isolasi bakteri dan uji aktivitas kitinase termofilik kasar dari sumber ...

ISOLASI BAKTERI DAN UJI AKTIVITAS KITINASE TERMOFILIK KASAR

DARI SUMBER AIR PANAS TINGGI RAJA, SIMALUNGUN

SUMATERA UTARA

TESIS

O l e h

ICHE MARINA DEWI 067030011/BIO

SEKOLAH PASCASARJANA UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN 2008

Iche Marina Dewi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Kitinase Termofilik Kasar Dari Sumber Air Panas Tinggi Raja, Simalungun Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008

ISOLASI BAKTERI DAN UJI AKTIVITAS KITINASE TERMOFILIK KASAR

DARI SUMBER AIR PANAS TINGGI RAJA, SIMALUNGUN

SUMATERA UTARA

TESIS

Untuk Memperoleh Gelar Magister Sains (M.Si) dalam Program Studi Biologi

pada Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera Utara

Oleh

ICHE MARINA DEWI 067030011/BIO

SEKOLAH PASCASARJANA UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN 2008


Judul Tesis : ISOLASI BAKTERI DAN UJI AKTIVITAS KITINASE TERMOFILIK KASAR DARI SUMBER AIR PANAS TINGGI RAJA, SIMALUNGUN SUMATERA UTARA

Nama Mahasiswa : Iche Marina Dewi Nomor Pokok : 067030011 Program Studi : Biologi

Menyetujui Komisi Pembimbing

(Dr. Dwi Suryanto, M.Sc.) (Prof. Dr. Erman Munir, M.Sc.)

Ketua Anggota

Ketua Program Studi, Direktur,

(Dr. Dwi Suryanto, M.Sc.) (Prof. Dr. Ir. T. Chairun Nisa B, M.Sc.)

Tanggal lulus : 26 September 2008


Telah diuji pada

Tanggal : 26 September 2008

PANITIA PENGUJI TESIS

Ketua : Dr.Dwi Suryanto, M.Sc.

Anggota : 1. Prof. Dr. Erman Munir, M.Sc

2. Dr. Delvian, SP.MP

3. Dr. Ir. Eddy Batara Mulya Siregar, MS


ABSTRAK

Isolasi dan pengujian kitinase kasar bakteri termofilik penghasil kitinase telah dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi, FMIPA USU dari Bulan Februari 2008 sampai dengan Juni 2008. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengisolasi dan mengetahui suhu optimum aktifitas kitinase bakteri yang diisolasi dari sumber air panas Tinggi Raja. Lima isolat (TR1, TR2, TR3, TR4, TR5) telah diseleksi untuk pemeriksaan lebih lanjut. TR 4 dan TR 5 menunjukkan suhu optimum dari aktifitas kitinase adalah 60oC dengan melepaskan 0.042 µmol/ml dan 0.030 µmol/ml N-asetilglukosamin,berturut-turut, kemudian TR 2 dan TR 3 menunjukan suhu optimum 65oC dengan melepaskan 0.025 µmol/ml dan 0,019 µmol/ml N-asetilglukosamin. Aktifitas kitinase TR1 belum dapat ditetapkan, sebab pada suhu 70oC aktifitas masih meningkat. Kata kunci : Kitin, Bakteri Kitinase, Bakteri Termofilik, Kitinolitik Termofilik


ABSTRACT

An isolation and examination of crude chitinase of thermofilic bacteria were carried out in Laboratory of Microbiology, Departement of Biologi, FMIPA, USU from Februari to June 2008. The objective of the study was to isolated and to know the optimum temperature of the chitinase activity of bacterial isolates from Tinggi Raja hot spring. Five isolates (TR1, TR2, TR3, TR4, TR5) were selected for futher study. TR4 and TR5 showed optimum temperature of chitinase activity at 60oC by releasing 0.042 µmol/ml and 0.030 µmol/ml N-acetylglucosamine, respectively, while TR2 and TR3 showed optimum temperature at 65oC by releasing 0.025 µmol/ml and 0,019 µmol/ml N-acetylglucosamine, respectively. However, chitinase activity of TR1 have not been determinate yet since by of 70oC the activity was still increase .

Keyword : Chitin, Chitinase bacteria, thermofilic bacteria, chitinolitic thermofilic


UCAPAN TERIMA KASIH

Puji dan syukur saya panjatkan kepada Allah SWT, yang telah memberikan

berkat berlimpah, kesempatan dan kesehatan kepada saya sehingga saya dapat

menyelesaikan tesis yang berjudul, “Isolasi Bakteri dan Uji Aktivitas Kitinase

Termofilik Kasar Dari Sumber Air Panas Tinggi Raja, Simalungun Sumatera Utara.

Tesis ini ditulis untuk memenuhi syarat mendapatkan gelar Magister Sains di Program

Studi S2 Biologi pada Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera Utara Medan.

Dalam penulisan tesis ini, saya banyak mendapat bantuan moril maupun

materil, bimbingan petunjuk, saran-saran serta nasehat yang besar nilainya dalam

penyelesaian tesis ini. Untuk itu perkenankan saya terlebih dahulu mengucapkan terima

kasih banyak yang sedalam-dalamnya kepada :

Ketua Komisi Pembimbing Dr.Dwi Suryanto, M.Sc, yang telah banyak

membimbing dan memberi saran serta dorongan dengankesabaran selama saya

menyusun usulan penelitian, menjalani penelitian sampai penyelesaian tesis ini.

Pembimbing 2, Prof. Dr. Erman Munir, M.Sc yang telah meluangkan

waktu, membimbing dan mengarahkan penulis dalam penyelesaian tesis ini.


Dosen Penguji Dr. Delvian, SP.MP dan Dr. Ir. Eddy Batara Mulya

Siregar, MS yang telah bersedia dengan sabar membantu saya dalam penyempurnaan

tesis ini.

Secara khusus saya persembahkan pada yang tercinta Ir. Sunawardi, M.Si

(suami), ananda Syifa Marini Thurfah dan ananda Ahmad Fauzan Syauqhi tiada kata

yang setara untuk mengutarakan terima kasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya

atas dukungan, cinta, kasih sayang, pengertian, pengorbanan dan kesabaran yang

diberikan kepada saya.

Segenap pihak yang telah membantu dan memberikan dukungan moril. Atas

segala jerih payah serta bantuan yang telah saya terima, kiranya Allah SWT berkenan

membalasnya.

Akhir kata saya menyadari sepenuhnya bahwa isi tesis ini masih memiliki

kekurangan-kekurangan, maka saya mengharapkan kritik dan saran dari pembaca agar

tesis ini dapat lebih baik. Saya berharap semoga tesis ini dapat bermanfaat.

Medan, 26 September 2008

Penulis

Iche Marina Dewi


RIWAYAT HIDUP

Iche Marina Dewi, lahir pada tanggal 7 Maret 1976 di Serui–Irian Jaya, merupakan

anak ke dua dari Bapak Djamidan dengan Ibu Sri Sukasih. Latar belakang pendidikan

dan pengalaman yang pernah didapat adalah :

1. SD Inpres Serui, Irian Jaya : lulus 1987

2. SMPN 2 Banda Aceh : lulus 1990

3. SMAN 2 Banda Aceh : lulus1993

4. Sarjana S1 Fakultas MIPA/ Biologi Unsyiah : lulus 1998

5. Guru SMAN 2 Kutacane : 2000-sekarang

6. Program Magister Biologi, SPs USU : 2006


DAFTAR ISI

Halaman

ABSTRAK………………………………………………………………….. i ABSTRACT ………………………………………………………………... ii UCAPAN TERIMA KASIH …….……………………………………….... iii RIWAYAT HIDUP …………………..……………………………………. v DAFTAR ISI ………………………....…………………………………… vi DAFTAR TABEL ………………………….………………………………. viii DAFTAR GAMBAR………………………….……………………………. ix DAFTAR LAMPIRAN ……………………….……………………………. x BAB I. PENDAHULUAN ……………………………………………… 1

1.1. Latar Belakang ……………………………………………. 1

1.2. Tujuan Penelitian …………………………………………. 4

1.3. Rumusan Masalah ………………………………………... 4

1.4. Hipotesis ………………………………………………….. 4

1.5. Manfaat Penelitian……………………………………….... 5

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA ……….……………………………… 6

2.1. Mikroorganisme Termofilik ……………………………..... 6

2.2. Kitin ……………………………………………………….. 8

2.3. Kitinase ……………………………………………………. 9

2.4. Biosintesis Enzim Kitinase pada Mikroorganisme ……….. 12

2.5. Klasifikasi Enzim Kitinase ………………………………… 12

2.6. Metode Pemekatan Cairan Enzim dan Pengukuran

Aktifitas Kitinase ………………………………………….. 14

2.7. Kegunaan Enzim Kitinase …………………………………. 16

2.8. Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Aktifitas Enzim ……… 17


2.9. Deskripsi daerah sumber Air Panas Tinggi Raja,

Sumatera Utara ………………………………......................... 18

BAB III. METODOLOGI PENELITIAN………………………………… 20

3.1. Waktu Dan Tempat Penelitian ……………………………… 20

3.2. Alat Dan Bahan …………………………………………….. 20

3.3. Pengambilan Sampel Air Panas ……………………………. 21

3.4. Preparasi Koloidal Kitin ……………………………………. 21

3.5. Preparasi Larutan Buffer Fosfat ……………………………. 22

3.6. Pembuatan Larutan Mc Farland ………………………….... 22

3.7. Isolasi dan Seleksi Bakteri Kitinase ……………………….. 22

3.8. Karakterisasi Morfologi Dan Biokimia Bakteri Kitinase ….. 23

3.9. Ekstrak Kitinase Kasar …………………………………….. 23

3.10. Pengukuran Aktifitas Kitinase Kasar Berdasarkan

Pengaruh Suhu …………………………………………….. 24

3.11. Analisis Data ………………………………………………. 26

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ………………………………… 28

4.1. Isolasi dan Seleksi Bakteri Kitinase Termofilik …………… 28

4.2. Karakterisasi Morfologi Dan Biokimia Bakteri Kitinase …. 31

4.3. Pengaruh Suhu Terhadap Aktivitas Kitinase Kasar ………. 35

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ………………………………... 43

5.1. Kesimpulan………………………………………………… 43

5.2. Saran ……………………………………………………… 43

DAFTAR PUSTAKA …………………………………………………….. 44


DAFTAR TABEL

Nomor Judul Halaman

1. Struktur tabel sidik ragam …………………………………………… 26

2. Karakteristik morfologi bakteri kitinolitik termofilik asal Tinggi Raja 31

3. Karakterisasi sifat biokimia isolat kitinolitik termofilik ….…………. 33

4. Aktivitas kitinase kasar pada suhu yang berbeda ….………………… 36


DAFTAR GAMBAR

Nomor Judul Halaman

1. Unit kitin ……………………………………………………………… 8

2. Mekanisme kerja enzim eksokitinase dan endokitinase ……………… 14

3. Beberapa isolat dengan zona bening (a) di sekitar koloni bakteri (b) pada hari ketiga ……………………………………………………… 29

4. Diameter zona bening bakteri kitinolitik termofilik dalam uji nisbi …. 30

5. Pewarnaan gram bakteri kitinolitik termofilik (perbesaran 16 X 100)... 33

6. Rataan aktivitas kitinase kasar (µgr/ml) pada berbagai suhu …..……... 37

7. Pengaruh suhu terhadap kitinase total bakteri termofil Tinggi Raja ….. 38


DAFTAR LAMPIRAN

Nomor Judul Halaman

1. Preparasi koloidal kitin …………………………………………… 49

2. Isolasi bakteri …………………………………………………….. 50

3. Penyiapan biakkan murni bakteri kitinolitik………………………. 51

4. Karakterisasi sifat morfologi dan biokimia isolat ..……………….. 52

5. Isolasi enzim kitinase kasar ……………………………………... 53

6. Penentuan aktifitas kitinase dengan variasi suhu ………………… 54

7. Pembuatan kurva standar N-asetil Glukosamin…………………… 55

8. Peta lokasi sumber isolat …………………………………………. 56

9. Pengamatan uji biokimia sederhana ……………………………… 57

10. Data penentuan kurva standar GlcNAc dengan menggunakan spektrofotometer λ = 538 nm ........................................................... 58

