Karakterisasi Molekuler Gen Penyandi Kitinase Bakteri Asal ...epaper.aquaculture-mai.org/upload/2....

Konferensi Akuakultur Indonesia 2013

108

Karakterisasi Molekuler Gen Penyandi Kitinase Bakteri Asal Limbah Udang

dan Kepiting sebagai Anti Saprolegnia

Ibnu Dwi Buwono1, Hanif Sri Wahyuni

2 dan Roffi Grandiosa

3

1Staf pengajar Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Padjadjaran

2Alumni Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Padjadjaran

3Staf pengajar Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Padjadjaran

Korespondensi : [email protected]

Abstract

Ibnu Dwi Buwono, Hanif Sri Wahyuni and Roffi Grandiosa. 2013. Molecular Characterization

of Genes Encoding Chitinase of The Bacterial Origin Shrimp and Crabs Waste as anti Saprolegnia. Konferensi Akuakultur Indonesia 2013. Mortality in the eggs of freshwater fish can reach 80% due to

fungal pathogen infection (Saprolegnia sp.) resulted in low fry production and fish eggs. Saprolegnia growth

inhibition using the biologically effective chitinolytic bacteria applied, therefore chitinase enzyme produced

is able to lysis fungal cell walls that contain chitin as the main composition. Isolation and characterization of

genes encoding chitinase of bacterial origin shrimp and crabs waste is needed to verify the functional domain

coding sequences containing sequences encoding the enzyme catalytic site and the binding of chitin as an anti

Saprolegnia. This research uses experimental exploratory method to obtain sequences of genes encoding

chitinase bacterial origin of shrimp and crabs waste. The encoding gene sequencing results were analyzed by

bioinformatics with blastn for nucleotide sequence alignment and blastx for amino acid sequences.

Functional domains of chitinase and prediction of protein three-dimensional structures of enzymes were

analyzed using the program SIB (Swiss Institute of Bioinformatic) Expasy

(http://www.expasy.org/vg/index.protein). Isolate pure bacterial origin shrimp and crabs waste has

chitinolytic index was relatively high (2.12 mm and 1.99 mm) and inhibition zone of crabs waste bacterial

(11.59 mm) was higher than the original shrimps waste (6.005 mm) on the growth of mycelium and

Saprolegnia hyphae. Genes encoding chitinase bacterial origin of shrimp and crabs waste obtained with the

process starting from genomic DNA extraction from pure bacterial culture results are then used as a template

for chitinase DNA synthesis by PCR (Polymerase Chain Reaction). Amplification results of the chitinase

gene with primers Chie-F (5'-CTAGACAACTTTTTGTATAGGAGTGTTGATATG-3 ') and Chie-R

(5'-CGATTGATGAGGGCTAATTATAGTTTTACTTTG-3') of 1200 bp. Analysis of amino acid residues of

chitinase using blastx program (forward) showed that bacterial chitinase genes from shrimp waste has a high

similarity (96%) with Bacillus thuringiensis chitinase sequences (no. accession YP003665928.1) and crabs

waste bacterial chitinase sequences 99% identical with Bacillus cereus (no. accession WP000932552.1).

Detection of functional domains B. thuringiensis and B. cereus with SIB Expasy obtained catalytic site,

active site binding of chitin, the signal peptide, N-glycosylation, two cysteine residues and transmembrane

helix as a molecular characteristic enzyme. Differences in three-dimensional molecular structure of chitinase

B. thuringiensis and B. cereus associated with differences in the amount of each composition amino acids.

Keywords: Anti Saprolegnia; Bacteria shrimp and crabs waste; Chitinase; Molecular characterization

Abstrak

Mortalitas pada telur-telur ikan air tawar dapat mencapai 80% akibat infeksi jamur patogen

(Saprolegnia sp.) menyebabkan rendahnya produksi telur dan benih ikan. Penghambatan pertumbuhan

Saprolegnia secara biologis menggunakan bakteri kitinolitik efektif diterapkan, oleh karena enzim kitinase

yang diproduksi mampu melisiskan dinding sel jamur yang mengandung kitin sebagai penyusun utama.

Isolasi dan karakterisasi gen penyandi kitinase bakteri asal limbah udang dan kepiting diperlukan untuk

memverifikasi domain fungsional sekuen penyandi sekuen penyandi yang mengandung tapak katalitik enzim

dan pengikatan kitin sebagai anti Saprolegnia. Penelitian ini menggunakan metode eksperimen secara

eksploratif untuk memperoleh sekuen gen penyandi kitinase bakteri asal limbah udang dan kepiting. Hasil

sekuensing gen penyandi tersebut dianalisis secara bioinformatik dengan program blastn untuk pensejajaran

sekuen nukleotida dan blastx untuk sekuen asam amino. Domain fungsional kitinase dan prediksi struktur

tiga dimensi protein enzim dianalisis menggunakan program SIB (Swiss Institute of Bioinformatic) Expasy

(http://www.expasy.org/vg/index.protein). Isolat murni bakteri asal limbah udang dan kepiting memiliki

indeks kitinolitik relatif cukup tinggi (2,12 mm dan 1,99 mm) serta zona hambat bakteri limbah kepiting

http://www.expasy.org/vg/index.protein


109

(11,59 mm) lebih tinggi dibanding asal limbah udang (6,005 mm) terhadap pertumbuhan miselium dan hifa

Saprolegnia. Gen penyandi kitinase bakteri asal limbah udang dan kepiting diperoleh dengan proses yang

dimulai dari ekstrasi DNA genom bakteri hasil kultur murni yang selanjutnya digunakan sebagai cetakan

(template) untuk sintesis DNA kitinase dengan teknik PCR (Polymerase Chain Reaction). Hasil amplifikasi

gen kitinase tersebut dengan primer ChiE-F (5’-CTAGACAACTTTTTGTATAGGAGTGTTGATATG-3’)

dan ChiE-R (5’-CGATTGATGAGGGCTAATTATAGTTTTACTTTG-3’) sebesar 1200 bp. Analisis asam

amino residu kitinase menggunakan program blastx (forward) menunjukkan bahwa gen kitinase bakteri

limbah udang memiliki kemiripan tinggi (96%) dengan sekuen kitinase Bacillus thuringiensis (no. aksesi

YP003665928.1) dan sekuen kitinase bakteri limbah kepiting identik 99% dengan Bacillus cereus (no. aksesi

WP000932552.1). Deteksi domain fungsional B. thuringiensis dan B. cereus dengan SIB Expasy diperoleh

situs katalitik, tapak aktif pengikatan kitin, sinyal peptida, N-glikosilasi, dua residu cysteine dan helix

transmembran sebagai ciri molekul enzim. Perbedaan struktur tiga dimensi molekul kitinase B. thuringiensis

dan B. cereus berkaitan dengan perbedaan jumlah masing-masing asam amino penyusunnya.

Kata kunci: Anti saprolegnia; Bakteri limbah udang dan kepiting; Kitinase; Karakterisasi molekuler

Pendahuluan

Infeksi jamur patogen pada kulit tubuh induk ikan selama kegiatan pembenihan menjadi

kendala cukup serius karena menyebabkan rendahnya produksi telur dan benih ikan (Bruno dan

Wood, 1999). Mortalitas akibat infeksi jamur ini (terutama genus Saprolegnia sp. dan Achlya sp.)

mencapai 80–100%, sehingga diperlukan pencegahan serangan patogen tersebut menggunakan

bahan-bahan kimiawi atau biologis untuk pengobatan penyakit jamur.

Bahan kimiawi yang selama ini digunakan dalam pencegahan serangan patogen jamur

Saprolegnia adalah malachyte green, namun bahan tersebut berbahaya bagi kesehatan manusia

karena bersifat karsinogenik (Van West, 2006). Mengingat residu bahan kimia untuk pengendalian

Saprolegnia dapat mempengaruhi lingkungan perairan usaha budidaya ikan, diperlukan bahan anti

Saprolegnia dari mikroorganisme yang relatif tidak menimbulkan efek toksik (Patil et al., 2000).

