. 4asil tersebut sudah sesuai dengan teori yang

sudah di%elaskan sebelumnya.

9ntuk koloni transforman (yang mengandung plasmid) menun%ukkan

keberhasilan. $ertama, transforman p#+ tumbuh pada medium :Iampisilin.

:egitu %uga dengan transforman p tumbuh pada medium :Iampisilin. elain

itu untuk p menun%ukkan koloni yang berpendar di ba&ah sinar u' karena

p memproduksi gfp yang memanfaatkan substrat arabinosa sehingga mampu

berpendar.2abel !. $erbedaan koloni sel hasil transformasi yang terbentuk

$late -edia Koloni

Kontrol E. coli DH5α tanpa

plasmid

: I ampisilin '

Kontrol E. coli DH5α tanpa

plasmid

: 2umbuh

E. coli DH5α mengandung : I ampisilin 2umbuh tidak berpendar



p#+ pada u' transluminator

E. coli DH5α mengandung

p

: I ampisilin 2umbuh dan berpendar

pada u' transluminator

fp adalah sekelompok protein dengan struktur mirip satu sama lain yang

berpendar hi%au apabila disorot>dipapar dengan cahaya biru. $rotein ini pertama kali

diisolasi dari ubur'ubur ,e/uorea 'ictoria yang mampu memendarkan cahaya hi%au

(p2-, !"#?).

$ada praktikum ini digunakan vektor p untuk ekspresi. <ektor ekspresi

merupakan vektor yang mana disamping dapat bereplikasi sendiri %uga

mengandung sinyal'sinyal ekspresi, sehingga gen yang di klon %uga akan

ditranskripsi men%adi m0NA dan kemudian ditranslasi men%adi protein. <ektor

ekspresi memungkinkan untuk produksi protein he&an, manusia atau tanaman di

dalam bakteri. 2iga sinyal ekspresi yang paling penting adalah J (#) $romotor

transkripsi, (!) terminator transkripsi, dan (3) tempat pengikatan ribosom. <ektor

untuk kloning p#+ merupakan vektor yang hanya mampu melakukan replikasi

sendiri tetapi tidak mengandung sinyal'sinyal ekspresi.

SIMPULAN

#. 4asil isolasi plasmid berhasil dilakukan pada kelompok 5, =, ## dan #! dan

terbentuk 3 pita hasil isolat. Dari hasil elektroforegram menun%ukkan bah&a

terdapat 3 bentuk plasmid yaitu open sirkuler (pita paling atas), linier (pita yang

di tengah) dan superheliks (pita paling ba&ah) dengan %arak migrasi yang

berbeda.

!. 4asil restriksi p#+ (p;-'2 ;asy I gen #+) dengan enzim Eco%#

diperoleh ! pita dengan ukuran berbeda. $ita pertama merupakan pita dari

plasmid p;-'2 ;asy yang berukuran M 3""" pb, sedangkan pita kedua

berukuran M #5"" pb yang merupakan pita dari gen #+. Dari sini dapat

diketahui bah&a Eco% memiliki dua situs pengenalan restriksi dimana satu situs

pengenalan restriksi terdapat pada tempat yang sama.

3. Dari hasil kontrol positif menun%ukkan bah&a koloni non'transforman (tidak

tersisipi plasmid) tumbuh pada medium : tanpa ampisilin. $ada Kontrol

negatif koloni non'transforman (tidak tersisipi plasmid) tidak tumbuh pada



medium : I ampisilin karena sel ini tidak memiliki karakter resisten terhadap

antibiotik yang diba&a oleh plasmid.

?. 4asil transforman pada sel yang tersisipi vektor untuk kloning (p#+) dan

vektor untuk ekspresi (p) menun%ukkan hasil yang positif karena koloni

tumbuh pada media :Iampisilin. 9ntuk koloni yang tersisipi p, berpendar

di ba&ah sinar u' karena mengandung gen g#p yang mampu memanfaatkan

substrat arabinosa.

DA7TAR PUSTAKA

hino, A., Ken%i 8atanabe, dan 4isao -oriya. !"#". $lasmid construction using

recombination activity in the fission yeast Schi0osaccharomyces pombe. !loS

*E 5(3).

Koerniati, ., dan 4ani 8idhianata. !"#!. onstruction and transformation of H2,1

gene e/pression vector into ndonesia elite rice varieties. ,gro(iogen =(!)J 5?'

+#.

odish, 4., Arnold :., . a&rence R., $aul -., David :. Fames D. !""". -olecular

cell biology. 8h @reeman ompany.

-iza&arti. !""3. $enerapan teknik'teknik kloning gen dalam kehidupan manusia.

$erpustakaan Digital 9niversitas umatra 9tara.

-uladno. !""!. eputar teknologi rekayasa genetika. :ogorJ $ustaka 8irra 9saha

-uda.

%o, . Abayomi dan :. A. so. !""*. solation of plasmid'DNA from synthetic

detergent degraders in &aste&ater from a tropical environment. ,#rican 3ournal

o# -icrobiology %esearch 3(3)B #!3'#!1.



p2- :acterial 2ransformation. !"#?. ,d'anced (iology with 2ernier .

(&&&.vernier.com).

$romega. !""+. Li#e Science "atalog . $romega orporation. 9AJ 8oods 4ollo& 0oad

-adison. (&&&.promega.com)

0oyston . lo&es. #*1!. -olecular structure of bacterial plasmid. (acteriological

%e'iews 3+(3)J 3+#'?"5.

ambrook, F., ;. @ @ritsch T 2. -anniatis. #*=*. -olecular cloning a laboratory

manual . 4nd ed . Ne& HorkJ old pring 4arbour laboratory $ress.

ambrook, F. 0ussel, David 8. !""#. -olecular "loning J , Laboratory -anual . 3rd

;dition. <ol. #,!,3. Ne& HorkJ old pring 4arbour aboratory $ress.

tanfield 8D, Faime , 0aul F. (#**+). -olecular and cell biology. Ne& yorkJ -c

ra&'4ill.

ingh, -., A. Hadav., Q, -a dan ;. Amoah. !"#". $lasmid DNA transformation in

Escherichia coliJ ;ffect of heat shock temperature, duration, and cold incubation

of al! treated cells. $nternational 3ournal o# (iotechnology and (iochemistry

+(?)J 5+#'5+=.

8ibo&o, -angun&ardoyo. 2ransformasi fragmen DNA kromosom anthomonas

campestris ke dalam Escherichia coli. -,6,%, +(#).

8ong, D, 8. . #**1. The ,(" o# gene cloning . Ne& HorkJ nternational 2homson

$ublishing.

Rhiming, 2u et al . !""5. An improved system for competent cell preparation and high

efficiency plasmid transformation using different Escherichia coli strains.

Electronic 3ournal o# (iotechnology =(#).



Konstruksi Vektor Dan Transformasi Bakteri

Documents

Transcript of Konstruksi Vektor Dan Transformasi Bakteri