11. Daftar sidik ragam & uji duncan 5 isolat bakteri kitinase termofilik Tinggi Raja …………………………………………….. 60

12. Foto-foto pengamatan sifat fisik air panas Tinggi Raja …………… 63


BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Indonesia merupakan negara yang kaya sumber air panas sebagai media bagi

pertumbuhan bakteri termofilik yang dikenal memproduksi enzim yang bernilai

ekonomi. Namun sampai saat ini bakteri dari sumber air panas belum banyak

dieksplorasi. Salah satu tempat di Indonesia yang memiliki beberapa sumber mata air

panas, antara lain daerah panas bumi Tinggi Raja, di Desa Tinggi Raja, Kecamatan

Silau Kahean, Kabupaten Simalungun, Sumatera Utara. Manifestasi sumber air panas

tersebut sampai saat ini hanya dimanfaatkan untuk obyek pariwisata pemandian air

panas yang itupun pemanfaatannya belum optimal (Sundoro, 2006). Beberapa

penelitian juga sudah diarahkan untuk pengelolaan energi pembangkit listrik tenaga air

tetapi belum dapat diaplikasikan.

Sumber mata air panas ini diduga memiliki potensi bakteri termofil yang belum

dieksplorasi sebelumnya. Bakteri termofil merupakan bakteri dengan kemampuan

bertahan hidup pada kondisi panas sampai dengan kondisi ekstrim panas, bahkan

bakteri termofil ada yang mampu bertahan hidup pada suhu 250oC (Vieille & Zeikus,

2001).Bakteri sebagai salah satu mikroorganisme yang berperan sebagai penghasil

enzim yang paling banyak digunakan dibanding tanaman dan hewan. Sebagai

sumber enzim, bakteri dianggap lebih menguntungkan karena pertumbuhannya cepat,


dapat tumbuh pada subtrat yang relatif murah, kondisi pertumbuhan dan rekayasa

genetik dapat diatur serta mampu menghasilkan enzim yang ekstrim seperti pada suhu

tinggi sangat menguntungkan dibidang industri dan penelitian ilmiah (Lestari, 2000).

Pada tahun-tahun belakangan ini, enzim termostabil dari ekstrim termofil

menjadi sangat penting karena sifat termostabilitas intrinsik dan resistensinya terhadap

perubahan faktor-faktor fisik dan kimia. Enzim termostabil sangat penting dalam

aplikasi bioteknologi dan industri, seperti dalam teknik-teknik biologi molekuler untuk

kegunaan penelitian dan diagnostik (enzim yang memproses DNA dan RNA) dan

kemampuan enzim mengubah tepung, makanan, pengelolaan sampah, sintesis organik,

pembuatan kertas dan industri kulit. Hingga saat ini, lebih dari 70 genus dan 140

spesies termofil telah diisolasi dari berbagai lingkungan termis (George, 2001).

Untuk lebih memanfaatan bakteri termofilik strain lokal, dilakukan studi

terhadap enzim termostabil bakteri ini. Beberapa enzim yang telah diteliti antara lain

selulase, amilase, protease, kreatinase, xylanase, kitinase dan lain–lain. Penelitian

tentang enzim kitinase telah dilakukan, baik uji potensi enzim bakteri kitinolitiknya

hingga cara mempelajari gen yang menyandi enzim yang terlibat dalam proses–proses

kimiawi khususnya. Kitinase juga dihasilkan oleh jamur, tumbuhan tingkat tinggi,

serangga, udang, kepiting, cumi-cumi dan artropoda lainnya (Rahayu, 2000).

Di alam, polimer kedua terbanyak setelah selulosa adalah kitin. Indonesia sangat

berpotensi menghasilkan kitin dan produk turunannya. Limbah cangkang rajungan di

Cirebon saja berkisar 10 ton perhari yang berasal dari sekurangnya 20 industri kecil


(Lestari, 2000). Turunan kitin tersebut masih menjadi limbah yang dibuang dan

menimbulkan masalah lingkungan. Pada hewan, kitin dikonversi menjadi monomer

atau oligomernya dengan menggunakan enzim kitinase. Kitin juga merupakan sumber

karbon dan nitrogen yang dimanfaatkan oleh bakteri kitinase (Poernomo, 2004).

Kitinase merupakan enzim ekstraseluler yang berperan dalam pemecahan kitin.

Secara umum kitinase diklasifikasikan atas endokitinase, eksokitinase dan β-1,4-N-

asetilglukosaminidase. Endokitinase adalah enzim yamg memotong acak ikatan β-1,4

bagian internal mikrofibril kitin dengan produk akhir yang bersifat mudah larut yaitu

berupa N-asetilglukosamin dengan berat molekul rendah seperti kitotetraose.

Eksokitinase merupakan enzim yang mengkatalisis secara aktif pembebasan unit–unit

diasetil kitobiose tanpa pembentukan unit–unit monosakarida dan oligosakarida disebut

eksokitinase, sedangkan β-1,4-N-asetilglukosaminidase merupakan kitinase yang

bekerja pada pemutusan diasetilkitobiose, kitotriose, kitotetraose dan menghasilkan

monomer GlcNAc (Harman et al, 1993).

Kemampuannya menghidrolisis kitin pada suhu tinggi merupakan hal yang

menarik dalam pengisolasian bakteri kitinase termofilik. Produk hidrolisis berupa

derivat kitin banyak dimanfaatkan untuk keperluan medis, farmakologi, industri,

pertanian, pakan ternak, kapsul obat dan obat-obatan seperti obat anti tumor dan anti

kanker, juga sebagai agen pengendalian hama dan penyakit tanaman yang merupakan

hal yang tergolong baru dalam ilmu pengetahuan.


1.2. Tujuan Penelitian

Penelitian bertujuan untuk :

a. Mendapatkan bakteri kitinolitik termofilik, memperoleh isolat murni dan

mengidentifikasi bakteri kitinolitik yang ditemukan

b. Mengetahui suhu dan aktifitas kitinase optimum bakteri kitinolitik termofil dari

sumber air panas Tinggi Raja

c. Mengetahui pengaruh suhu terhadap aktifitas enzim kitinase termofil

1.3. Rumusan Masalah

Penelitian dibatasi pada masalah-masalah yang berhubungan dengan penelitian

ini saja, yaitu

a. Ada tidaknya bakteri kitinolitik termofilik di sumber air panas Tinggi Raja

b. Apakah bakteri yang ditemukan tersebut memiliki suhu optimum dalam proses

produksi enzim kitinolitik termofil,

c. Berapakah suhu optimum aktifitas kitinase termofilik kasar asal Tinggi Raja

1.4. Hipotesis

Terdapat beberapa isolat bakteri kitinolitik termofilik Tinggi Raja yang

memiliki aktifitas kitinase pada suhu optimum yang berbeda.


1.5. Manfaat Penelitian

Penelitian ini bermanfaat untuk memperkaya informasi mengenai sumber daya

alam yang memiliki potensi bakteri kitinolitik (bioprospecting chitinase) dan memberi

kontribusi bagi penelitian lebih lanjut dalam pemanfaatan enzim kitinase bakteri

kitinolitik termofilik dari sumber air panas Tinggi Raja.


BAB II

TINJAUAN PUSTAKA 2.1. Mikroorganisme Termofilik

Berdasarkan suhu optimum pertumbuhan, mikroorganisme secara umum

dibedakan atas psikrofil, mesofil, termofil, ekstrim termofil dan ultra termofil. Psikrofil

hidup pada kisaran suhu -3-20oC, mesofil pada suhu 13–45oC dan termofil antara 45–

65oC bahkan ada yang memiliki kemampuan hidup pada suhu ekstrim termofil yakni

antara 65–85oC dan hipertermofil pada suhu di atas 85oC (Rudiger, 1994). Bakteri yang

mampu hidup pada kisaran suhu di atas 110oC disebut bakteri ultratermofil (Sharmili

& Ramasay, 2003).

Termofilik didefinisikan sebagai organisme yang hidup pada suhu di atas 45oC.

Organisme ini telah memunculkan pengetahuan baru selama beberapa tahun

belakangan. Minat para ilmuwan terhadap organisme termofil semakin tinggi terutama

dipicu dengan adanya penemuan bakteri-bakteri yang dapat hidup pada suhu titik didih

air atau bahkan lebih tinggi (Lestari, 2000).

Termofil sangat menarik untuk dikaji baik dari sudut pandang ilmu dasar maupun

terapan. Bidang penelitian dasar yang berkaitan yaitu biologi molekuler, genetika,

biokimia, evolusi, taksonomi, ekologi dan asal usul kehidupan. Berdasarkan sudut

pandang terapan atau bioteknologi, termofil merupakan sumber enzim-enzim yang unik

dengan sifat spesifik, terutama yang tahan terhadap suhu tinggi. Contoh, penerapan


enzim termostabil yang telah dilakukan dalam bidang industri antara lain sebagai agen

aktif dalam fermentasi bersuhu tinggi, proses penggolahan limbah dan proses pelarutan

mineral (Lestari, 2000).

Pemakaian enzim termostabil disamping tahan terhadap denaturasi panas, juga

dapat meminimalkan resiko kontaminan dan dapat menggeser reaksi ke arah

pembentukan produk (Rudiger, 1994). Penggunaan enzim termostabil dalam

bioteknologi telah dapat menurunkan biaya operasi, disamping dapat meningkatkan

kecepatan reaksi-reaksi biokimianya (Aguilar et al., 1998).

Menurut Edwar (1991) dan Madigan (1997), mikroorganisme termofilik dapat

diisolasi dari berbagai sumber, termasuk sumber air panas baik yang terdapat di darat

maupun di laut, tanah yang selalu terkena sinar matahari, bahan yang mengalami

fermentasi seperti kompos dan instalasi air panas. Bakteri termofil merupakan bakteri

dengan kemampuan bertahan hidup pada kondisi panas sampai ekstrim panas, pada

beberapa litelatur bahkan disebutkan ada yang mampu bertahan hidup pada suhu

250oC (Vieille & Zeikus, 2001).

Di Sumatera Utara kekayaan alam berupa sumber air panas terdapat di beberapa

daerah. Pada kondisi hutan, dimana daun-daunan gugur, biji-bijian, rerumputan, serbuk

sari dan bangkai serangga merupakan sumber bahan organik yang dapat dimanfaatkan

oleh mikroorganisme yang terdapat di dalam sumber air panas tersebut. Hal ini

memberikan peluang besar bagi mikroorganisme termofilik penghasil enzim hidrolitik

ekstraselluler seperti protease, manase, amilase, kitinase dan xilanase pada sumber air


panas tersebut. Salah satu enzim termostabil yang banyak digunakan dalam bidang

bioteknologi adalah enzim DNA polymerase yang biasa digunakan dalam proses PCR.