Bakteri kitinolitik sangat berlimpah dalam limbah industri pengolahan cangkang udang dan

kepiting serta bermanfaat sebagai agen pengendali jamur patogen, oleh karena kemampuannya

memproduksi kitinase yang dapat menghidrolisis dinding sel jamur Saprolegnia karena sebagian

besar dinding sel jamur tersusun atas kitin. Berdasar fungsi biologisnya sebagai anti Saprolegnia,

kitinase diperlukan dalam kegiatan pembenihan ikan untuk perlindungan dari serangan jamur

patogen tersebut (Maria et al., 2010).

Isolasi dan karakterisasi gen penyandi kitinase bakteri kitinolitik dari limbah udang dan

kepiting sangat diperlukan untuk memverifikasi domain fungsional pada sekuen gen penyandi

tersebut, khususnya domain katalitik yang berperan dalam hidrolisis kitin dan domain pengikatan

kitin sebagai substrat enzim (Wang et al., 2001 ; Zhong et al., 2005 ; Okay dan Ozcengiz, 2009).

Jenis bakteri yang hanya memiliki domain katalitik terhadap Saprolegnia dan domain pengikatan

kitin pada sekuen gen penyandi kitinase tersebut yang dicari dalam limbah udang dan kepiting

sebagai target penelitian tersebut. Spesies bakteri kitinolitik dalam industri pengolahan udang dan

kepiting di Indonesia yang memiliki aktivitas kitinolitik dan anti Saprolegnia yang relatif tinggi

untuk mendegradasi kitin dari jamur Saprolegnia masih terbatas dikaji, sehingga diperlukan

penelitian tentang hal ini.

Materi dan Metode

Penelitian ini mencakup tiga tahap pengerjaan, yaitu kultur murni bakteri kitinolitik, uji

aktivitas kitinolitik dan aktivitas anti Saprolegnia serta amplifikasi dan analisis sekuen penyandi

kitinase. Sampel produk amplifikasi gen penyandi kitinase dari bakteri asal limbah udang dan

kepiting dikirimkan ke PT. Genetika Science Indonesia (1 st Base Singapore) untuk dilakukan

sekuensing.

Sampel limbah cangkang udang dan kepiting diperoleh dari tempat pelelangan ikan

Pelabuhan Perikanan Nusantara (PPN) Cirebon. Kultur murni bakteri kitinolitik dan isolasi DNA


110

genom bakteri dan amplifikasi gen penyandi kitinase dilaksanakan di Laboratorium Bioteknologi

Perikanan dan Kelautan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Padjadjaran.

Materi

Peralatan utama yang digunakan, meliputi : refrigerated microcentrifuge, laminar air flow,

shaking waterbath, shaking incubator, oven incubator, thermal cycler, seperangkat unit

elektroforesis, ultraviolet (UV)-transilluminator, mikropipet, hot plate magnetic stirrer, timbangan

mikro, vortex-mixer, autoclave, jangka sorong digital dan kamera digital.

Bahan utama yang dipergunakan, yaitu bahan kimia pengawet sampel limbah udang dan

kepiting (NaCl fisiologis, es curai), pembuatan koloidal kitin (cangkang udang, HCl pekat, NaOH

10 N, akuades, glass-wool), media selektif bakteri kitinolitik (medium agar kitin, alkohol 70%,

NaCl fisiologis, limbah udang dan kepiting, akuades), media kultur Saprolegnia (PDA/Potato

Dextrose Agar, kloramfenikol, biakan murni Saprolegnia sp.), medium kultur cair (nutrient broth,

koloidal kitin, akuades), isolasi DNA genom bakteri (Wizard Genomic DNA kit), amplifikasi gen

penyandi kitinase (primer ChiE-F dan ChiE-R, DNA template, go taq green master mix, nuclease

free water) dan elektroforesis (serbuk agarose, tris-borate EDTA (TBE), ethidhium bromide (EtBr),

marker DNA ladder 1 kb).

Metode

Penelitian dilakukan menggunakan metode eksperimen secara eksploratif untuk memperoleh

sekuen gen penyandi kitinase bakteri asal limbah udang dan kepiting. Data berupa sekuen asam

amino penyandi kitinase diverifikasi secara bioinformatik menggunakan analisis kesejajaran lokal

(local alignment) berdasarkan sekuen asam amino dan basa nukleotida melalui program blastn dan

blastx secara on-line untuk determinasi domain fungsional enzim kitinase. Prediksi struktur tiga

dimensi protein kitinase, sinyal peptida, domain fungsional (katalitik dan pengikatan kitin),

transmembran helix, N-glikosilasi dan tapak aktif pengikatan kitin dari kitinase bakteri dianalisis

berdasarkan sekuen asam amino menggunakan program SIB (Swiss Institute of Bioinformatic)

Expasy (http://www.expasy.org/vg/index.protein).

Koloidal kitin dibuat mengikuti prosedur Ilmi (2007) dan Agustin (2013). Cangkang udang

sebanyak 10 g dilarutkan dalam 200 mL HCl pekat dan diinkubasi semalam pada suhu 4oC.

Larutan kemudian disaring dengan glass-wool dan ditambahkan 100 mL akuades dingin serta

NaOH 10 N untuk menetralkan keasaman larutan. Agar terbentuk endapan, dilakukan sentrifugasi

dingin (4oC) pada kecepatan 8000 rpm, kemudian endapan dikumpulkan dan dicuci dengan

akuades dingin serta disentrifugasi kembali. Penyucian dilakukan berulang hingga didapatkan

endapan berwarna putih kecoklatan yang merupakan koloidal kitin (Usharani dan Gowda, 2010).

Kultur bakteri dari limbah udang dan kepiting dilakukan dalam medium agar kitin (2 g agar

ditambah 2 g koloidal kitin) yang ditambahkan 100 mL akuades dan dilarutkan dengan

memanaskan pada hot plate magnetic stirrer serta disterilisasi dalam autoclave. Medium tersebut

kemudian dituangkan ke dalam cawan petri dan dibiarkan hingga memadat, kemudian dilanjutkan

dengan pengambilan 1 mL sampel limbah udang atau kepiting menggunakan mikropipet serta

dipindahkan ke dalam tanung reaksi yang sudah diisi 9 mL NaCl fisiologis steril. Tahap berikutnya,

dilakukan pengenceran hingga 10-1

(Agustin, 2013), dan disimpan dalam oven incubator (suhu

30oC) selama 2 hari

.

Proses pemurnian koloni bakteri, dilakukan pada koloni yang telah dikultur 2 hari pada

medium agar kitin, dengan mengambil koloni yang terpisah berdasar bentuk dan warna

menggunakan jarum ose steril dan menginokulasikannya ke dalam cawan petri baru yang berisi

medium agar kitin dengan teknik gores (Usharani dan Gowda, 2010). Proses tersebut diulangi

hingga mendapatkan isolat bakteri murni dimana hanya terdapat koloni bakteri yang sama dengan

koloni bakteri yang ditumbuhkan pada cawan petri lain.

Pengujian keberadaan kitinase dari koloni murni yang telah diperoleh dilakukan dengan

menginokulasikan isolat tunggal ke dalam cawan petri yang berisi medium MGMC (Medium

Garam Minimum Chitin) padat yang telah disterilisasi dengan metode titik (Ilmi, 2007 ; Agustin,

2013). Pengukuran zona bening (zona hambat) yang dihasilkan sebagai indikator aktivitas

http://www.expasy.org/vg/index.protein


111

kitinolitik bakteri terhadap substrat MGMC dengan formula penghitungan indeks kitinolitik (Gohel

et al., 2006), yaitu indeks kitinolitik = rata-rata diameter zona bening : rata-rata diameter koloni

bakteri. Jika nilai indeks kitinolitik sama atau lebih dari 2,0 menunjukkan aktivitas enzim kitinase

yang relatif tinggi.

