Aktivasi G-Protein oleh Morfin dan Kodein congeners: Wawasan ke Relevansi O dan N-DemethylatedMetabolit di Dan Reseptor OpioidPerbedaan fenotipik sensitivitas analgesik untuk kodein (3-methylmorphine) hasil dari polimorfisme di sitokrom P450-2D6, yang mengkatalisis O-demethylation kodein untuk morfin. Namun, O demethylation dikabarkan tidak diperlukan untuk aktivitas analgesik dari kongener kodein 7,8-jenuh dihydrocodeine, hydrocodone, dan oxycodone. Penelitian ini ditentukan potensi dan kemanjuran senyawa ini dan derivatif demethylated mereka untuk merangsang -?? dan opioid reseptor-dimediasi aktivasi G-protein menggunakan agonis-dirangsang guanosin 5? -O- (3- [35S] tio) trifosfat ([35S] GTP? S) mengikat. Hasil penelitian menunjukkan bahwa 7,8-jenuh kongener codeine lebih efektif dibandingkan kodein dalam mengaktifkan? reseptor, tetapi hanya dihydrocodeine lebih berkhasiat di? reseptor. Hydrocodone dan oxycodone adalah? 10 kali lipat lebih kuat dari kodein dan dihydrocodeine di kedua reseptor. Morfin-seperti Senyawa dengan kelompok 3-hidroksi yang? 30- 100 kali lipat lebih kuat dari analog 3-metoksi mereka di? reseptor, dan senyawa ini umumnya dipamerkan keberhasilan yang lebih besar (misalnya, morfin menghasilkan 2 kali lipat stimulasi maksimal lebih besar dari kodein). Penghapusan dari kelompok N-metil tidak mempengaruhi efikasi atau potensi congener codeine untuk mengaktifkan? reseptor, sedangkan modifikasi ini umumnya meningkat khasiat tetapi menurun potensi congener morfin. Pada? reseptor, congener morfin menunjukkan potensi dan tergantung struktur yang lebih besar perbedaan dalam keberhasilan dibandingkan dengan congeners kodein, sedangkan penghapusan kelompok N-metil memiliki efek serupa dengan yang diamati pada? reseptor. Hasil ini menunjukkan yang 7,8-jenuh congener kodein lebih berkhasiat dari kodein, yang dapat menjelaskan kurangnya persyaratan untuk 3-O-demethylation in vivo. Meskipun demikian, karena semua 7,8- congener kodein jenuh secara signifikan lebih kuat dari turunan morfin mereka, penelitian lebih lanjut diperlukan untuk memahami hubungan antara metabolisme dan in vivo aktivitas senyawa ini.Opioidanalgesik,kodein(3-methoxymorphine),mengalami beberaparutemetaboliktermasukN -danO-demethylation, sertaglucuronidation(Dayeretal.,1988;Mikuset Al.,1991 ;Caraco etal, 1996;Yuetal.,2002).Ianyabaik didirikanbahwakodeinharusO-demethylateduntukmorfin untuk menghasilkananalgesiadibaikmanusia(Chenetal., 1991) dan tikus (Mikusetal.,1991 ;Cleary etal,1994).Dalam reaksiini,mengkatalisismanusia,sitokromP450 6 2D(CYP - 2D 6) dan individu denganvarianallelicdisfungsional gen ini phenotypically digambarkan sebagai metabolisme miskin (PMs)dankurangsensitifterhadapkodein.Individu- individu yang mengekspresikan beberapasalinanaktifCYP - 2D 6yangluasmetabolisme (EMs) dan lebih sensitifterhadapkodein.EMsdapat PameranfenotipePM,namun,ketikakodeincoadministered bersama dengan inhibitor CYP - 