2.2. Kitin

Kitin merupakan polimer N-asetilglukosamin yang cukup banyak ditemukan

dalam dinding sel jamur dan eksoskeleton dari serangga dan krustasea (Cohen-Kupiec

& Chet, 1998). Kitin (C6H9O4. NHCOCH3)n merupakan zat padat yang larut dalam

asam-asam mineral pekat, tetapi tidak larut dalam air, pelarut organik, alkali pekat, dan

asam mineral lemah. Dengan adanya ikatan hidrogen yang sangat kuat pada rantai kitin,

membuat kitin tidak dapat larut dalam air dan membentuk fibril.

Kitin dapat larut dalam fluoroalkohol dan asam mineral pekat. Koloidal kitin

merupakan kitin yang banyak digunakan sebagai substrat dalam medium fermentasi

(Haran et al., 1995). Satu unit kitin dapat dilihat pada gambar berikut.

Gambar 1. Unit kitin (Cabib, 1987).


Berdasarkan pola penyusun rantai polimer, kitin fibril terbagi atas α-kitin, β-kitin,

γ-kitin (Cabib, 1987). Pada α-kitin, rantai-rantai polimer yang berdekatan tersusun

secara antiparalel. Bentuk ini banyak ditemukan pada jamur dan arthropoda. Jenis β-

kitin mempunyai rantai polimer yang tersusun paralel, sedangkan γ-kitin fibrilnya

masing-masing tersusun dari tiga rantai, dua rantainya tersusun paralel dan rantai ketiga

antiparalel (Cabib, 1987).

Sumber kitin bermacam-macam, namun secara komersial kitin dieksplorasi dari

cangkang udang-udangan dan Crustacea. Sebanyak 50–60% dari limbah udang,

dihasilkan 25% kitin dari 32% berat kering limbah tersebut (Meidina et al., 2005) Kitin

terdapat melimpah di tanah dengan struktur dan karakteristik yang unik. Banyak hewan

dan mikroorganisme (seperti jamur, dan alga) memberikan kontribusi terbanyak atas

ketersedian kitin di dalam tanah.

2.3. Kitinase

Secara umum enzim sering digunakan dalam proses produksi. Enzim yang

digunakan pada umumnya berasal/diisolasi dari bakteri. Penggunaan enzim dalam

proses produksi dapat meningkatkan efisiensi yang kemudian meningkatkan jumlah

produksi. Bidang bioteknologi industri mengembangkan teknologi dan bioproses

dengan segala ilmu pendukungnya, seperti mikrobiologi, rekayasa genetika, biokimia

atau ilmu pendukung lainnya.Bioproses, yang di dalamnya meliputi bidang produksi


antara lain antibiotika, asam amino, pengendalian limbah, ataupun enzim (Poernomo,

2004).

Enzim adalah kelompok protein yang berperan penting dalam aktifitas biologi.

Enzim berfungsi sebagai katalisator di dalam sel dan sifatnya sangat khas. Dalam

jumlah yang kecil, enzim dapat mengatur reaksi tertentu sehingga dalam keadaan

normal tidak terjadi penyimpangan hasil reaksi. Karena enzim mengkatalisator reaksi-

reaksi di dalam sistem biologis, maka enzim disebut sebagai biokatalisator (Murray,

2003).

Di bidang industri, enzim yang digunakan sebagian besar diisolasi dari

mikroorganisme. Pemilihan mikroorganisme sebagai sumber enzim mempunyai

beberapa keuntungan bila dibandingkan dengan yang diisolasi dari tanaman maupun

dari hewan. Antara lain adalah sel mikroorganisme relatif lebih mudah ditumbuhkan,

kecepatan pertumbuhan relatif lebih cepat, skala produksi sel lebih mudah ditingkatkan

bila dikehendaki produksi yang lebih besar, biaya produksinya relatif rendah, kondisi

selama produksi tidak tergantung oleh adanya pergantian musim dan waktu yang

dibutuhkan dalam proses produksi lebih pendek (Poernomo & Purwanto, 2003).

Enzim kitinase mampu mendegradasi kitin. Kitinase banyak dihasilkan oleh

berbagai organisme seperti bakteri, fungi, tumbuhan tingkat tinggi, dan hewan.

Organisme ini biasanya memiliki beragam gen kitinase yang ekspresinya diinduksi oleh

ekstraseluler kitin dan derivatnya. Pada hewan, kitinase digunakan untuk mengkonversi

kitin menjadi monomer atau oligomernya. Kitinase juga dimanfaatkan oleh bakteri


untuk asimilasi kitin sebagai sumber karbon dan nitrogen (Tsujibo et al., 1999).

Sejumlah besar organisma memiliki enzim yang mampu menurunkan kitin fibril dan

dikenal secara kolektif sebagai kitinase (Inbar & Chet, 1991).

Kitinase menjadi perhatian yang besar, terutama karena peranannya dalam

morfogenesis jamur dan parasitisme. Pemanfaatan enzim ini telah banyak dilakukan

dalam aplikasi pengendalian hayati (Sahai & Manocha, 1993). Kitinase yang dihasilkan

mikroorganisme memiliki berat molekul berkisar antara 20.000–120.000 KDA. Pada

bakteri, berat molekul antara 60.000–110.000 KDA, sedangkan pada aktinomisetes

yaitu 30.000 atau lebih rendah (Wang et al, 1997).

Bakteri kitinolitik merupakan bakteri yang kompeten memproduksi enzim

kitinase dan memanfaatkan kitinase untuk asimilasi kitin sebagai sumber karbon dan

nitrogen (Wu et al, 2001). Genus bakteri yang sudah banyak dilaporkan menghasilkan

kitinase antara lain Aeromonas, Alteromonas, Chromobacterium, Enterobacter,

Ewingella, Pseudoalteromonas, Pseudomonas, Serratia, Vibrio (Chernin et al, 1998).

Beberapa spesies yang telah dipelajari antara lain Aeromonas sp, Bacillus cereus, B.

licheniformis (Pleban et al, 1997), Clostridium sp, Enterobacter liquefaciens,

Flavobacterium indolthecium, Klebsiella sp, Micrococcus colpogenes, Pseudomonas

sp, Serratia marcencens, Vibrio parahaemaluticus, V. alginolyticus, Bacillus dan

Pyrococcus (Gao et al, 2003)

Di Indonesia, sejumlah bakteri yang mempunyai aktifitas enzim kitinase telah

diisolasi dari berbagai sumber air panas di daerah Tompasso, Manado. Dari 45 isolat


yang didapat, Bacillus licheniformis MB-2 menunjukkan indeks kitinolitik yang

terbesar (Jayanti, 2002). Enzim kitosanase yang dihasilkan dari isolat MB-2 telah pula

dimurnikan dan dikarakterisasi (Chasanah, 2004).

2.4. Biosintesis Enzim Kitinase Pada Mikroorganisme Pengaturan biosintesis enzim kitinase melalui sistem represor-induser. Kitin dan

produk hasil degradasinya (oligomer/monomer) berperan sebagai induser (Sahai &

Manocha, 1993). Glukosamin dapat menginduksi kitinase karena pada kitosan (kitin

yang mengalami deasetilasi) masih terdapat sekitar 10–20% residu asetil (Sahai &

Manocha, 1993).

Pengaturan sintesis kitinase dipengaruhi juga oleh produk akhir (katabolit) berupa

GlcNAc dan glukosa. Kitin yang dipreparasi dengan hidrolisis parsial dengan HCl 10 N

akan menghasilkan koloidal kitin yang mampu menginduksi kitinase kompleks seperti

N-asetilglukosaminidase, endokitinase dan kitobiosidase pada Aeromonas caviae (Inbar

& Chet, 1991), Enterobacter agglomerans (Chernin et al., 1995) dan Trichoderma

harzianum (Haran et al., 1995).

Kemampuan menginduksi sintesis kitinase dipengaruhi kemampuan sel

mikroorganisme untuk mengenal struktur fisik kitin seperti susunan rantai. Beberapa

mikroorganisme memproduksi protein seperti lektin yang mengikat secara khusus

kristal α-kitin. Sel juga dapat mengenal derajat deasetilasi dari jumlah glukosamin dan

GlcNAc relatif yang dibebaskan selama degradasi kitin.


2.5. Klasifikasi enzim kitinase

Kitinase poli 1,4–β(2 asetamido–2–deoksi–D–glukosaminide) glikanohidrolase

adalah enzim yang menghidrolisis ikatan β-1,4-asetamido–2 deoksi-D-glikosida dari

kitin dan kitodekstrin (Bielka et al., 1984). Mekanisme proses hidrolisis tersebut

tergantung dari tipe-tipe kitinase dan kemampuan mengkatalisis dengan produk akhir

yang berbeda.

Polimer N-asetilglukosamin yang cukup banyak ditemukan dalam dinding sel

jamur dan eksoskeleton dari serangga dan krustasea, dimana kesamaan rangkaian

peptida telah digunakan untuk mengelompokkan kitinase ke dalam lima kelas. Kelas I,

II, dan IV terdiri dari kitinase yang bersumber dari tanaman dan secara struktural tidak

berhubungan dengan kelas III dan V. Kitinase kelas III diperoleh terutama dari

tumbuhan dan jamur, sedangkan kelas V mewakili sebagian besar bakteri kitinase

(Cohen-Kupiec & Chet, 1998).

Sistim tata nama dan penggolongan enzim kitinase masih banyak menimbulkan

kerancuan. Harman et al., (1993) membagi kitinase dalam tiga tipe yaitu:

a. Eksokitinase (belum memiliki nomor entry dalam Enzyme Nomenclature)

dinamakan juga kitobiosidase atau kitin–1,4-β-khitobiosidase, yaitu enzim yang

mengkatalisis secara aktif pembebasan unit-unit diasetilkitobiose tanpa ada unit-

unit monosakarida atau oligosakarida yang dibentuk (Gambar 2). Pemotongan

hanya terjadi pada ujung non reduksi mikrofibril kitin dan tidak secara acak.


b. Endokitinase (EC. 3.2.1.14) yaitu enzim yang memotong secara acak ikatan β -

1,4 bagian internal mikrofibril kitin (Gambar 2). Produk akhir yang terbentuk

berupa oligomer pendek N-asetilglukosamin (GlcNAc) yang mempunyai berat

molekul rendah seperti kitotetraose, kitotriose dengan didominasi oleh

diasetilkitobiose. Produk yang dihasilkan bersifat mudah larut.

c. β -1,4–N asetilglukosamidase (EC. 3.2.1.30) adalah suatu enzim kitinolitik yang

bekerja pada pemutusan diasetilkitobiose, kitotriose dan kitotetraose dengan

menghasilkan monomer-monomer GlcNAc.

Aktifitas enzim

Gambar 2. Mekanisme kerja enzim eksokitinase dan endokitinase (Sahai & Manocha,

1993)


2.6. Metode pemekatan cairan enzim dan pengukuran aktifitas kitinase

Enzim yang berada pada cairan kultur belum 100% terdiri atas protein enzim yang

diinginkan, sehingga perlu pemurnian untuk memisahkannya dari senyawa-senyawa

lain. Tahap awal dalam pemurnian enzim adalah pemekatan medium kultivasi.