Uji anti Saprolegnia dilakukan mengikuti prosedur Agustin (2013), yang menginokulasikan

isolat murni bakteri yang memiliki indeks kitinolitik tertinggi ke dalam cawan petri yang berisi

biakan murni Saprolegnia sp. dalam medium PDA. Isolat bakteri kitinolitik digoreskan pada

medium PDA disekeliling jamur dengan jarak 2 cm agar membentuk bidang persegi. Biakan

bakteri dan jamur tersebut diinkubasi selama 4 hari pada suhu 30oC, dan dilanjutkan dengan

pengukuran zona hambat menggunakan jangka sorong digital.

Isolasi DNA genom bakteri kitinolitik yang memiliki aktivitas kitinase dan anti Saprolegnia

tersebut merujuk pada protokol teknis kit Wizard Genomic DNA (Promega, USA). Lebih lanjut

DNA bakteri hasil isolasi tersebut digunakan sebagai template (cetakan) untuk mengamplifikasi

gen penyandi kitinase menggunakan primer ChiE-F

(5’-CTAGACAACTTTTTGTATAGGAGTGTTGATATG-3’) dan ChiE-R

(5’-CGATTGATGAGGGCTAATTATAGTTTTACTTTG-3’) (Usharani dan Gowda, 2010).

Amplifikasi sekuen gen penyandi kitinase dari DNA genom bakteri menggunakan formula

campuran reaksi PCR (Polimerization Chain Reaction) sebagai berikut : 12,5 µL go taq green

master mix; 1,25 µL primer ChiE-F; 1,25 µL primer ChiE-R; 2 µL DNA template dan 8 µL

nuclease free water yang dimasukkan ke dalam mikrotube 0,2 mL. Mikrotube tersebut kemudian

dimasukkan ke thermal cycyler dengan pengaturan program PCR sebagai berikut : pra denaturasi

selama 3 menit pada suhu 94oC; denaturasi selama 1 menit pada suhu 94

oC; annealing selama 40

detik pada suhu 56oC; ekstensi selama 1 menit pada suhu 72

oC dan ekstensi akhir selama 5 menit

pada suhu 72oC, dengan jumlah siklus 32 kali (Agustin, 2013).

Keberadaan fragmen DNA penyandi kitinase dianalisis dengan elektroforesis gel agarose

1% (40 g serbuk agarose dalam 40 mL TBE 0,5 x). Running elektroforesis dilakukan pada 75 volt

selama 70 menit dan dilanjutkan dengan perendaman gel dalam EtBr selama 15 menit serta

pencucian dengan akuades steril selama 10 menit, kemudian dilakukan dokumentasi fragmen hasil

PCR pada UV transilluminator dengan kamera digital. Produk PCR tersebut digunakan sebagai

sampel untuk pengerjaan sekuensing oleh 1 st Base Singapore. Verifikasi sekuen penyandi kitinase

dari isolat bakteri asal limbah udang dan isolat bakteri asal limbah kepiting menggunakan Blast-X

berdasar sekuen asam amino serta program SIB Expasy untuk analisis domain fungsional sekuen

penyandi tersebut.

Hasil dan Pembahasan

Kultur murni bakteri kitinolitik

Bakteri dengan indeks kitinolitik tertinggi asal limbah udang dan kepiting telah berhasil

diisolasi dan diseleksi menjadi kultur murni dengan teknik streak plate (metode gores)

menggunakan jarum ose. Isolat bakteri kitinolitik asal limbah udang (isolat B1) dan isolat asal

limbah kepiting (isolat D1) dengan indeks kitinolitik masing-masing 2,12 mm dan 1,99 mm

disajikan dalam Tabel 1.

Tabel 1. Isolat murni bakteri kitinolitik dari limbah udang (B1) dan limbah kepiting (D1).

No Kode Isolat Gambar Warna Koloni

1 B1

Putih


112

2 D1

Putih susu

Sumber : Agustin (2013).

Hasil pemurnian bakteri kitinolitik asal limbah udang dan kepiting yang disajikan pada Tabel

1 menunjukkan isolat bakteri yang berbeda-beda. Pada bakteri yang diisolasi dari limbah udang

terdapat kesamaan warna koloni yaitu berwarna putih (isolat B1). Pada isolat B1 warna putih

bakteri masih terlihat mengikuti goresan ketika bakteri digoreskan.. Pada bakteri yang diisolasi dari

limbah kepiting (isolat D1) terdapat persamaan warna dengan bakteri yang diisolasi dari limbah

udang (isolat B1) yaitu berwarna putih. Apabila diamati lebih jelas, bakteri yang berwarna putih

pada isolat B1 terlihat lebih tebal dibandingkan dengan bakteri yang berwarna putih isolat D1

(warna putih susu).

Menurut Cappuccino dan Sherman (2005), perbedaan warna koloni pada bakteri terjadi

karena pigmen intraseluler yang dihasilkan oleh bakteri. Keberadaan isolat bakteri yang memiliki

keragaman koloni sesuai dengan yang dikemukakan oleh Suryanto dan Munir (2006), bahwa

bakteri kitinolitik memiliki warna putih, dan putih susu. Hal ini sesuai dengan hasil pemurnian

bakteri yang berasal dari limbah udang dan limbah kepiting.

Uji Aktivitas Kitinolitik

Pengujian aktivitas kitinolitik dilakukan untuk mengetahui bakteri mana yang dapat

menghasilkan enzim kitinase dengan menggunakan media yang mengandung kitin. Hal ini

bertujuan untuk melihat zona bening yang dihasilkan bakteri. Hasil pengukuran uji aktivitas

kitinolitik disajikan pada Tabel 2.

Tabel 2. Uji Aktivitas Kitinolitik Isolat Bakteri Asal Limbah Udang dan Kepiting.

Kode Isolat Diameter Zona Bening (mm) Diameter koloni bakteri (mm) Indeks

Kitinolitik

(mm) I II Rata-rata I II Rata-rata

B1 12,05 13,01 12,53 6,05 5,94 5,9 2,12

D1 11,39 10,45 10,92 5,25 5,71 5,48 1,99

Sumber : Agustin (2013).

Zona bening di sekitar koloni bakteri (Gambar 1) terbentuk akibat produksi enzim kitinase

yang disekresikan keluar oleh sel bakteri untuk memecah makromolekul kitin (medium agar kitin)

menjadi molekul kitin yang lebih kecil. Molekul kitin tersebut dimanfaatkan sel bakteri sebagai

sumber karbon dan energi (Gal et al., 2009).

Zona bening

Koloni bakteri

Gambar 1. Hasil Pengujian Aktivitas Kitinolitik.


113

Aktivitas kitinolitik bakteri dalam pemutusan ikatan β-1-4-glikosidik pada kitin di dalam

medium agar kitin menghasilkan produk hidrolisis N-asetil-D-glukosamin yang merupakan

oligomer pendek, ditandai dengan terbentuknya zona bening di sekitar koloni, mengindikasikan

terdegradasinya ikatan senyawa kitin (Nasran dkk., 2003). Hasil penelitian Zhong at al. (1997),

menunjukkan bahwa bakteri kitinolitik mampu menghidrolisis kitin yang akan dimanfaatkan

sebagai sumber karbon. Penggunaan koloidal kitin pada uji aktivitas kitinolitik sangat dianjurkan,

oleh karena koloidal kitin merupakan penginduksi efektif bagi kitinase sehingga substrat tersebut

lebih mudah dihidrolisis (Tsujibo et al., 1999).

Uji anti Saprolegnia

Pengujian terhadap aktivitas bakteri kitinolitik dalam menghambat pertumbuhan jamur

Saprolegnia dilakukan dengan mengukur zona hambat di sekitar koloni setelah inokulum bakteri

digoreskan di sekeliling biakan Saprolegnia dengan jarak 2 cm hingga membentuk bidang persegi.

Hasil pengukuran zona hambat bakteri (Gambar 2) terhadap pertumbuhan Saprolegnia sebesar

6,005 mm (isolat B1 asal limbah udang) dan sebesar 11,59 mm (isolat D1 asal limbah kepiting)

disajikan dalam Tabel 3.

Zona hambat Saprolegnia

Gambar 2. Zona hambat bakteri sebagai anti Saprolegnia pada isolat B1 dan D1 (tanda panah merah).