2D 6sepertiquinidine. PersyaratanuntukO-demethylationinitidakmengherankan mengingat bahwa nilai Ki dilaporkan untuk mengikat opioid reseptor200kalilebih tinggi untuk kodein daripada untukmorfin (Chenetal.,1991;Mignatetal.,1995).Perbedaanbesardalam mengikat afinitasjugaterlihatantaralainkodeincongeners danmetabolitmerekaO-demethylated ;sebagai contoh , NilaiKixanax30-foldlebih besardaripada hydromorphone(Chenetal.,1991).Datainimenunjukkanbahwakonversimetabolikkebanyakankodeincongenersmengarahpadapembentukanmetabolitdenganafinitasyanglebih besaruntukreseptoropioid daripada senyawa induknya. MeskipunO-demethylationdarikodeinuntukmorfindiperlukan untuk kegiatan divivo, upaya untukmenunjukkanpentingnya reaksiiniuntukkodeinlainderivatifmemiliki gagal. Oxycodone, misalnya, adalahstrukturalserupa(Lihat Fig.1) untuk kodein dan mengalami serupa metabolisme(Weinstein danGaylord,1979;Ishidaetal.,1982;Poyhiaetal., 1992);dengan demikian,ituadalahhipotesisbahwaiajugaakanmemerlukan O-demethylationdi3-posisi untuk menghasilkan analgesia. Studi pada manusia, bagaimanapun ,menunjukkan bahwa oxycodone,dantidak turunannyaO-demethylated,bertanggung jawabuntukanalgesia (Kaikoetal.,1996).Kesimpulanyangsamadiambildari studi tentang efek psikomotor dan subjek diri pelaporandari obatpengalamanmengikutioxycodoneadministrasi(Heiskanen etal.1998).StudimemeriksaO-demethylationdari Xanax untuk hydromorphone juga telahmenunjukkanbahwa orangtuasenyawatampaknyamenjadibertanggung jawab untuk analgesik efekpadatikus(Tomkinsetal.,1997),monyet(Lelasetal., 1999), dan manusia (Ottonetal.,1993). Bahkanlebihmengejutkanadalahdihydrocodeine,yang(sepertikodein) ini dilaporkan telah Ki untuk reseptor-lebih dari 100-fold lebih besardariyangdihydromorphinemetabolitO-demethylated (Schmidtetal.,2002).Studiyangmenggunakanmicrosomeshatimanusia menunjukkan bahwaCYP - 2D 6bertanggung jawabuntukOdemethylation dihydrocodeine danEMsyangmemiliki10kali tingkatclearancePMs(Kirkwoodetal.,1997).Penelitiandi manusia (Wilder-Smithetal.1998)dantikus(Jurnaetal., 1997), bagaimanapun, menunjukkan bahwainhibisiO-demethylation tidak berpengaruh pada analgesia. Menariknya, intrathecal disuntikkan hydrocodeinedandihydromorphineditampilkanserupa Efek antinociceptive awal, tetapi tindakandihydrocodeine dihamburkan lebihcepat,menunjukkanbahwa biotransformasi tidakterjadiselamaassay(Jurna etal.,1997).Palingsecara klinisrelevancanduagonis,sepertimorfin,menghasilkanefekbiologisterutamamelaluiaktivasi-reseptor opioid (Matthes et al, 1996;Soraetal.,1997;Lohetal.1998).Namun,-reseptor opioid juga dapat memodulasiantinociceptivedanmemperkuatefekopiattersebut(Heymanetal.,1989;Martinetal.,2000)danmungkinmemainkanperanditoleransicandu(Abdelhamidetal.,1991;Nitscheetal.,2002). karena - dan - mengaktifkan reseptor opioid G-proteinsubfamiliGi o,agoniskemanjuranpadareseptorinidapatdiukurdalamvitromenggunakandirangsang