Pemekatan dapat dilakukan dengan beberapa cara yaitu ultrafiltrasi, liofiliasi dan

mengendapkan protein dengan ammonium sulfat, aseton, etanol, atau polietilen glikol

(PEG) (Scopes, 1994). Pemekatan enzim kitinase dari Streptomyces dengan ammonium

sulfat pada kejenuhan 70% dan etanol dingin, dapat meningkatkan kemurnian enzim

berturut-turut 5 dan 3,5 kali dibanding enzim kasarnya (Lloyd et al., 1965). Sementara

itu Singh et al.,(1999) menyatakan bahwa protein kitinase dari Streptomyces sp. 385

yang dipekatkan dengan polietilen glikol (PEG), kemurniannya meningkat sebanyak

11,9 kali dibanding enzim kasarnya.

Pengendapan protein dengan ammonium sulfat adalah cara yang paling banyak

digunakan. Hal ini disebabkan karena ammonium sulfat mudah didapatkan, harganya

relatif murah, bersifat menstabilkan enzim serta dapat mencegah aktifitas enzim

proteolitik. Garam ammonium sulfat konsentrasi 2-3 M dapat menstabilkan enzim

selama beberapa tahun. Kelemahannya adalah tidak dapat mengendapkan seluruh

protein yang telah larut dan bila mengandung logam dapat merusak enzim (Scopes,

1994).


Pengukuran aktifitas kitinase dalam memecah kitin dapat dilakukan dengan

beberapa cara seperti yang disebutkan Jeaniaux (1966) dan Cabib (1987) yaitu :

a. Berdasarkan pengurangan substrat.

1). Metode turbidimetri (nepelometri) yaitu mengukur variasi turbiditas (kekeruhan)

suspensi koloidal kitin selama kitinolisis. Pengukuran ini hanya cocok untuk

enzim dengan aktifitas tinggi tapi bersifat cepat dan akurat. Misalnya pengukuran

aktifitas enzim endokitinase.

2). Metode viskosimetri yaitu pengukuran aktifitas enzim kitinase terhadap derivat

kitin yakni kitosan, glikol kitin atau karboksimetilkitin yang ditandai dengan

terjadinya pengurangan viskositas substrat.

b. Berdasarkan pembentukan produk akhir yaitu GlcNAc (Metode Reissig, 1955).

Yaitu pengukuran secara kolorimetrik produk akhir berupa GlcNAc yang dibebaskan

dari kitin dengan p-dimetilaminobenzaldehida. µmol GlcNAc yang dibebaskan selama

1 jam dalam kondisi yang ditetapkan dianggap sebagai satu unit aktifitas kitinase

c. Spectrometer Assay

Yaitu proses yang menggunakan subtrat dari kromogen 3,4, dinitrofenil tetra N-

asetilkitotetraose.

d. Radiometer Assay.

Pengukuran produk diuji dengan menentukan radioaktifitasnya setelah

penghilangan kitin yang belum dipecah dengan cara penyaringan atau disentrifugasi.


Pengujian ini untuk mengetahui sensitifitas enzim kitinase dengan menggunakan

subtrat yang berlabel 14C atau 3H.

2.7 Kegunaan enzim kitinase

Enzim kitinase berperanan penting dalam kontrol fungi patogen tanaman secara

mikoparasitisme. Kemampuan beberapa spesies sebagai mikroorganisme biokontrol

yang sangat efektif untuk menghambat pertumbuhan fungi patogen tanaman dikaitkan

dengan kemampuannya menghasilkan enzim kitinase (Paulitz & Belanger, 2001).

Kitinase yang diproduksi mikroorganisme dapat menghidrolisis struktur kitin, senyawa

utama penyusun dinding sel tabung kecambah spora dan miselia, sehingga jamur tidak

mampu menginfeksi tanaman (Priyatno et al., 2000).

Kitinase mendapat perhatian yang besar, terutama karena peranan mereka dalam

morfogenesis jamur dan parasitisme. Kepentingan enzim ini dalam banyak aplikasi

kontrol biologi juga telah didokumentasikan (Sahai & Manocha, 1993). Salah satu

contoh penyakit sasaran yang potensial dikendalikan dengan mikroorganisme kitinolitik

adalan penyakit karat daun kedelai yang disebabkan jamur Phakopsora pachyrhizi Syd

(Priyatno et al., 2000).

Kemampuan bakteri untuk memproduksi kitinase sangat bervariasi, mungkin

disebabkan perbedaan kecil pada gen yang mengkodenya (Tronsmo & Harman, 1993).

Variasi ini tidak saja terlihat dari jumlah aktifitas kitinase total yang diproduksi setiap

speciesnya, tetapi juga pada jenis kitinase yang dihasilkan. Semua enzim yang dapat


mendegradasi kitin, disebut kitinase total atau kitinase non-spesifik (Nugroho et al.,

2003).

2.8 Faktor-faktor yang Mempengaruhi Aktifitas Enzim

Enzim mampu mempercepat reaksi kimia paling sedikit 1 juta kali lebih cepat

dari reaksi yang tidak dikatalis. Laju reaksi yang dikatalis enzim lebih cepat dari katalis

lain. Dalam sintesis enzim, parameter lingkungan sangat mempengaruhi (Darwis &

Sunarti, 1992). Aktifitas suatu enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor, yaitu pH,

konsentrasi subtrat dan enzim, suhu dan adanya aktivator atau inhibitor (Lehninger,

1998).

pH berpengaruh karena sifat ionik gugus karboksil dan gugus amino mudah

dipengaruhi pH. Hal ini menyebabkan daerah katalitik dan konformasi enzim jadi

berubah. Perubahan pH juga menjadi penyebab denaturasi protein dan megakibatkan

hilangnya aktifitas enzim. Untuk mempelajari enzim, terlebih dahulu harus dicari pH

optimum dengan menggunakan buffer yang sesuai (Girindra, 1993).

Pengaruh suhu terlihat pada reaksi-reaksi kimia, karenanya reaksi yang dikatalisis

enzim peka terhadap suhu. Hal ini disebabkan karena enzim merupakan struktur protein

pula yang akan mengalami denaturasi jika suhunya dinaikan dan menyebabkan

menurunnya daya kerja enzim.

Girindra (1993) menyebutkan bahwa kecepatan enzim bereaksi dipengaruhi pada

konsentrasi enzim yang berperan sebagai katalisator. Suatu reaksi yang dikatalis oleh


enzim terlebih dahulu terbentuk komplek enzim subtrat (ES), yang kemudian terurai

menjadi enzim dan produknya.

Aktifitas enzim sendiri diperbesar dengan adanya aktifator yang mengaktifkan

enzim. Aktifator tersebut dapat berupa logam dan non logam yang merupakan zat-zat

non spesifik yang menggiatkan proses enzimatis. Umumnya aktivator ini merupakan

bahan yang tahan panas dan berberat molekul relatif rendah (Baldwin, 1973).

2.9. Deskripsi Daerah Sumber air Panas Tinggi Raja, Sumatera Utara

Tinggi Raja merupakan objek pariwisata cagar alam dan sumber air

panas/belerang. Sampai sekarang ini pengelolaannya masih ditangani oleh Balai

Konservasi Sumber Daya Alam (BKSDA) Kadis Kehutanan Propinsi Sumatera Utara

(Khairul, 2007).

Sumber air panas berada pada satu bukit kapur sekitar setengah hektar. Ada tiga

bukit, masing-masing di arah selatan, timur dan barat. Ketiganya dihubungkan dengan

retakan yang seolah membelah bukit. Retakan inilah tempat luapan air panas, dengan

lebar yang beragam mulai 10– 60 cm, tinggi cipratan air rata-rata 30 cm – 1 m (Khairul,

2007).

Sumber air panas Tinggi Raja kecamatan Silau Kahean, Kabupaten Simalungun

terletak dalam suatu lokasi cagar alam (CA) dengan luas 176 ha di desa Tinggi Raja.

Berjarak 80 Km dari Pematang Siantar dan 116 km dari Desa Tinggi Raja. Peta lokasi

pengambilan sumber isolat dapat dilihat pada Lampiran 8.


Secara geografis Tinggi Raja terletak di antara 3º 08’ s.d 3º 09’ lintang Utara dan

98º 46’ 30˝ s.d 98º 48’ 30˝ bujur timur. Berdasarkan letak pada ketinggian di atas

permukaan laut (dpl) maka Cagar Alam Tinggi Raja terletak pada ketinggian sampai

dengan 450 m dpl. Cagar Alam ini terletak di antara desa Dolok Merawa dan dusun

Bahoan (BKSDA Sumatera Utara, 2003).

Tanah di kawasan Cagar Alam Tinggi Raja sebagian besar termasuk ke dalam

struktur tanah laterit berkapur dengan humus yang tipis (terutama pada kawasan yang

dekat dengan endapan kapur), pH tanah 6,5– >7. Keadaan iklim menurut klasifikasi

Scmith dan Ferguson, dikelompokkan ke dalam iklim tipe A yaitu dengan curah hujan

berkisar antara 2500–3500 mm per tahun, dengan suhu rata-rata saat ini antara 24-30ºC

(BKSDA Sumatera Utara, 2003)


BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

3.1. Waktu dan tempat Penelitian

Sampel air yang diduga mengandung bakteri termofilik diambil dari sumber air

panas Tinggi Raja, di Desa Tinggi Raja, Kecamatan Silau Kahean, Kabupaten

Simalungun, Sumatera Utara. Isolasi, identifikasi sederhana dan pengujian bakteri

dilakukan di laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi Fakultas Matematika dan

Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara. Pelaksanaan kegiatan penelitian

dilakukan dari Februari sampai Juli 2008.

3.2. Alat dan Bahan

Bahan yang dipergunakan dalam penelitian ini adalah air dari sumber air panas

Tinggi Raja sebagai sumber pengambilan isolat. Media koloidal kitin yang dipreparasi

dengan HCl 10 N. Media Garam Minimum Kitin tersusun atas MgSO4.7H2O 0,5 gram,

MnCl2 0,001 gram, KH2PO4 0,3 gram, K2HPO4 0,7 gram, FeSO4.7H2O 0,01 gram,

ZnSO4 0,001 gram dipreparasi dalam 1000 ml aquadest steril (Atlas, 1990). Tepung

agar-agar, indikator pH, bahan pewarnaan bakteri (kristal violet, iodin, aseton alkohol

dan safranin). Untuk uji biokimia menggunakan media SIM, TSIA, SA, SCA, 2H202,

gelatin dan oksidase.


Peralatan yang dibutuhkan yaitu cawan petri, tabung reaksi, ose, hoki stik, kapas,

alumunium foil, label, lampu Bunsen, voter, inkubator, otoklaf, botol sampel, botol

erlenmeyer, pipet, propipet, kuvet, termometer, pH meter merek Hanna, GPS 60 merek

Garmin, termos, sentrifus merek IEC Minimax, jangka sorong, shaker water bath

merek Jilabo, mikroskop, spektrofotometer merek Shimadzu 1240

3.3. Pengambilan Sampel Air Panas

Sampel air sebagai sumber isolat diambil dan disimpan dalam botol sampel yang

telah disterilkan. Isolasi bakteri dilakukan di laboratorium. Suhu dan pH air diukur pada

saat pengambilan sampel air, juga pengukuran koordinat tempat pengambilan sampel

air dengan menggunakan Geography Posisioning System (GPS).