Kemampuan bakteri kitinolitik baik yang berrasal dari limbah udang maupun limbah

kepiting efektif dalam menghentikan pertumbuhan Saprolegnia yang tidak dapat tumbuh di sekitar

koloni bakteri (terisolir di dalam goresan persegi), seperti terlihat pada Gambar 2. Isolat bakteri

asal limbah kepiting (isolat D1) memiliki anti Saprolegnia relatif tinggi dari pada bakteri asal

limbah udang (isolat B1) yang ditunjukkan dengan zona hambat tertinggi (11,59 mm) terhadap

pertumbuhan Saprolegnia. Bukti ini juga diperoleh dari penelitian Huang et al. (2005), bahwa

kitinase dari B. cereus strain 28-9 menunjukkan 84% penghambatan pertumbuhan miselium dan

hifa jamur Saprolegniai sp.

Aktivitas kitinolitik bakteri tersebut ditandai dengan ketidakmampuan hifa jamur

Saprolegnia untuk tumbuh melewati goresan inokulum koloni bakteri (Agustin, 2013).

Penghambatan pertumbuhan Saprolegnia ini disebabkan sekresi kitinase oleh koloni bakteri yang

mendegradasi dinding sel hifa jamur yang banyak mengandung kitin sebagai penyusun utama

dinding sel jamur (Patil et al., 2000 ; Huang et al., 2005).

Isolasi DNA genom bakteri

Hasil isolasi DNA yang berasal dari bakteri kitinolitik asal limbah udang (isolat B1) dan asal

limbah kepiting (isolat D1) setelah running elektroforesis gel agarose 1% disajikan dalam Gambar 3.


114

M A1 A2 B2 B1 D2 D1

Gambar 3. Isolat DNA genom bakteri kitinolitik.

Keterangan : M = marker DNA ladder 1 kb

A1 dan A2 = isolat DNA bakteri asal limbah udang (zona hambat rendah)

B2 = isolat DNA bakteri asal limbah udang (zona hambat rendah)

D2 = isolat DNA bakteri asal limbah kepiting (zona hambat rendah)

B1 = isolat DNA bakteri asal limbah udang (zona hambat tinggi)

D1 = isolat DNA bakteri asal limbah kepiting (zona hambat tinggi)

Berdasarkan ukuran fragmen dari marker DNA ladder 1 kb, DNA mengandung ekson dan

intron, sehingga ukuran fragmennya relatif panjang ( di atas pita 10.000 bp dari marker). Dengan

demikian fragmen DNA genom dari bakteri isolat B1 dan D1 terdeteksi melalui gel agarose 1%

(Gambar 3). Hasil isolasi dari isolat B1 dan D1 (zona hambat tinggi) tersebut selanjutnya

digunakan sebagai DNA template untuk primer ChiE-F dan ChiE-R dalam amplifikasi gen

penyandi kitinase.

Amplifikasi dan sekuensing gen penyandi kitinase

Amplikon yang dihasilkan dalam proses PCR menggunakan primer ChiE-F dan ChiE-R

berukuran sekitar 1200 bp yang mengandung sekuen gen penyandi kitinase dari bakteri isolat B1

dan D1 (Gambar 4).

bp

1200 bp (gen penyandi kitinase)

Gambar 4. Amplikon gen penyandi kitinase isolat bakteri B1 dan D1. Keterangan : M = marker DNA ladder 1 kb

B1 = fragmen gen kitinase dari isolat bakteri kitinolitik asal limbah udang

C1 = fragmen gen kitinase dari isolat bakteri kitinolitik asal limbah udang (zona hambat

Saprolegnia rendah)

D1 = fragmen gen kitinase dari isolat bakteri kitinolotik asal limbah kepiting

10.000

bp

250

bp

DNA genom bakteri

bp


115

Ukuran fragmen penyandi kitinase (1200 bp) dari isolat B1 dan D1 ini (Gambar 4) juga

relatif sama dengan ukuran fragmen kitinase dari Bacillus thuringiensis hasil penelitian Usharani

dan Gowda (2010) sebesar 1129 bp. Dengan demikian sekuen penyandi enzim kitinase dari bakteri

asal limbah udang dan kepiting telah berhasil diamplifikasi. Produk PCR amplikon kitinase ini

selanjutnya digunakan sebagai sampel untuk proses sekuensing.

Analisis bioinformatik sekuen penyandi kitinase

Gen penyandi kitinase dari isolat bakteri asal limbah udang dari arah forward (Gambar 5)

memiliki kemiripan dengan sekuen asam amino residu yang terdapat pada bankgen yang

menyandikan protein enzim kitinase. Hasilnya 96% identik dengan sekuen asam amino penyandi

eksokitinase dari Bacillus thuringiensis (nomor aksesi YP003665928.1). Berdasarkan homologi

sekuen penyandi kitinase tersebut, maka isolat bakteri kitinolitik yang memiliki anti Saprolegnia

asal limbah udang adalah Bacillus thuringiensis (isolat B1).

1 st BASE_1233191_B1_B_F

TAAAAGTTCAATTTTTTTGTTGTATTTTAGTAATGTTCTTACTTCTACCGCTATCCCCTTTCCAAG

CACAAGCAGCAAACAATTTAGGTTCAAAATTACTCGTTGGATATTGGCATAACTTTGATAACGG

TACTGGCATTATTAAATTAAAAGACGTTTCACCAAAATGGGATGTAATCAATGTATCTTTTGGT

GAAACTGGTGGTGATCGTTCCACTGTTGAATTTTCTCCTGTGTATGGTACAGATGCAGACTTCAA

ATCAGATATTTCTTATTTAAAAAGTAAAGGAAAGAAAGTAGTTCTTTCAATAGGTGGACAAAAT

GGAGTCGTTTTACTTCCTGACAATGCCGCTAAGGATCGTTTTATTAATTCCATACAGTCTCTAAT

CGATAAATACGGTTTTGATGGAATAGATATTGACCTTGAATCAGGTATTTACTTAAACGGAAAT

GATACTAATTTCAAAAATCCAACTACTCCCCAAATCGTAAATCTTATATCAGCTATTCGAACAA

TCTCAGATCATTATGGTCCAGATTTTCTATTAAGCATGGCTCCTGAAACAGCTTATGTTCAAGGC

GGTTATAGCGCATATGGAAGCATATGGGGTGCATATTTACCAATTATTTACGGAGTGAAAGATA

AACTAACATACATTCATGTTCAACACTACAACGCTGGTAGCGGGATTGGAATGGACGGTAATAA

CTACAATCAAGGTACTGCAGACTACGAGGTCGCTATGGCAGATATGCTCTTACATGGTTTTCCT

GTAGGTGGTAATGCAAATAACATTTTCCCAGCTCTTCGTTCAGATCAAGTCATGATTGGGCTTCC

AGCAGCACCAGCGGCAGCTCCAAGTGGTGGATACATTTCGCCAACTGAAATGAAAAAAGCTTT

AAATTATATCATTAAAGGAGTTCCGTTCGGAGGAAAGTATAAACTTTCTAACCAGAGTGGCTAT

CCTGCATTCCGCGGCCTAATGTCTTGGTCTATTAATTGGGATGCAAAAAACAACTTCGAATTCTC

AAATAACTATAGAACATATTTTGATGGTCTTTCCTTGCAAAATAACAAAGTAAACTATATTACC

CCCCCCTACCAATCGAAA

Gambar 5. Sekuen kitinase B. thuringiensis (isolat B1) arah forward.