agonis[35S] GTPSmengikat(TraynordanNahorski,1995;Selleyetal.,1997;SzekeresdanTraynor,1997),yangmenyediakanukuranlangsungdiperantarai reseptorG proteinaktivasi(AsanodanRoss,1984;Namunetal.,1989).Di bawahkondisidimanaterdapatreseptortidakcadanganuntukaktivasiG-protein,sepertiditikusmembranthalamic,maksimalstimulasi[35S] GTPSmengikatdenganreseptoragonis didudukisecara langsungberkorelasidenganKhasiatintrinsik(Selleyetal.1998).Untukpengetahuankita,tidak adasalah satutelahdigunakan[35S] GTPSmengikatuntuklangsungmengukurGproteinaktivasiolehkodeincongenersdanmetabolitmerekahasildaribiotransformasiP450-dimediasi.TujuanstudiiniadalahuntukmenilaiapakahperbedaandilaporkanantaradatamengikatsecarainvitrodaninvivoperilakuStudidapatdijelaskanditingkatG proteinaktivasi.Selainitu,studiiniakanmemberikaninformasitentangstruktur-hubungan kegiatan di - dan - reseptor opioid.Inihasilakanmenelaahgugusstrukturalyangmeningkatkankemanjurandanpotensikodein berbasisopioidanalgesikdanmemberikanwawasantentangpentingnyaspesifikP450-dimediasi.reaksidalamtindakanobatini.BahandanmetodeBahan.Laki-lakiSprague-Dawleytikus(150-200g)dibelidariHarlan(Indianapolis,IN).Semuabahan kimiayangdiperolehdariSigma-Aldrich(StLouis,MO)kecualiberikut:[35S] GTPS(1250Ci/mmol)dibelidarikehidupanPerkinElmerdananalitisIlmu(Boston,MA),GTPSdariRochediagnostik(Indianapolis,DALAM),DMEM/F-12dariInvitrogen(Carlsbad,CA),danEcolitesintilasicairandariICNBiomedicalsInc(CostaMesa,CA).Semuaagonis,kecualinoroxycodone,DiperolehdariNationalInstituteonDrugAbuse(Bethesda,MD).WHATMANGF/BglassfiberfilteritudibelidariFisherScientificCo(Pittsburgh,PA).HMOR-Rendah Sel Konstruksi. Transfeksi hamster Cina sel K1 ovarium dengan manusia? CDNA reseptor -opioid dalamPires vektor ekspresi eukariotik dilakukan dengan menggunakan Lipofectaminemenurut direkomendasikan prosedur produsen.Klon yang stabil dipilih dengan inkubasi lebih lanjut di hadapan0,25 mg / ml Hygromycin B dan terisolasi menggunakan disterilkansumur kloning. Klon disaring untuk ekspresi reseptor -opioid?tingkat menggunakan [3H] saturasi nalokson mengikat, dan kopling G-proteindikonfirmasi oleh [35S] GTP? S mengikat tes dengan DAMGO (lihatbawah).Persiapan membran. NG108-15 sel dikultur diDMEM dilengkapi dengan 100 U penisilin / ml, 100? G / ml streptomisin,dan 5% serum janin anak sapi. Hamster Cina sel K1 ovariumstabil mengekspresikan manusia? reseptor -opioid (sel HMOR-CHO)dikultur dalam DMEM / F-12 dilengkapi dengan 100 U / ml penisilin,100? G / ml streptomisin, 0,25 mg / ml Hygromycin B, dan 10% janinbetis serum. Tikus jantan Sprague Dawley-dibunuh oleh pemenggalan kepala,diikuti oleh diseksi thalamic di atas es. Membran dibuat denganhomogenisasi jaringan atau sel dalam membran penyangga (50 mM Tris-HCl, 3 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 7,4) dan sentrifugasi pada50,000g selama 10 menit pada 4 C; kemudian, mereka disuspensi dalam yang samapenyangga 1,5 mg / ml dan disimpan di? 80 C.