3.4. Preparasi Koloidal Kitin

Koloidal kitin diperoleh dengan cara pembuatan koloidal kitin menurut metode

Arnold dan Solomon (1986). Dalam metode ini digunakan 20 gram kitin diperoleh dari

Laboratorium Penelitian FMIPA-USU. Kitin dihaluskan dan dilarutkan dalam 400 ml

asam klorida, lalu didiamkan 24 jam pada suhu 4oC, kemudian disaring dengan glass

wool dan diambil filtratnya. Filtrat ditambah 200 ml aquades dingin dan 10 N natrium

hidroksida sampai pH 7, disentrifus pada kecepatan 6000 rpm selama 20 menit hingga

berbentuk pelet. Pelet diresuspensi aquades, disentrifus 15 menit dan disimpan pada

suhu 4oC (Rochima, 2006). Preparasi koloidal kitin disajikan dalam diagram alur pada

Lampiran 1.


3.5. Preparasi Larutan Buffer Fosfat

Larutan buffer fosfat terdiri atas KH2PO4 (Y) dan K2HPO4 (X). Untuk pH yang

diinginkan yaitu 7,0 maka X gram yang dibutuhkan 8,6722 gram/L dan Y gram yang

dibutuhkan 0,0218 gram/L. Larutan X dan Y diencerkan sampai 200 ml (Sudarmadji &

Bambang, 1984).

3.6. Pembuatan Larutan Mc Farland

Untuk pembuatan larutan Mc Farland, bahan-bahan yang digunakan yaitu BaCl2

(1,175% 10/v. BaCl2.2H2O) dan H2SO4 (1% v/v). Komposisi larutan Mc Farland

ádalah 0,05 ml 0,048 M BaCl2 (1,175% 10/v. BaCl2.2H2O) pada 99,5 ml dari 0,35 N

H2SO4 (1% v/v) (Lorian, 1980).

3.7. Isolasi Dan Seleksi Bakteri kitinase

Sebanyak 1 ml air dari sumber air panas diinokulasikan ke dalam 10 ml media

kitin padat dengan komposisi koloidal kitin ditambahkan garam minimum, tepung agar

dan aquadest sesuai formulasi. Kultur tersebut disimpan dalam inkubator pada suhu

termofil, 60oC. Kultur bakteri yang hidup dan membentuk zona halo diambil. Zona halo

di sekitar koloni membuktikan bahwa bakteri tersebut adalah bakteri kitinase yang

mampu mendegradasikan kitin (Rahayu, 2000).

Bakteri kitinase tersebut dibiakkan kembali pada media agar garam minimum

kitin berikutnya agar diperoleh biakan murni. Isolat murni di inkubasi pada suhu 60oC


selama 1-5 hari. Zona halo diukur dengan menggunakan jangka sorong berdasarkan

penampakan nilai hidrolisisnya. Alur kerja dipaparkan pada Lampiran 2 dan 3.

3.8. Karakterisasi Morfologi dan Biokimia Bakteri Kitinase

Isolat kemudian diseleksi lagi berdasarkan Indeks Kitinolitik (IK) yaitu

perbandingan diameter halo dengan diameter koloni untuk memperoleh isolat yang

potensial. Isolat yang telah diseleksi kemudian diidentifikasi secara morfologi untuk

mengetahui bentuk sel, jenis gram bakteri, motilitas, spora, sifat aerob/anaerob

(Rahayu, 2000).

Pengamatan motilitas dengan menggunakan medium semi padat Sulfide Indol

Motility (SIM), untuk mengamati sifat pewarnaan gram digunakan safranin, iodin,

aseton alkohol dan kristal violet. Uji biokimia meliputi uji sitrat (Simmons Citrate

Agar), uji katalase menggunakan larutan 3% H2O2, uji karbohidrat dengan media Triple

Sugar Indol Agar, uji amilase dengan media Starch Agar dan uji oksidase dengan

menggunakan Bactident oxidase. Lampiran 4, memperlihatkan alur kerja karekterisasi

morfologi dan biokimia bakteri kitinolitik.

3.9. Ekstrak Kitinase Kasar

Pembuatan kultur awal bakteri (starter) yaitu dengan menggunakan isolat

bakteri kitinolitik sebanyak 108 sel/ml yang disuspensikan pada larutan fisiologis 0,85%

NaCl dan ditumbuhkan dalam 100 ml medium MGMC cair dengan pH 7 dan diinkubasi

di atas water bath shaker merek Julabo dengan goncangan 120 rpm pada suhu ruang


selama 24 jam. Masing-masing starter (5% starter) dari bakteri kitinolitik ditumbuhkan

dalam 100 ml medium MGMK cair dengan pH 7. Kultur diinkubasi di atas whater bath

shaker dengan goncangan 120 rpm selama 72 jam pada suhu 60oC.

Enzim dipanen dengan cara sentrifugasi dengan menggunakan sentrifuse merek

IEC Minimax. Medium kultivasi berkecepatan 6000 rpm selama 20 menit pada suhu

ruang. Endapan yang terbentuk dibuang sedangkan supernatan yang diperoleh

merupakan kitinase kasar, kemudian langsung diujikan. Alur kerja isolasi kitinase kasar

dapat dilihat pada Lampiran 5.

3.10. Pengukuran Aktivitas Kitinase Kasar berdasarkan Pengaruh Suhu

Kitinase kasar dari masing-masing isolat dipipet sebanyak 3 ml dan ditambahkan

subtrat kitin (1% koloidal kitin (b/v) dalam 50 mM buffer fosfat, pH 7) dengan volume

yang sama dan diinkubasi pada suhu yang berbeda yaitu 50oC, 55oC, 60oC, 65oC dan

70oC selama 30 menit. Kisaran suhu yang digunakan dalam penelitian ini sesuai

dengan pendapat Brock (1986) yang mengemukakan bahwa kecepatan tumbuh

maksimal dari beberapa bakteri termofilik berkisar pada suhu optimal 55-70oC. Semua

kultivasi dilakukan tiga ulangan. Reaksi dihentikan dengan cara terapi dingin 4oC

selama 15 menit dan kemudian disentrifugasi pada kecepatan 6000 rpm selama 20

menit.

Campuran yang didinginkan, diambil supernatannya dan dimasukkan ke dalam

tabung reaksi steril sebanyak 0,5 ml. Supernatan ditambahkan 0,1 ml larutan Na2B4O7


0,8 M dan dipanaskan selama 3 menit. Campuran didinginkan dan ditambahkan 3 ml

larutan B (10 ml p-dimetilaminobenzaldehid 1% dalam asam asetat glasial + 10 ml HCl

1,25%). Campuran divortek dan diukur serapannya pada panjang gelombang 538 nm

(Wijaya, 2002). Densitas optik (OD538) diukur dengan menggunakan

spektrofotometer merk Shimadzu 1240.

Aktivitas kitinase dihitung berdasarkan selisih antara kadar N-asetil glukosamin

(GlcNAc) yang dibebaskan pada perlakuan dengan kadar GlcNAc yang terdapat dalam

kitinase kasar yang tidak diperlakukan (kontrol). GlcNAc yang dihasilkan dianalisis

secara kolorimetri dengan metode Reissig (1955) dalam Jeanoux (1966). Satu unit

aktivitas kitinase didefinisikan sebagai jumlah enzim yang membebaskan sebanyak 1

µmol GlcNAc/jam pada kondisi tertentu (Sing et al, 1999). Alur kerja penentuan kadar

(GlcNAc) pada sampel dapat dilihat pada Lampiran 6.

Aktifitas kitinase dihitung berdasarkan N-asetilglukosamin yang terbentuk dari

hidrolisis kitin seperti pada persamaan berikut :

A = [N – AGA] x 1000 x 2

x t

BM N - AGA

Dimana :

A = aktivitas

[N-AGA] = konsentrasi N-asetilglokosamin

[BM N-AGA]= Berat Molekul N-Asetilglukosamin

T = waktu inkubasi


Satu unit (U) aktivitas enzim setara dengan 1 µmol N-asetilglokosamin yang dihasilkan

selama satuan inkubasi (Wijaya, 2002).

3.11. Analisis Data

Data berupa hasil pengamatan morfologi dan biokimia dipaparkan secara

deskriftif, sedangkan hasil berupa data kuantitatif pengaruh suhu dilakukan perhitungan

statistik analisa varian dilanjutkan dengan uji Duncan (Hanafiah, 1993). Mengingat

semua media dan kondisi lingkungan serta perlakuan terhadap kitinase kasar

dikondisikan sama kecuali perlakuan suhu aktivitas enzim, maka dilakukan perhitungan

dalam Rancangan Acak Lengkap Tunggal. Perlakuan suhu terhadap kitinase kasar

adalah rentang suhu termofil antara 50–70oC sebanyak 3 kali ulangan. Parameter yang

diukur adalah konsentrasi GlcNAc (µg/ml) terhadap berbagai kondisi suhu.

Data hasil penelitian dihitung dalam struktur tabel sidik ragam yang disajikan

sebagai berikut :

Tabel 1. Struktur tabel sidik ragam

Ftabel Sumber keragaman

Derajat bebas

Jumlah kuadrat Kuadrat tengah

Fhitung 0.05 0.01

Perlakuan Galat

p-1 P(n-1)

∑( ∑ Yij )2/n-FK JKt - JKp

JKPerl/dbPerlJKG / dbG

KTP / KTG

Tabel F α(0.05)

Tabel F α (0.01)

Total P(n-1) JKtotal

Pengujian hipotesis dilanjutkan bila nilai Fhitung > Ftabel maka hipotesis nol ditolak yang

berimplikasi bahwa perlakuan suhu memberikan pengaruh nyata terhadap aktifitas


GlcNAc (µg/ml), dialanjutkan dengan uji Duncan Multiple Range Test (DMRT) untuk

melihat jarak antar perlakuan suhu (Hanafiah, 1993).


BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Isolasi Dan Seleksi Bakteri kitinase Termofilik

Isolasi bakteri dilakukan dengan metode agar sebar pada media agar garam

minimum kitin pH 7,0 (pH rata-rata di lokasi sumber air panas Tinggi Raja). Dengan

teknik biakan murni diperoleh 32 isolat tunggal bakteri kitinase dari Tinggi Raja.

Masing-masing isolat tunggal diinokulasikan kembali pada media selektif kitin untuk

mengamati dan mengukur zona hidrolitik yang terbentuk. Zona hidrolitik diamati pada

hari keempat dengan diameter rata-rata 9–49 mm.

Seluruh tahap inkubasi pada proses isolasi dan seleksi dilakukan pada suhu tinggi

(65oC). Suhu tinggi dimaksudkan agar bakteri kitinolitik yang terseleksi merupakan

bakteri penghasil kitinase yang memiliki aktivitas optimum dan stabilitas tinggi pada

suhu tinggi.

Untuk mengetahui produksi kitinasenya dapat dilihat dari warna medium menjadi

lebih transparan (terbentuknya zona halo) di sekeliling koloni bakteri. Zona

bening/halo dapat dilihat pada Gambar 3. Warna medium transparan disebabkan oleh

enzim kitinase yang dikeluarkan ke dalam medium merupakan metabolit yang tidak

berwarna (membentuk zona bening di sekitar koloni bakteri). Kitinase merupakan

enzim ekstraseluler yang dihasilkan bakteri kitinolitik yang berperan penting dalam

menghidrolisis kitin (Tsujibo et al., 1999). Enzim ekstraseluler adalah enzim yang


dihasilkan di dalam sel, tetapi dikeluarkan ke dalam medium tumbuhnya (Wijaya,

2002).

a b TR 1 TR 2

TR 4 TR 5 TR 3

Gambar 3. Beberapa isolat dengan zona bening(a) di sekitar koloni bakteri(b) pada hari ketiga

Lima isolat yang memiliki zona bening terlebar adalah isolat TR1 diameter zona

bening 17,60 mm, isolat TR2 diameter zona bening 15,53 mm, TR3 diameter zona

bening 49,44 mm, TR4 diameter zona bening 46,94 mm dan isolat TR5 diameter zona

bening 38,65 mm. Besar kecilnya zona bening sangat tergantung pada kemampuan

bakteri untuk memproduksi kitinase yang sangat bervariasi. Perbedaan tersebut

mungkin disebabkan perbedaan kecil pada gen yang mengkodenya (Tronsmo &

Harman, 1993).