Urutan asam amino yang diperoleh dari hasil sekuensing fragmen penyandi kitinase bakteri

kitinolitik (isolat B1) menggunakan primer spesifik ChiE-F dan ChiE-R setelah disejajarkan

menggunakan program blastx dengan sekuen asam amino gen kitinase pada bank gen hasilnya 99%

identik dengan asam amino penyandi eksokitinase B. thuringiensis (Gambar 6).

exochitinase [Bacillus thuringiensis BMB171]

Sequence ID: ref|YP_003665928.1|Length: 360Number of Matches: 1 Gene-associated gene details

Range 1: 4 to 359GenPeptGraphics

Alignment statistics for match #1

Score Expect Method Identities Positives Gaps Frame

700 bits(1807) 0.0 Compositional matrix adjust. 354/356(99%) 355/356(99%) 0/356(0%) +3

Query 3 KVQFFCCILVMFLLLPLSPFQAQAANNLGSKLLVGYWHNFDNGTGIIKLKDVSPKWDVIN 182

K +FFCCILVMFLLLPLSPFQAQAANNLGSKLLVGYWHNFDNGTGIIKLKDVSPKWDVIN

Sbjct 4 KFKFFCCILVMFLLLPLSPFQAQAANNLGSKLLVGYWHNFDNGTGIIKLKDVSPKWDVIN 63

Query 183 VSFGETGGDRSTVEFSPVYGTDADFKSDISYLKSKGKKVVLSIGGQNGVVLLPDNAAKDR 362

VSFGETGGDRSTVEFSPVYGTDADFKSDISYLKSKGKKVVLSIGGQNGVVLLPDNAAKDR

Sbjct 64 VSFGETGGDRSTVEFSPVYGTDADFKSDISYLKSKGKKVVLSIGGQNGVVLLPDNAAKDR 123

Query 363 FINSIQSLIDKYGFDGIDIDLESGIYLNGNDTNFKNPTTPQIVNLISAIRTISDHYGPDF 542

FINSIQSLIDKYGFDGIDIDLESGIYLNGNDTNFKNPTTPQIVNLISAIRTISDHYGPDF

Sbjct 124 FINSIQSLIDKYGFDGIDIDLESGIYLNGNDTNFKNPTTPQIVNLISAIRTISDHYGPDF 183

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/296504228?report=genbank&log$=protalign&blast_rank=1&RID=VWYAWUPG01R

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene?term=296504228%5bPUID%5d%20OR%20296325280%5bPUID%5d&RID=VWYAWUPG01R&log$=genealign&blast_rank=1

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/296504228?report=genbank&log$=protalign&blast_rank=1&RID=VWYAWUPG01R&from=4&to=359




116

Query 543 LLSMAPETAYVQGGYSAYGSIWGAYLPIIYGVKDKLTYIHVQHYNAGSGIGMDGNNYNQG 722

LLSMAPETAYVQGGYSAYGSIWGAYLPIIYGVKDKLTYIHVQHYNAGSGIGMDGNNYNQG

Sbjct 184 LLSMAPETAYVQGGYSAYGSIWGAYLPIIYGVKDKLTYIHVQHYNAGSGIGMDGNNYNQG 243

Query 723 TADYEVAMADMLLHGFPVGGNANNIFPALRSDQVMIGLpaapaaapSGGYISPTEMKKAL 902

TADYEVAMADMLLHGFPVGGNANNIFPALRSDQVMIGLPAAPAAAPSGGYISPTEMKKAL

Sbjct 244 TADYEVAMADMLLHGFPVGGNANNIFPALRSDQVMIGLPAAPAAAPSGGYISPTEMKKAL 303

Query 903 NYIIKGVPFGGKYKLSNQSGYPAFRGLMSWSINWDAKNNFEFSNNYRTYFDGLSLQ 1070

NYIIKGVPFGGKYKLSNQSGYPAFRGLMSWSINWDAKNNFEFSNNYRTYFDGLSLQ

Sbjct 304 NYIIKGVPFGGKYKLSNQSGYPAFRGLMSWSINWDAKNNFEFSNNYRTYFDGLSLQ 359

Gambar 6. Homologi sekuen kitinase isolat B1 dengan B. thuringiensis (no.aksesi YP003665928.1) (query =

sekuen sampel ; subject = sekuen bankgen).

Didasarkan atas sekuen asam amino pada domain glycosyl hydrolase (Henrissat, 1991),

penggolongan kitinase dan N-acylhexosaminidase dibagi ke dalam tiga famili yaitu

GH18_chitinase; GH19_chitinase dan GH20_chitinase. Baik famili chitinase 18 dan 19 merupakan

penyusun eksokitinase berbagai virus, bakteri dan fungi (jamur). Atas dasar hal ini, maka domain

glycosyl hydrolase isolat bakteri B1 asal limbah udang termasuk dalam famili GH18_chitinase

(Gambar 7).

Gambar 7. Famili kitinase B. thuringiensis asal limbah udang berdasar domain glycosyl hydrolase.

Domain fungsional yang berperan penting dalam mempercepat reaksi kerja enzim kitinase

adalah domain katalitik yang mendegradasi kitin sehingga mampu melarutkan secara sempurna

dinding sel berbagai jamur, termasuk Saprolegnia (sebagai anti Saprolegnia) (Dahiya et al., 2006).

Pada hasil analisis domain fungsional gen penyandi kitinase dari B. thuringiensis (isolat B1) asal

limbah udang dengan program InterProScan (Gambar 8), diperoleh hasil bahwa sekuen asam

amino ke-24 sampai asam amino ke-345 merupakan sekuen domain katalitik enzim yang berkaitan

dengan aktivitas glycosyl hydrolase yang bekerja mengkatalisis asam melibatkan residu-residu

karboksil (Barboza-Corona et al., 2003).

Gambar 8. Domain katalitik B. thuringiensis (isolat B1) (garis tebal warna biru, PF00704

*).

Keterangan * = PF0074-Glycoside hydrolase, catalytic domain


117

Secara detail posisi urutan asam amino domain katalitik dari gen penyandi B. thuringiensis

asal limbah udang disajikan dalam Gambar 9, dimulai dari asam amino ke-24 yaitu Asparagin (N)

sampai asam amino ke-345 yakni Arginin (R), yang dianalisis dengan ProtScale SIB Expasy.

ProtScale

User-provided sequence:

67 10 20 24 30 40 50 60

KVQFFCCILV MFLLLPLSPF QAANNLGSKL LVGYWHNFDN GTGIIKLKDV SPKWDVINVS

***** ********** *****

70 80 90 100 110 120

FGETGGDRST VEEFSPVYGT DADFKSDISY LKSKGKKVVL SIGGQNGVVL LPDNAAKDRF

130 133 140 141 150 160 170 180

INSIQSLIDK YGFDGIDIDL ESGIYLNGND TNFKNPTTPQ IVNLISAIRT SDHYGPDFLL # # #

190 200 210 220 230 240

SMAPETAYVQ GGYSAYGSIW GAYLPIIYGV KDKLTYIHVQ HYNAGSGIGM DGNNYNQGTA

250 260 270 280 290 300

DDYEVAMADM LLHGFPVGGN ANNIFPALRS DQVMILPAAP AAAPSGGYIS PTEMKKALNY

310 320 330 340 345 350

IIKGVPFGGK YKLSNQSGYP AFRGLMSWSI NWDAKNNFEF SNNYRTYFDG LSLQ

SEQUENCE LENGTH: 354

Gambar 9. Domain katalitik kitinase B. thuringiensis asal limbah udang (huruf merah tebal).

Tapak aktiv pengikatan kitin (FDGIDIDLE) pada domain katalitik kitinase pada Gambar 9

di atas ditemukan pada asam amino posisi ke-133 (Phenil alanine, F) sampai asam amino ke-141

(Glutamic acid, E) berdasarkan analisis dengan program ProSite SIB Expasy (huruf merah yang

sangat tebal pada Gambar 9). Tiga residu asam amino DDE (Aspartic acid-137; Aspartic acid-139;

Glutamic acid-141, tanda # Gambar 9) terlibat dalam mempercepat reaksi kerja enzim katalitik

kitinase Bacillus sp. pada ekstrak cangkang kepiting (Serratia marcescens), dan tiga residu asam

amino tersebut konserf dengan kitnase Bacillus circulans; B. licheniformis; B. thuringiensis dan B.

cereus (Zhong et al., 2005). Dua asam amino Cysteine (C) yang terlibat dalam pembentukan ikatan

disulfida molekul kitinase (Zhong et al., 2005), terletak pada urutan ke-6 dan ke-7 pada Gambar 9.