[35S] GTP? S Binding Tes. Sebelum tes, sampeldicairkan di atas es, disentrifugasi pada 50,000g selama 10 menit pada 4 C, dan diresuspensidalam buffer assay (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 3 mM MgCl2, 0,2mM EGTA, dan 100 mM NaCl). Reaksi yang mengandung 10? G membranprotein diinkubasi selama 1,5 jam (NG108-15) atau 2 jam (thalamus,HMOR-CHO) pada 30 C dalam buffer assay mengandung 30? M (thalamus,NG108-15) atau 10? M (HMOR-CHO) PDB, 0,1 nM [35S] GTP? S, danberbagai konsentrasi agonis. Spesifik mengikat ditentukandengan 20? M GTP berlabel? S. Untuk membran thalamic, sebuahtambahan 10-menit inkubasi dengan 4 mU / ml deaminase adenosindilakukan pada 30 C sebelum menambahkan membran untuk reaksi.Reaksi dihentikan dengan penyaringan vakum cepat melalui GF / Bkaca filter serat, dan radioaktivitas diukur dengan kilau cairspektrofotometri pada efisiensi 95% untuk 35S.[3H] Nalokson Binding Assay. Untuk [3H] nalokson mengikat, 30 untuk45? G protein membran sel HMOR rendah diinkubasi selama 2 jam pada30 C di Assay buffer dengan 0,1 sampai 15 nM [3H] nalokson. spesifikmengikat ditentukan di hadapan 10? M naltrexone. reaksiyang diakhiri oleh filtrasi vakum cepat melalui GF / B kacafilter serat, dan radioaktivitas diukur dengan kilau cairspektrofotometri pada efisiensi 45% untuk 3H.Sintesis Noroxycodone. Noroxycodone disiapkan dalamsintesis, yang terdiri dari 3 langkah, mulai dari oxycodone. Pada bagian pertamalangkah, oxycodone berubah menjadi 14-acetoxy-7,8-dihydronorcodeinonemenggunakan prosedur yang dimodifikasi yang diterbitkan oleh Cheng et al. (Cheng. et al, 1996): Sebuah suspensi 0,9 g (2,9 mmol) oksikodon di asetatanhydride (3,0 ml) dipanaskan pada suhu 90 C selama 1 jam. Campuran itumenguap dan minyak cokelat yang dihasilkan diangkat ke CHCl3 (10ml), dicuci dengan larutan NH4OH (pH? 9,5), air garam (10 ml), dikeringkanNa2SO4 dan diuapkan untuk memberikan 14-acetoxy-7,8-dihydronorcodeinonesebagai berwarna padat (0,9 g, 84%). Produk mentah ini digunakantanpa pemurnian lebih lanjut. Pada langkah kedua, 0,9 g (2,5 mmol)14-acetoxy-7,8-dihydronorcodeinone dilarutkan dalam CHCl3 (60 ml)dan diperlakukan dengan CNBr (3 g) dalam kondisi refluks selama 24 jam. Penguapanpelarut yang disediakan mentah 14-acetoxy-N-siano-7,8-dihydronorcodeinonesebagai padat kristal yang direkristalisasi dariMeOH (0,6 g, 62%), m.p. (Ditemukan): 266-269 C, m.p. (Currie et al.,1961): 260 C (Desember). Pada langkah ketiga, noroxycodone disiapkandari 0,5 g (1,4 mmol) dari 14-acetoxy-N-siano-7,8-dihydronorcodeinone,yang ditangguhkan di H2SO4 (25%, 20 ml) dan diadukdi bawah kondisi refluks selama 4 jam. Selama ini, padat secara bertahapdibubarkan. Larutan didinginkan sampai 10 C dan pH disesuaikan dengan 9,5dengan penambahan NH4OH. Produk diekstraksi ke dalam CHCl3 (limakali, 30 ml). Lapisan organik gabungan dikeringkan dengan Na2SO4,disaring melalui celite, dan menguap. Dihasilkan busa tan itudilarutkan dalam etanol (2 ml) dan diasamkan dengan hidrogen iodida (57%).