Gambaran lebar diameter zona bening dapat dilihat pada Gambar 4 berikut :

Gambar 4. Diameter zona bening bakteri kitinolitik termofilik dalam uji nisbi

Isolat TR3 dan TR4 yang memiliki diameter zona bening terluas diperoleh dari

sumber isolat pada titik 1 dengan pH air 7,2, suhu air 63oC. Sumber isolat titik 2 suhu

air 57 oC dan pH air 7,1 diperoleh isolat TR5. Isolat TR1 dan isolat TR2 diperoleh dari

titik 3 dengan suhu air yang terdeteksi 59 oC dan pH air 6,9.

Variasi diameter zona bening yang ditemukan dari tiap isolat diduga disebabkan

perbedaan suhu dan pH baik pada kondisi alami maupun perlakuan di laboratorium

selama penelitian berlangsung. Seperti dikemukakan Lehninger (1998), bahwa aktivitas

suatu enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor, yaitu pH, konsentrasi subtrat dan enzim,

suhu dan adanya aktivator atau inhibitor.


Berdasarkan data observasi yang memberikan informasi hasil pengukuran pH air

yang diperoleh dari sumber air panas berkisar antara 6,9-7,2 atau rata-rata pH 7, maka

perlakuan pengaruh pH tidak dilakukan mengingat kisaran pH dari ketiga tempat

pengambilan sumber isolat berada pada pH normal dengan hasil aktifitas kitinase kasar

sudah maksimal.

4.2. Karakterisasi Morfologi dan Biokimia Bakteri Kitinase

Menurut Lay (1994), koloni yang tumbuh di atas lempengan agar, perlu

diperhatikan warna, sifat tembus cahaya, pinggiran (tepi), sifat permukaan (elevasi) dan

bentuknya. Hal ini memungkinkan diperoleh ciri-ciri morfologi koloni bakteri. Tahap

penting yang juga harus dilakukan dalam pencirian dan pengidentifikasian bakteri

adalah proses pewarnaan gram yang merupakan proses pewarnaan diferensial.

Hasil pengamatan morfologi koloni dan morfologi bakteri dapat dilihat dalam

Tabel 1 berikut.

Tabel 2. Karakteristik morfologi bakteri kitinolitik termofilik asal Tinggi Raja

Morfologi Koloni Morfologi Bakteri Kode Isolat Warna Bentuk Tepi Elevasi Bentuk Penataan warna gramTR 1 TR 2 TR 3 TR 4 TR 5

putih putih krem putih krem

bulat bulat bulat bulat bulat

gelombang rata rata

gelombang rata

tinggi cembung cembung cembung cembung

bulat batang bulat

batang bulat

diplo strepto diplo

strepto strepto

ungu merah ungu merah merah

+ - + - -


Dari warna koloni, 2 isolat yaitu TR3 dan TR5 berwarna krem sedang TR1,

TR2, dan TR4 koloni berwarna putih. Bentuk koloni umumnya sirkuler, koloni TR1

dan TR4 bertepi gelombang sedang yang lain rata. Permukaan koloni umumnya

cembung kecuali TR1.

Setelah proses pewarnaan dapat dilihat morfologi bakteri. Bentuk bervariasi

antara kokus dengan basil dan penataan bakteri bervariasi antara diplo dengan strepto.

TR1 dan TR3 memiliki persamaan bentuk, penataan, warna dan sifat gram yaitu bentuk

diplococus, warna ungu dan sifat gram positif. TR2 dan TR4 juga memiliki persamaan,

bentuk dan penataan bakteri streptobasil dengan warna bakteri merah menunjukkan uji

gram negatif.

Menurut Lay (1994), bakteri gram positif pada pewarnaan gram berwarna ungu

disebabkan kompleks zat warna kristal violet-yodium tetap dipertahankan meskipun

diberi larutan pemucat aseton alkohol. Sedangkan gram negatif berwarna merah sebab

kompleks tersebut larut pada saat pemberian aseton alkohol dan mengambil warna

merah safranin.

Perbedaan warna menunjukkan perbedaan struktur dinding sel bakteri.

Umumnya bakteri gram negatif memiliki dinding sel dengan kandungan lipida yang

tinggi, sehingga lipida larut oleh aseton alkohol. Sedangkan bakteri gram positif

memiliki struktur dinding sel berkomposisi peptidoglikan yang membentuk

persenyawaan kompleks kristal violet-yodium ribonukleat dan tidak larut dalam aseton

alkohol. Hasil pewarnaan bakteri dapat dilihat pada Gambar 5 berikut


TR 1 TR 2 TR 3

TR 4 TR 5 Gambar 5. Pewarnaan gram bakteri kitinolitik termofilik (perbesaran 16 X 100)

Uji biokimia sederhana yang telah dilakukan seperti uji motilitas, uji gelatin, uji

sitrat, uji oksidase, uji katalase, uji TSIA dan uji pati. Gambar hasil pengamatan uji

biokimia sederhana dapat dilihat pada lampiran 9. Uji biokimia lebih rinci pada Tabel

berikut.

Tabel 3. Karakterisasi sifat biokimia isolat kitinolitik termofilik Isolat TSIA SA Gelatin SIM SCA Katalase OksidaseTR 1 TR 2 TR 3 TR 4 TR 5

M - K M - M M - K M - K M - K

+ + + + +

- + - + -

+ + + + +

- - + - -

+ - - + +

+ + + + +

Keterangan : Merah (M) Starch agar (SA) Kuning (K) Triple sugar iron agar (TSIA) Simon citrate agar (SCA) S ulfide Indol Motility (SIM)


Reaksi yang terlihat pada TSIA menurut Lay (1994) adalah bila slant (basa)

berwarna merah dan butt (asam) berwarna kuning artinya bakteri tersebut mampu

memfermentasikan glukosa, dapat diamati pada isolat TR1, TR3, TR4 dan TR5. TR2,

slant dan butt berwarna merah yang berarti tidak mampu memfermentasikan ketiga

jenis gula (glukosa, laktosa atau sukrosa).

Pada uji pati semua isolat memberikan hasil yang positif dengan adanya zona

bening di sekitar koloni yang telah diinkubasi selama 24 jam ketika ditetesi dengan

beberapa tetes larutan lugol pada permukaan koloni. Hal ini menandakan bahwa isolat

tersebut mampu menghidrolisis pati. Pada uji gelatin hanya isolat TR2 dan TR4

menunjukkan hasil yang positif dengan mencairnya media gelatin yang ditumbuhi

mikroorganisme setelah dimasukkan ke dalam kulkas selama 30 menit. Motilitas

diamati dengan menggunakan médium semi padat SIM. Hasil uji menunjukkan bahwa

5 isolat bersifat motil yang ditandai dengan jejak pergerakan bakteri di dalam medium.

Hasil uji sitrat yang ditandai dengan perubahan media dari hijau menjadi biru,

mengindikasikan hanya isolat TR3 yang mampu menggunakan Na sitrat sebagai satu-

satunya sumber karbon. Dari uji katalase dengan penambahan larutan 3% H2O2

mengindikasikan bahwa isolat TR2 dan TR3 tidak memiliki enzim katalase yang

ditandai dengan tidak terbentuknya gelembung udara disekitar koloni tapi pada isolat

TR1, TR4 dan TR5 uji bersifat katalase positif.


Semua isolat menunjukkan uji positif untuk oksidase. Uji positif oksidase ditandai

dengan perubahan warna koloni menjadi hitam saat ditetesi dengan reagen dimetil-p-

fenillendiamin dalam waktu 30 menit. Menurut Lay (1994), perubahan warna

disebabkan oksidase sitokrom mengoksidasikan larutan reagen. Reagen yang

dioksidasekan berwarna hitam, hal ini tidak terjadi bila terjadi reaksi reduksi.

Uji katalase dilakukan untuk membuktikan adanya enzim katalase yang

berfungsi dalam penguraian H2O2 yang bersifat racun. Pada uji gelatin dapat diketahui

kemampuam mikroorganisme dalam menghidrolisis gelatin. Uji positif gelatinase

ditandai dengan medium gelatin yang tetap cair setelah dimasukkan ke dalam lemari

pendingin selama 30 menit, sedangkan uji positif sitrat ditandai dengan berubahnya

medium dari warna hijau menjadi biru karena terjadi penghilangan asam dan

peningkatan pH media.

4.3. Pengaruh Suhu Terhadap Aktivitas Kitinase Kasar

Pengujian pengaruh suhu terhadap aktifitas kitinase kasar dilakukan pada lima

isolat yang telah dikarakterisasikan. Uji ini dilakukan dengan menggunakan medium

kitin cair untuk mengetahui kemampuan kelima isolat dalam merombak kitin secara

kuantitatif. Data hasil pengamatan tertera pada Tabel 3 berikut.


Tabel 4. Aktifitas kitinase kasar pada suhu berbeda.

Notasi No. kode

Isolat Suhu ( oC)

Rata-rata Konsentrasi

GlcNAc (µg/ml)

Rata-rata Konsentrasi

GlcNAc (Unit) 0,05 1 TR 1 50 2.4314 0.011 d 55 2.7753 0.013 Cd 60 3.1742 0.014 C 65 3.7363 0.017 B 70 5.1025 0.023 A

2 TR 2 50 2.7807 0.013 - 55 3.0498 0.014 - 60 3.1943 0.014 - 65 5.5827 0.025 - 70 3.5710 0.016 -

3 TR 3 50 2.0862 0.009 B 55 3.2731 0.015 Ab 60 3.6277 0.016 A 65 4.1190 0.019 A 70 3.3976 0.015 A

4 TR 4 50 3.4063 0.015 C 55 5.7275 0.026 Bc 60 9.1871 0.042 A 65 7.2493 0.033 Ab 70 7.2578 0.033 Ab

5 TR 5 50 5.4462 0.025 B 55 5.6882 0.026 B 60 6.6861 0.030 A 65 4.8114 0.022 C 70 4.7158 0.021 D

Keterangan : Notasi berdasarkan hasil uji Duncan, angka-angka yang diikuti oleh

huruf dan pada kolom yang sama artinya tidak berbeda nyata Aktifitas kitinase dihitung berdasarkan N-asetilglukosamin yang terbentuk dari

hidrolisis kitin. Satu unit aktivitas kitinase didefinisikan sebagai jumlah enzim yang

membebaskan sebanyak 1µmol GlcNAc/jam pada kondisi tertentu (Sing et al, 1999).


Aktifitas kitinase kasar akan semakin meningkat seiring dengan kenaikan suhu

sampai ke tingkat optimal, setelah itu menurun. Penurunan aktifitas kitinase diduga

karena enzim mengalami denaturasi sehingga kehilangan sebagian aktifitasnya. Hasil

pengukuran aktifitas kitinase kasar bakteri termofilik asal Tinggi Raja menunjukkan

suhu optimal masing-masing spesies.