Domain fungsional lain, yaitu sinyal peptida (KVQFFCCILVMFLLLPLSPFQAQAAN) yang penting

dalam menginisasi sintesis protein berupa kitinase tersebut diprediksi berada pada posisi asam

amino ke-1 hingga asam amino ke-24 (huruf dalam kotak pada Gambar 9) berdasarkan program

SignalP 4.1 server. Domain situs N-glikosilasi (program NetNGlyc 1.0 server) dalam sekuen

penyandi kitinase B. thuringiensis asal limbah udang juga ditemukan konserf pada strain Bacillus

lain, terdapat pada posisi asam amino ke-149 sampai ke-152 (NDTN yang diarsir Gambar 9). N-

glikosilasi ini penting sebagai sinyal untuk transpor protein ke permukaan sel (Degani et al., 2006).

Khusus untuk memprediksi domain situs helix (terutama transmembrane helix) dengan program

HMMTOP SIB Expasy sangat diperlukan, karena situs tersebut berperan dalam pembentukan

struktur sekunder protein enzim kitinase. Hasil prediksi situs helix (CCILVMFLLPLSPFQANN)

pada sekuen penyandi kitinase bakteri isolat asal limbah udang ditemukan pada asam amino ke-6

sampai ke-25 (tanda * Gambar 9). Situs helix ini penting untuk aktivitas fungsional enzim kitinase,

dan umumnya memiliki homologi tinggi diantara strain bakteri Bacillus.

Hasil sekuensing gen penyandi isolat bakteri kitinolitik asal limbah kepiting (arah forward)

yang disajikan dalam Gambar 10 memiliki keidentikan relatif tinggi (99%) dengan sekuen

penyandi kitinase Bacillus cereus (no. aksesi WP000932552.1). Hal ini memberi keyakinan bahwa

isolat bakteri asal limbah udang (isolat D1) adalah B. cereus, didasarkan atas keidentikan sekuen


118

penyandi gen kitinase isolat tersebut dengan gen kitinase dari strain bakteri yang sama pada

bankgen.

1 st BASE_1233189_D1_B_F

AAAAAGTTCAATTTTTTTGTTGTATTTTAGTAATGTTCTTACTTCTACCGCTATCCCCTTTCCAAG

CACAAGCAGCAAACAATTTAGGTTCAAAATTACTCGTTGGATATTGGCATAACTTTGATAACGG

TACTGGCATTATTAAATTAAAAGACGTTTCACCAAAATGGGATGTAATCAATGTATCTTTTGGT

GAAACTGGTGGTGATCGTTCCACTGTTGAATTTTCTCCTGTGTATGGTACAGATGCAGACTTCAA

ATCAGATATTTCTTATTTAAAAAGTAAAGGAAAGAAAGTAGTTCTTTCAATAGGTGGACAAAAT

GGAGTCGTTTTACTTCCTGACAATGCCGCTAAGGATCGTTTTATTAATTCCATACAGTCTCTAAT

CGATAAATACGGTTTTGATGGAATAGATATTGACCTTGAATCAGGTATTTACTTAAACGGAAAT

GATACTAATTTCAAAAATCCAACTACTCCCCAAATCGTAAATCTTATATCAGCTATTCGAACAA

TCTCAGATCATTATGGTCCAGATTTTCTATTAAGCATGGCTCCTGAAACAGCTTATGTTCAAGGC

GGTTATAGCGCATATGGAAGCATATGGGGTGCATATTTACCAATTATTTACGGAGTGAAAGATA

AACTAACATACATTCATGTTCAACACTACAACGCTGGTAGCGGGATTGGAATGGACGGTAATAA

CTACAATCAAGGTACTGCAGACTACGAGGTCGCTATGGCAGATATGCTCTTACATGGTTTTCCT

GTAGGTGGTAATGCAAATAACATTTTCCCAGCTCTTCGTTCAGATCAAGTCATGATTGGGCTTCC

AGCAGCACCAGCGGCAGCTCCAAGTGGTGGATACATTTCGCCAACTGAAATGAAAAAAGCTTT

AAATTATATCATTAAAGGAGTTCCGTTCGGAGGAAAGTATAAACTTTCTAACCAGAGTGGCTAT

CCTGCATTCCGCGGCCTAATGTCTTGGTCTATTAATTGGGATGCAAAAAACAACTTCGAATTCTC

AAATAACTATAGAACATATTTTGATGGTCTTTCCTTGCAAAATAACAAAGTAAACTATATAGCC

CCCCCTACAATCGAACC

Gambar 10. Sekuen gen penyandi kitinase bakteri limbah kepiting (arah forward).

Hasil pensejajaran (alignment) sekuen penyandi kitinase bakteri asal limbah kepiting

(Gambar 10) dengan sekuen bankgen dengan program blastx untuk menentukan strain bakteri,

diperoleh keidentikan sebesar 99% dengan kitinase dari B. cereus (Gambar 11).

chitinase [Bacillus cereus]

Sequence ID: ref|WP_000932552.1|Length: 360Number of Matches: 1

Related Information

Range 1: 4 to 359GenPeptGraphics

Alignment statistics for match #1

Score Expect Method Identities Positives Gaps Frame

700 bits(1807) 0.0 Compositional matrix adjust. 354/356(99%) 354/356(99%) 0/356(0%) +3

Query 3 KVQFFCCILVMFLLLPLSPFQAQAANNLGSKLLVGYWHNFDNGTGIIKLKDVSPKWDVIN 182

K FFCCILVMFLLLPLSPFQAQAANNLGSKLLVGYWHNFDNGTGIIKLKDVSPKWDVIN

Sbjct 4 KFNFFCCILVMFLLLPLSPFQAQAANNLGSKLLVGYWHNFDNGTGIIKLKDVSPKWDVIN 63

Query 183 VSFGETGGDRSTVEFSPVYGTDADFKSDISYLKSKGKKVVLSIGGQNGVVLLPDNAAKDR 362

VSFGETGGDRSTVEFSPVYGTDADFKSDISYLKSKGKKVVLSIGGQNGVVLLPDNAAKDR

Sbjct 64 VSFGETGGDRSTVEFSPVYGTDADFKSDISYLKSKGKKVVLSIGGQNGVVLLPDNAAKDR 123

Query 363 FINSIQSLIDKYGFDGIDIDLESGIYLNGNDTNFKNPTTPQIVNLISAIRTISDHYGPDF 542

FINSIQSLIDKYGFDGIDIDLESGIYLNGNDTNFKNPTTPQIVNLISAIRTISDHYGPDF

Sbjct 124 FINSIQSLIDKYGFDGIDIDLESGIYLNGNDTNFKNPTTPQIVNLISAIRTISDHYGPDF 183

Query 543 LLSMAPETAYVQGGYSAYGSIWGAYLPIIYGVKDKLTYIHVQHYNAGSGIGMDGNNYNQG 722

LLSMAPETAYVQGGYSAYGSIWGAYLPIIYGVKDKLTYIHVQHYNAGSGIGMDGNNYNQG

Sbjct 184 LLSMAPETAYVQGGYSAYGSIWGAYLPIIYGVKDKLTYIHVQHYNAGSGIGMDGNNYNQG 243

Query 723 TADYEVAMADMLLHGFPVGGNANNIFPALRSDQVMIGLpaapaaapSGGYISPTEMKKAL 902

TADYEVAMADMLLHGFPVGGNANNIFPALRSDQVMIGLPAAPAAAPSGGYISPTEMKKAL

Sbjct 244 TADYEVAMADMLLHGFPVGGNANNIFPALRSDQVMIGLPAAPAAAPSGGYISPTEMKKAL 303

Query 903 NYIIKGVPFGGKYKLSNQSGYPAFRGLMSWSINWDAKNNFEFSNNYRTYFDGLSLQ 1070

NYIIKGVPFGGKYKLSNQSGYPAFRGLMSWSINWDAKNNFEFSNNYRTYFDGLSLQ

Sbjct 304 NYIIKGVPFGGKYKLSNQSGYPAFRGLMSWSINWDAKNNFEFSNNYRTYFDGLSLQ 359

Gambar 11. Sekuen penyadi kitinase Bacillus cereus (arah forward) asal limbah kepiting.

(query = sekuen sampel ; subject = sekuen bankgen)

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/446855296?report=genbank&log$=protalign&blast_rank=2&RID=VWXZBEA7015

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/446855296?report=genbank&log$=protalign&blast_rank=2&RID=VWXZBEA7015&from=4&to=359




119

Khusus untuk mendeterminasikan penggolongan famili kitinase isolat B. cereus asal limbah

kepiting didasarkan atas glycosyl hydrolase dan N-acylhexosaminidase menggunakan program

blastn dan hasilnya diperoleh bahwa sekuen kitinase B. cereus tersebut termasuk famili GH18

chitinase (Gambar 12).

Putative conserved domains have been detected, click on the image below for detailed results.

Gambar 12. Famili kitinase Bacillus cereus asal limbah udang berdasar domain glycosyl hydrolase.

Hasil analisis gen penyandi kitinase bakteri asal limbah kepiting (Gambar 11) dengan

InterProScan untuk mendeterminasi domain fungsional, ditunjukkan bahwa domain katalitik, tapak

aktiv pengikatan kitin, sinyal peptida dan daerah transmembran dari sekuen tersebut dapat dideteksi

(Gambar 13).

Gambar 13. Domain fungsional kitinase B. cereus limbah kepiting (glycoside hydrolase, catalytic domain;

glycoside hydrolase, chitinase active site; signal-P; transmembran regions).

Posisi domain katalitik kitinase bakteri asal limbah kepiting (Gambar 13) dapat ditentukan

dari urutan detail asam aminonya menggunakan program ProScale SIB Expasy yang disajikan pada

Gambar 14. Domain ini terletak pada sekuen asam amino ke-24 sampai asam amino ke-345 (huruf

biru tebal) dan posisi domain katalitik ini sama dengan posisi asam amino pada B. thuringiensis

asal limbah udang (Gambar 9). Tapak aktif dari domain katalitik (DDE) tersebut terletak pada

urutan asam amino ke-138 ; ke-140 dan ke-142 (DDE pada Gambar 9).

ProtScale

User-provided sequence: 10 20 30 40 50 60

KVQFFCCILV MFLLLPLSPF QAQAANNLGS KLLVGYWHNF DNGTGIIKLK DVSPKWDVIN

70 80 90 100 110 120

VSFGETGGDR STVEFSPVYG TDADFKSDIS YLKSKGKKVV LSIGGQNGVV LLPDNAAKDR

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi?RID=VWV6RCRE01R&mode=all


120

130 140 150 160 170 180

FINSIQSLID KYGFDGIDID LESGIYLNGN DTNFKNPTTP QIVNLISAIR TISDHYGPDF

190 200 210 220 230 240

LLSMAPETAY VQGGYSAYGS IWGAYLPIIY GVKDKLTYIH VQHYNAGSGI GMDGNNYNQG

250 260 270 280 290 300

TADYEVAMAD MLLHGFPVGG NANNIFPALR SDQVMIGLPA APAAAPSGGY ISPTEMKKAL

310 320 330 340 350 360

NYIIKGVPFG GKYKLSNQSG YPAFRGLMSW SINWDAKNNF EFSNNYRTYF DGLSLQNNKV

NYIAPP

SEQUENCE LENGTH: 366

Gambar 14. Domain fungsional gen penyandi kitinase B. cereus asal limbah kepiting.

Keterangan : AANNLGSKLLVGYWHNFDNGTGIIKLKDVSPKWDVINVSFGETGGDRSTVEFSPVYGTDADFKSDISYLKSKG

KVVLSIGGQNGVVLLPDNAAKDRFINSIQSLIDKYGFDGIDIDLESGIYLNGNDTNFKNPTTPQIVNLISAIR

TISDHYGPDFLLSMAPETAYVQGGYSAYGSIWGAYLPIIYGVKDKLTYIHVQHYNAGSGIGMDGNNYNQG

TADYEVAMADMLLHGFPVGGNANNIFPALRSDQVMIGLPAAPAAAPSGGYISPTEMKKALNYIIKGVPFG

GKYKLSNQSGYPAFRGLMSWSINWDAKNNFEFSNN = domain katalitik

FDGIDIDLE = tapak aktiv pengikatan kitin

NDTN = N-glikosilasi

CCILVMFLLLPLSPFQAQAA = transmembran helix

CC = 2 residu Cysteine

KVQFFCCILVMFLLLPLSPFQAQA = Sinyal peptida

Tapak aktif pengikatan kitin pada sekuen penyandi kitinase B. cereus isolat bakteri asal

limbah kepiting (Gambar 14), terletak pada urutan asam amino ke-132 sampai asam amino ke-142

yang berbeda posisi asam amino pada B. thuringiensis (isolat asal limbah udang) pada urutan

ke-133 sampai ke-141 (Gambar 9). Domain N-glikosilasi yang berperan dalam transpor protein ke

permukaan sel terletak pada sekuen asam amino ke-150 sampai asam amino ke-153 pada sekuen

kitinase B. cereus asal limbah kepiting (Gambar 14), dan posisi domain ini berbeda dengan B.

thuringiensis asal limbah udang yang terletak pada asam amino ke-149 sampai ke-152). Domain

sinyal peptida yang penting dalam permulaan sintesis enzim, terletak pada asam amino ke-1 sampai

asam amino ke-24 pada sekuen kitinase B. cereus asal limbah kepiting (Gambar 14). Posisi domain

ini, berbeda dengan posisi domain sinyal peptida pada B. thuringiensis asal limbah kepiting yang

terletak pada asam amino urutan ke-6 sampai ke-25 (Gambar 9). Situs sinyal peptida ini juga sama

letaknya dengan posisi domain sinyal peptida pada B. thuriengiensis yang berasal dari ekstrak

cangkang kepiting (Serratia marcescens) dari hasil penelitian Perrakis et al. (1994), yang

menunjukkan bahwa domain tersebut konserf (tidak mudah mengalami mutasi).

Dua asam amino Cysteine (C) terletak pada asam amino ke-6 dan ke-7 (Gambar 14) penting

dalam pembentukan ikatan disulfida untuk integritas struktural molekul dan terlibat dalam aktivitas

biologis ensim kitinase (Yang et al., 2005). Domain fungsional lain yang penting yaitu domain

helix yang berperan dalam pembentukan struktur sekunder protein kitinase, terletak pada asam

amino urutan ke-6 sampai urutan ke-25 pada sekuen kitinase B. cereus asal limbah kepiting, dan

domain helix ini terletak pada posisi yang sama dengan yang ada pada B. thuringiensis. Adanya

perbedaan posisi domain-domain fungsional pada sekuen penyandi kitinase dari isolat bakteri asal

limbah udang dan asal limbah kepiting ini membuktikan perbedaan strain pada spesies Bacillus tersebut. Visualisasi struktur tiga dimensi protein kitinase dari bakteri asal limbah udang (B.

thuringiensis) dan bakteri asal limbah kepiting (B. cereus) berdasarkan sekuen asam amino

penyandi gen kitinase disajikan pada Gambar 15 yang menunjukkan perbedaan struktur molekul

enzim akibat adanya perbedaan asam amino penyusunnya (Tabel 3).


121

Tabel 3. Komposisi asam amino penyusun kitinase B. thuringiensis dan B. cereus.

Jumlah Jenis bakteri

Asam amino penyusun Bacillus thuringiensis Bacillus Cereus

Lysine

Valine

Glutamine

Phenylalanine

Cysteine

Leucine

Proline

Methionine

Serine

Tyrosine

Threonine

Arginine

Asparagine

Glycine

Aspartic acid

Tryptophan

Histidine

Alanine

Glutamic acid

Isoleucine

20

19

19

19

2

30

13

7

22

18

10

5

26

33

21

4

5

25

5

27

19

17

10

19

2

28

17

5

24

17

10

3

25

35

20

4

5

23

7

27

Khusus untuk analisis prediksi gambar tiga dimensi dari struktur protein penyandi enzim

kitinase dapat diakses melalui situs swissmodel.espasy.org menggunakan software SWISS

MODEL secara online.