Suhu optimum aktifitas kitinase TR1 belum dapat ditetapkan sebab sampai suhu

tertinggi yang diujikan (suhu 70oC) aktifitasnya masih meningkat. Walaupun demikian,

dari data dapat diketahui bahwa kitinolitik yang dihasilkan TR1 adalah kitinolitik yang

aktif pada suhu tinggi. Profil aktifitas kitinase kasar bakteri termofilik terlihat pada

Gambar 6 sebagai berikut.

Gambar 6. Rataan aktifitas kitinase kasar (µg/ml) pada berbagai suhu


TR2 menunjukkan aktifitas yang tinggi pada suhu 65oC dan aktifitas menurun

pada suhu 70oC. Seperti halnya TR2, aktifitas kitinase TR3 juga menunjukkan suhu

optimum 65oC namun berbeda pada aktifitas kitinase kasar yang dihasilkan. TR4 dan

TR5 menunjukkan suhu optimum aktifitas kitinase kasar yakni 60oC untuk kemudian

aktifitas kitinase menurun pada suhu 70 oC

Menurut Rochima (2006), meningkatnya suhu menyebabkan energi kinetik enzim

semakin tinggi. Akibatnya, gerakan vibrasi, translasi dan rotasi enzim dengan subtrat

akan meningkat sehingga peluang keduanya bereaksi bertambah besar. Pemanasan pada

suhu 55-70 oC menyebabkan protein labil akan terdenaturasi. Untuk lebih jelas, aktifitas

kitinase kasar terlihat pada histogram di bawah ini (Gambar 7).

Gambar 7. Pengaruh suhu terhadap kitinase total bakteri termofil Tinggi Raja


Dari hasil pengamatan ditemukan adanya perbedaan nilai aktifitas berdasarkan

besarnya zona bening yang terbentuk dengan kemampuan menghasilkan enzim. TR3

yang memiliki zona bening terbesar ternyata memiliki kemampuan menghasilkan

enzim kasar yang tak sebanding, sebaliknya isolat TR1 memiliki zona bening yang

relatif kecil jika dibandingkan dengan isolat TR3, tetapi memiliki enzim yang tinggi

pada suhu diatas 70oC. Pada suhu tersebut TR1 masih menunjukkan peningkatan nilai

aktifitas kitinase totalnya. Diduga zona bening yang terbentuk pada saat itu kecil

disebabkan karena kondisi suhu yang diinginkan isolat TR1 tidak optimum. Pada uji

nisbi yang dilakukan menunjukkan fase pertumbuhan TR1 memiliki fase lag yang

panjang sebelum sampai ke fase log. Hal ini terlihat pada pengukuran hari ke tujuh TR1

menunjukkan diameter zona bening dan koloni terus melebar, pada TR3 menunjukkan

diameter zona bening dan koloni yang sama dengan hari ketiga (tetap).Seperti yang

dilaporkan Yurnaliza (2001), beberapa faktor seperti perbedaan jenis mikroorganisme,

kecepatan pertumbuhan setiap isolat pada medium padat dan cair, jumlah inokulum

yang diberikan pada kedua medium, dan tipe enzim kitinase yang dihasilkan, diduga

menjadi penyebab tidak berkorelasinya nilai aktivitas hidrolisis secara kualitatif dengan

nilai aktivitas enzim secara kuantitatif.

Kehadiran enzim kitinolitik pada medium pertumbuhan dapat dilihat dari reaksi

pelepasan GlcNAc dari koloidal kitin. Jeuniaux (1966), melaporkan kitinase mampu


menghidrolisis kitin menjadi kitobiose dan kitotriose, serta asetiglukosamin bebas juga

dapat dihasilkan terutama ketika substrat dalam bentuk koloidal kitin.

Kemampuan bakteri untuk memproduksi kitinase sangat bervariasi, mungkin

disebabkan perbedaan kecil pada gen yang mengkodenya (Tronsmo & Harman, 1993).

Nilai aktifitas unit enzim µmol/ml diperoleh dari konsentrasi kitinase kasar µg/ml

berbanding terbalik dengan berat molekul N-asetil glukosamin dalam satuan waktu

inkubasi.

Setiap spesies memiliki variasi terhadap perlakuan suhu yang berimplikasi

terhadap diproduksi dan disekresikannya enzim ke dalam medium. Beda sangat nyata

dicatat sebagai rentang suhu optimum bakteri termofilik dalam menghasilkan kitinase

kasar yang ditandai dengan besar aktifitas kitinase kasar yang terdeteksi oleh

spektrofotometer.

Hasil uji statistik sidik ragam yang digunakan untuk setiap isolat menunjukkan

bahwa untuk TR1 suhu memberikan pengaruh nyata pada α = 5%. Aktifitas pada suhu

70oC berbeda nyata terhadap suhu 50oC, 55oC, 60oC, dan 65oC, sedangkan aktifitas

pada suhu 50 oC dan 55 oC berbeda tidak nyata. Hasil uji sidik ragam pada isolat TR 2

tidak memberikan pengaruh terhadap perlakuan suhu.

Pada TR 3 aktifitas kitinase pada suhu 65oC berbeda nyata terhadap suhu 50oC

tetapi berbeda tidak nyata terhadap suhu 60oC ,70oC dan 55oC. Aktifitas kitinase pada

suhu 60oC berbeda nyata terhadap suhu 50oC, tapi berbeda tidak nyata terhadap

aktifitas kitinase pada suhu 70oC dan 55oC. Aktifitas kitinase pada suhu 70oC berbeda


nyata dengan suhu 50oC tapi berbeda tidak nyata terhadap aktifitas kitinase pada suhu

55oC.

Pada TR4 aktifitas kitinase pada suhu 60oC, berbeda nyata dengan aktifitas

kitinase pada suhu 50 oC, tetapi berbeda tidak nyata terhadap aktifitas kitinase pada

65oC dan 70oC. Aktifitas kitinase pada suhu 70oC berbeda nyata terhadap perlakuan

suhu 50oC tetapi tidak nyata terhadap aktifitas kitinase pada suhu 65oC.

Pada TR5 aktifitas kitinase pada suhu 60oC berbeda nyata terhadap perlakuan

suhu 70oC, 65oC, 55oC dan 50oC. Aktifitas kitinase pada suhu 55oC berbeda nyata

terhadap suhu 70oC, 65oC dan 60oC tetapi berbeda tidak nyata dengan aktifitas kitinase

pada suhu 50oC. Aktifitas kitinase pada suhu 50oC berbeda nyata dengan aktifitas

kitinase pada suhu 65oC. Perhitungan sidik ragam dapat dilihat pada lampiran 11.

Hasil pengukuran aktifitas enzim pada berbagai suhu memperlihatkan beberapa

puncak aktifitas enzim kasar, kecuali isolat TR1 yang masih menunjukkan peningkatan

kadar konsentrasi N-asetil glukosamin walaupun telah berada pada suhu 70oC . Hal ini

jelas terlihat pada hasil uji jarak Duncan, pada rentang 60oC-70oC setiap isolat

menunjukkan hasil beda sangat nyata yang identik dengan rentang suhu optimum untuk

aktifitas U/ml kitinase kasar.

Variasi aktifitas kitinase kasar tersebut selain dipengaruh oleh temperatur juga

dipengaruhi oleh jenis dan komposisi media, fase pertumbuhan bakteri itu sendiri,

kemampuan bakteri dan koloninya dalam mengekstraksi enzim kasar. Variasi ini tidak

saja terlihat dari jumlah aktivitas kitinase total yang diproduksi setiap speciesnya, tetapi


juga pada jenis kitinase yang dihasilkan. Semua enzim yang dapat mendegradasi kitin,

disebut kitinase total atau kitinase non-spesifik (Nugroho et al., 2003).


BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1. Kesimpulan

Dari hasil penelitian yang telah dilakukan dapat disimpulkan beberapa hal

sebagai berikut :

a. Dari 32 isolat yang berasal dari sumber air panas Tinggi Raja diperoleh 5 isolat

bakteri termofilik penghasil kitinase yang memiliki zona bening terbesar.

b. Kelima isolat memiliki karakteristik biokimia dan morfologi yang berbeda.

c. Isolat TR3 menghasilkan zona bening terbesar 49,44mm.

d. Isolat TR1 menunjukkan aktifitas kitinase tertinggi dan masih terus meningkat pada

suhu 70oC.

5.2. Saran

Berdasarkan hasil penelitian terhadap bakteri kitinolitik termofil dari Tinggi

Raja maka perlu dilakukan penelitian lanjutan, sehingga dapat ditetapkan waktu

pemanenan, pH dan faktor fisik lain yang memungkinkan diperolehnya kondisi optimal

agar kitinase termofil dapat maksimal diproduksi.

Isolat TR1 agar ditindaklanjuti dalam penelitian berikutnya, sebab kemampuan

memproduksi kitinase kasar yang tahan terhadap suhu panas dalam penelitian ini belum

terdeteksi secara tuntas.


DAFTAR PUSTAKA

Aguilar, C.F.I. Sanderson, M. Moracci, M. Claramella, R. Nucci, M. Rossi & L.H.

Pearl. 1998. Crystal Structure Hyperthermophilic Archeon Sulfolobus solfatoricus as a Key Factor In Thermostability, Mol. Biol, 271:789-802

Arnold, L.D. & Solomon, N.A. 1986. Manual Industrial Microbiology, American

Society for Microbiology, Washington D.C. Atlas, R.M. 1990. Handbook of Media for Enviromental Microbiologi, University Of

Louisville CRC Perss, Boca Roton, New York. Baldwin, E. 1973. Dynamyc Aspects of Biochemistry, Cambridge : University Perss. Bielka, H. H.B.F. Dixon, P. Karlson, C. Liebeeg, N. Sharon, F. J. Van Lenten, S.

F.Velix, J. F. G. Vliegenhart & E. C. Webb. 1984. Enzyme Nomenclature.Academic Press, Inc. New york.