(A). Bacillus thuringiensis (B). Bacillus cereus

Gambar 15. Struktur Tiga Dimensi Enzim Kitinase Bacillus thuringiensis (A) dan Bacillus cereus (B) pada

sekuen asam amino arah forward. Tanda lingkaran merah tebal merupakan struktur molekul

yang berbeda.

Pada Gambar 15 terdapat perbedaan struktur molekul enzim kitinase dari dalam sekuen

penyandi enzim tersebut arah forward untuk isolat dari limbah udang (B. thuringiensis) dan asal

limbah kepiting (B. cereus) dikarenakan adanya perbedaan jumlah dari masing-masing asam amino

penyusunnya (Tabel 3).

Kesimpulan

Berdasarkan hasil penelitian dapat ditarik beberapa kesimpulan sebagai berikut :

1. Indeks kitinolitik isolat murni bakteri asal limbah udang dan kepiting relatif cukup

tinggi (2,12 mm dan 1,99 mm)

2. Anti Saprolegnia yang diinterprestasikan dengan zona hambat menunjukkan bahwa

isolat murni bakteri limbah udang (11,59 mm) lebih tinggi dibanding asal limbah

kepiting (6,005 mm)


122

3. Ukuran amplikon gen penyandi kitinase bakteri limbah udang dan kepiting sama

(1200 bp), dan 96% sekuen kitinase bakteri limbah udang identik dengan Bacillus

thuringiensis (no. aksesi YP003665928.1) serta 99% sekuen kitinase bakteri limbah

kepiting identik dengan Bacillus cereus (no. aksesi WP000932552.1)

4. Karakter molekuler kitinase Bacillus dicirikan dengan 6 domain fungsional yaitu situs

katalitik, tapak aktiv pengikatan kitin, sinyal peptida, N-glikosilasi , dua residu

Cysteine dan helix transmembran

5. Perbedaan struktur tiga dimensi molekul kitinase B. thuringiensis dan B. cereus

berkaitan dengan perbedaan jumlah masing-masing asam amino penyusunnya.

Ucapan terima kasih

Penulis mengucapkan terima kasih yang sebesarnya kepada tim peneliti (saudara Hanif dan

Bapak Roffi Grandiosa) atas perhatian dan kerjasama dalam penelitian ini.

Daftar Pustaka

Agustin, H.S.W. 2013. Analisis potensi bakteri kitinolitik asal limbah udang dan kepiting kandidat penghasil

enzim kitinase serta anti jamur Saprolegnia sp. menggunakan marka molekuler gen 16S rRNA.

Laporan skripsi. Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Padjadjaran. 88 hlm.

Barboza-Corona, J.E., E. Nicto-Marzzoco, R. Vela’zque-Robledo, R. Salcedo-Harnandez, M. Bautista.

2003. Cloning, sequencing and expression of the chitinase gene chiA74 from Bacillus

thuringiensis. Appl. Environ. Microbiol. 69 : 1023 – 1029.

Bruno, D.W and B.P. Wood. 1999. Saprolegnia and other oomycetes. In: PTK Woo and D.W. Bruno (ed.),

Fish diseases and disorders. Vol.3, viral, bacteria and fungal infections. CABI Pub., Wollingford,

united Kingdom.

Capuccino, J.G and N. Sherman. 2005. Microbiology: a laboratory manual 9 edition. The Cummings Pub.

Comp., Inc., California.

Dahiya, N, R. Tewari and G. Hoondal. 2006. Biotechnological aspects of chitinolytic enzymes: a review.

Applied and Environmental Microbiol., 71 : 773 – 782.

Degani, G., K. Jackson, S. Yom-Din and D. Goldberg. 2006. cDNA cloning and mRNA expression of

growth hormone in Belontiidae (Anabantoidei suborder). The Israeli Journal of Aquaculture

Badmigeh, 58 (2) : 124 – 136.

Gal, S.W., S.W. Lee and Y.J. Choi. 2009. Molecular cloning and characterization of 58kDA chitinase gene

from Serratia marcescens. Biotechnol. Biopress. Eng., 7 : 38 – 42.

Gohel, V., A. Shingh, M. Vimal, D. Ashwini and HS. Chatpar. 2006. Bioprospecting and antifungal

potential of chitinase microorganism. African J Biotechnol., 5 : 54 – 72.

Henrissat, B. and A. Bairoch, H.R. Whiteley. 1991. New families in the classification of glycosyl

hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J., 293 : 781 – 788.

Huang, C.J., T.K. Wang, S.C. Ching and C.Y. Chen. 2005. Identification af an antifungal chitinase from a

potential biocontrol agent, Bacillus cereus strain 28-9. Journal of Biochemistry and Moleculer

Biology, 38 (1) : 82 – 88.

Ilmi, M. 2007. Isolasi dan karakterisasi enzim kitinolitik dari bakteri asal limbah pengolahan udang. Tesis.

Universitas indonesia.

Maria, S.B., M. Walzack, E.L. Porczyk, W. Donderski. 2010. Utilization of shrimp-shell waste as a

substrate for the activitity of chitinases produced by microorganisms. Polish Journal of

environment stud., 19 (1) : 177–182.

Nasran, S., F. Ariyani dan N. Indriyati. 2003. Produksi kitinase dan kitin deasetilase dari Vibrio harveyi. J.

Pen. Perik. Indonesia, 9 (5) : 33–38.

Okay, S and G. Ozcengiz. 2009. Molecular cloning, characterization and homologous expression of an

endochitinase gene from Bacillus thuringiensis serovar morrisoni. Turk. J. Biol., 35 : 1–7.

Patil, R.S., V. Ghormade and M.V. Deshpande. 2000. Chitinolytic enzymes: an exploration. Enzymes and

microbial technology, 26 : 473 – 483.

Perrakis, A., I. Tewes, Z. Dauter, A.B. Oppenheim, I. Chet, K.S. Wilson. 1994. Crystal structure of a

bacterial chitinase at 2.3 Ao resolution. Structure, 2 : 1169–1180.

Suryanto, D dan E. Munir. 2006. Potensi pemanfaatan isolat bakteri kitinolitik lokal untuk pengendalian

hayati jamur. Prosiding seminar hasil penelitian USU. Medan.


123

Tsujibo, H. and H. Orikoshi, C. Imada, Y. Okami and Y. Inamori. 1999. Site-directed mutagenesis of

chitinase from Alteromonas sp. strain O-7. Biosci. Biotech. Biochem., 57 : 1396–1399.

Usharani, T.R. and T.K.S. Gowda. 2010. Cloning of the chitinase gene from Bacillus thuringiensis. Indian

Journal Biotechnol., 10 : 264–269.

Van West, P. 2006. Saprolegnia parasitica, an oomycetes pathogen with a fishy appetite: new challenges for

an old problem. Mycologist, 20 : 99–104.

Wang, S.Y, S.J. Wu, G. Thottappily, R.D. Locy and N.K. Singh. 2001. Molecular cloning and structural

analysis of the gene encoding Bacillus cereus exochitinase chi36. Journal of Bioscience and

Bioengineering, 92 (1) : 59-66.

Yang, S., N. Rattanakit, M. Wakayam and T. Tachiki. 2005. Cloning and expression of Bacillus cereus

gene encoding chitinase I, which participates in protoplast foemation. Biosci. Biotechnol.

Biochem., 69 (3) : 602 – 609.

Zhong, W.F., J.C. Fang, P.Z. Cai, W.Z. Yan, J. Wu and H.F. Guo. 2005. Cloning of the Bacillus

thuringiensis serovar sotto chitinase (Schi) gene and characterization of its protein. Genetics and

Molecular Biology 28 (4) : 821–826.

Karakterisasi Molekuler Gen Penyandi Kitinase Bakteri Asal ...epaper.aquaculture-mai.org/upload/2....

Documents

Transcript of Karakterisasi Molekuler Gen Penyandi Kitinase Bakteri Asal ...epaper.aquaculture-mai.org/upload/2....