BKSDA Sumatera Utara. 2003. Rencana Pengelolaan Cagar Alam Dolok Tinggi Raja

Kabupaten Simalungun, Balai Konservasi Sumber Daya Alam, Sumatera Utara : 447-465

BKSDA Sumatera Utara. 2003. Laporan Evaluasi Fungsi Kawasan Cagar Alam Dolok

Tinggi Raja Kabupaten Simalungun Tahun 2003 Balai Konservasi Sumber Daya Alam Sumatera Utara :18-19

Brock,T.D. 1986. Thermophiles: General, Moleculer & Applied Microbiology,

University of Wisconsin – Madison, USA. Cabib, E. 1987. The Synthesis & Degradation of Chitin. Dalam A. Meister (Ed)

Advances in Enzymology. An Interscience Publication John Willey & Sons Inc. New York. 59 : 59-101

Chasanah, E.2004. Characterization of chitosanase of Bacillus licheniformis MB-2

from Manado hot spring water. J. Mikrobiol. Institut Pertanian Bogor. Chernin, L.S. Michael, K.W. Jacquelyn, M. T. Shoshan, H. Barrie, W.B. Cheat, W &

Gordon, S.A. B, Stewart. 1998. Chitinolytic Activity in Chromobacterium violaceum: J. Bacteriol. 18 : 435-441


Cohen-Kupiec R & Chet, I. 1998. The Molecular Biology of Chitin Digestion, Curr. Opinion Biothecnol. 93: 331-334

Darwis, A.A. & Sunarti, T.C.1992. Teknologi Mikrobial, Institut Pertanian Bogor. Edward, C. 1990. Thermophiles, Microbiology of Extreme Environtments. Alden Perss,

oxford. Gao, J. M.W. Bauer, K.R. Shockley, M.A. Pysz, & R.M. Kelly. 2003. Growth of

Hiperthermophilic Archaeon Pyrococcus furiosus on Chitin Involves Two Family 18 Chitinases. Appl. Environ. Microbiol. 69: 319-3128

George, G. 2001. Bergey’s Manual of systematic bacteriology. Springer–verling, New

York, USA. Vol. 1 Girindra, A.1993. Biokimia I, Cetakan 3, Jakarta, Gramedia, 100-101 Haran, S. & Chet, I. 1995. New Components of the Chitinolytic System of

Thrichoderma harzianum, Mycol Rev. 94 : 441-446 Harman, G.E. Hayes, C.K. Lorito, M. Broadway, R.M. Di Pietro, A. Peterbauer, C. &

Tronsmo A.1993. Chitinolytic Enzymes of Trichoderma harzianum: Purification of Chitobiosidase & Endochitinase. Phytopathology. 83: 313-318

Hanafiah, K.A. 1993. Rancangan Percobaan: Teori dan Aplikasi, F.P. Universitas

Sriwijaya Palembang, PT RajaGrafindo Persada, Jakarta, 68 Inbar, J. & I. Chet. 1991. Evidence That Chitinase Produced by Aeromonas caviae is

Involved in The Biological Control of Soil-Borne. Plant Pathogens by The Bacterium Soil Biol. Biochem. 23: 973-978

Indrajaya, W. F.M. Akhmaloka. 2003. Isolation & Identification of Thermophilic

Microorganism from Wayang Crater, J. Mikrobiol. 8: 53-56 Jayanti, J.F.L. 2002. Thermostable Chitinase & Chitin Deacetylase From Manado

Isolates. Skripsi Sarjana Jurusan Teknologi Pangan dan Gizi. Institut Pertanian Bogor.

Jeaniaux, C. 1966. Chitinases, Dalam E, F. Neufeld & V. Ginburg (Eds.) Complex

Carbohydrates. Methods in Enzymology. Academic Press, New York. 8: 644-650


Khairul. 2007. Tinggi Raja Salju di tengah Air Panas, <http://Khairulid.blogspot.com> (13 Maret 2005)

Lay, B.W. 1994. Analisa Mikroba di Laboratorium. Edisi 1. Cetakan 1. Jakarta: PT Raja Grafindo Persada. 99-100 p.

Lehninger, A.L. 1997. Dasar-Dasar Biokimia, alih Bahasa Maggy Thenawijaya, Jilid 1,

Jakarta, Erlangga. 235-274 Lestari, P. 2000. Eksplorasi Enzim Termostabil dari Mikroba Termofil, fakultas

Biologi, Univ. Jendral Sudirman, Purwokerto. J. Hayati. l7: 21-25 Lloyd, A. B., R. L. Noveroske & J. L. Lockwood. 1965. Lysis of Fungal Mycelium by

Streptomyces spp. and Their Chitinase Systems. Phytopathology. 55: 871–875. Lorian,V, N.D. 1980. Antibiotic In Laboratory Medicine. Williams & Wilkins.

Baltimore. London. Madigan, M.T. 1997, Extremophiles Scientific American. 82-87 Meidina, Sugyono, Jenie, B.S.L. Suhartono, M.T. 2005. Aktifitas Antibakteri Oligomer

Kitin yang Diproduksi Menggunakan Kitin Dari Isolat B. licheniformis MB-2, Departemen Teknologi Pangan dan Gizi, Institut Pertanian Bogor, Bogor.288-293

Murray, R.K.,Granner, D.K., Rodwell, V.W., 2003, Biokimia, Jakarta , EGC. 70-102 Muzzarelli, R.A. A. 1985. Chitin, Dalam G. O. Aspinal (Ed.) The polysaccharides.

Academic Press Inc., New York. 3:41-7450 Nugroho, T.T. Ginting, C. Ali, M. Dahliaty, A. Wahyuningsih, Devi, S. & Sukmarisa,

Y. 2003 Isolasi dan Karakterisasi Sebagian Kitinase Trichoderma viride, J. Natur Indonesia. 5:101-106

Paulitz, T.C. & Belanger, R.R. 2001. Biological Control In Greenhouse Systems Annu.

Rev. Phytopathol. 39: 123-133 Priyatno, T.P. Sudjono, M.S. Y. Chaerani, Suryadi, & Sudjadi, M. 2000. Tehnik

Produksi Dan Formulasi Bakteri Kitinolitik Untuk Pengendalian Penyakit Karat Kedelai. J. Natur Indonesia. 5: 229-235


Poernomo, A.T. Purwanto, D.A. 2003. Enzim Kitinase. Majalah Farmasi Airlangga. Jakarta. 3(3): 31-32

Poernomo. 2004. Kitinase Dalam Pengendalian Hayati. Majalah Farmasi Airlangga.

Jakarta. 4(2): 24-27 Rahayu, S. 2000. Eksplorasi Bakteri Termofilik Penghasil Kitinase Asal Indonesia,

Prosiding Seminar Penelitian Bidang Ilmu Hayat ke-2, IPB, Bogor. Reissig, J. L. Strominger, J.L. Leloir L.F. 1955. A Modified Colorimetric Methods for

the Estimation of N–acetylamino Sugars. J. Biol. Chem. 217, 959. Rochima, E. 2006. Pemurnian Dan Karakterisasi Kitin Deasetilase Termostabil dari

Bacillus papandayan Asal Kawah Kamojang Jawa Barat, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Padjadjaran, Jatinangor. Bandung. 8: 193-209

Rogis, A. 2007 Karakterisasi Uji Efikasi Bahan Senyawa Alami Chitosan Terhadap

Patogen Pasca Panen Antraknosa Colletotricum musae, Fakultas Pertanian, Universitas Bengkulu. J. Ilmu-ilmu Pertanian. 9: 58-63

Rudiger, A. 1994. Enzym From Extremethermophili & Hyperthermophilic Archea &

Bacteria, VCH Verllagsgesellschraf mbH. 946-941 Sahai, A.S. & M.S. Manocha. 1993. Chitinases of Fungi & Plants: Their Involvement

in Morphogenesis & Host-Parasite Interaction. FEMS Microbiol.Rev. 11: 337-338.

Sanford, P.T. 2003. World Market of Chitin & its Derivatives. Di dalam Varum KM,

Domard A & Smidsrod O, editors. Advances in Chitin Science. Trondheim, Norway.6: 51-69

Scopes, R. K. 1994. Protein Purification, Principles & Practice. Third edition. Springer-

Verlag, New York. Sharmili, S.A. Ramasay, P. 2003. Occurrence & Antibiotic Resistance of Thermophilic

Bacteria From The Coramandal Coast, bay of Benggal, Tamilnandu, India, Department of Biotechnology University of Madras Guindy Campus Chennai-600025

Singh ,P.P., Y.C. Shin, C.S. Park & Y.R. Chung, 1999. Biological Control of Fusarium

Wilt of Cucumber By Chitinolytic Bacteri. Phytopathol I. 89: 92-99


Sudarmadji, H.S. & Bambang S. 1984. Prosedur Analisa untuk Bahan Makanan dan

Pertanian, Edisi Ketiga, Cetakan 1.Yogyakarta, Penerbit Liberty. Sundoro, H. 2006. Penyelidikan Geologi dan Geokimia Daerah Panas Bumi Kabupaten

Simalungun SUMUT, Proceding Pemaparan hasil kegiatan lapangan, Pusat Sumber Daya Geologi 2006.

Suryanto, D. Munir, E. & Yurnaliza. 2005. Eksplorasi Bakteri Kitinolitik: Keragaman

Genetik Gen Penyandi Kitinase pada Berbagai Jenis Bakteri dan Pemanfaatannya, Laporan Penelitian, FMIPA, Universitas Sumatera Utara, Medan

Tronsmo, A. & Harman, G.E. 1993. Detection & Quantification of N-acetyl-Beta-D-

Glucosaminidase, Chitobiosidase, & Endochitinase in Solutions & On Gels. Anal. Biochem. 208: 74-79.

Tsujibo, H., N. Kondo, K. Tanaka, K. Miyamoto, N. Bao, & Y. Imamori. 1999.

Molecular Analysis of The Gene Encoding a Novel Transglycosylative Enzyme from Alteromonas sp. Strain 0-7 & Its Physiological Role in The Chitinolitic System. J. Bacteriol. 81: 5461-5466.

Vieille, C. & Zeikus, G.J. 2001. Hyperthermophilic Enzymes: Sources, Uses, &

Molecular Mechanisms for Thermostability. Biochemistry Department, Michigan State University, East Lansing, Michigan 48824,1 & MBI International. 65: 20

Wang, S. Wu, J. Rao, P. Ng T.B. & Ye, X. 2005. A Chitinase With Antifungal Activity

From the Mung bean. Protein Expr Pufif 40: 230-236. Wijaya, S. 2002. Isolasi Kitinase dari Scleroderma columnare dan Thricoderma

harzianum, J. Ilmu Dasar. Kalimantan, Fakultas MIPA Universitas Jember. 3: 30-35.

Wu, M.L., Y. C. Chuang, J .P. Chen, C. S. Chen & M. C. Chang. 2001. Identification &

characterization of the Three Chitin-Binding Domains within the Multidomain Chitinase Chi92 from Aeromonas hydrophila jp 101. Appl Environ Microbiol. 67: 5100-5106.

Yurnaliza, 2002, Senyawa Kitin dan Kajian Aktivitas Enzim Mikrobial

Pendegradasinya. Fakultas MIPA, Universitas Sumatera Utara. 1-12


Lampiran 1. Preparasi koloidal kitin

20 gram kitin komersial

dilarutkan dalam 400 ml HCl didiamkan 24 jam,suhu 4oC disaring dengan glass wool

filtrat ditambah 200ml aquades dingin dan 10 N natrium hidroksida sampai pH 7. Disentrifus pada 7000 rpm, 20 menit

Pellet

Diresuspensi aquades Disentrifus 15 menit Disimpan pada suhu 4oC

Pellet


Lampiran 2. Isolasi Bakteri

Sumber air Panas

Disimpan dalam botol sampel

sampel dibawa ke laboratorium

1 ml air panas

Diinokulasi kedalam 10 ml media kitin

Kultivasi pada suhu 65 oC

Biakan campuran


Lampiran 3. Penyiapan Biakan Murni Bakteri Kitinolitik

Isolasi campuran

Kultur dari isolat campuran

Diisolasi pada Media Kitin

Diinkubasi pada suhu 65oC, selama 1-5 hari.

Isolat kitinolitik

Koloidal Kitin, Garam minimum, Agar,aquades

Analisis diameter zona halo dan diameter koloni bakteri dimurnikan

Penentuan Aktifitas kitinase

Isolat murni bakteri kitinase


Lampiran 4. Karakterisasi Sifat Morfologi dan Biokimia Isolat

Uji Biokimia Morfologi Pewarnaan Gram

karakterisasi

Isolat Terpilih

Bentuk koloni Warna koloni Tepi koloni

Elevasi koloni Bentuk dan Penataan Sel

Uji motilitas, Uji sitrat, Uji gelatin, Uji katalase

Uji oksidase, uji karbohidrat

Analisis


Lampiran 5. Isolasi enzim kitinase kasar

2 Ose isolat bakteri kitinolitik

Starter

Ditumbuhkan dalam labu erlenmenyer 250 mL yang berisi 100 mL kitin cair dengan pH 7

Digoncang dengan shaker pada kecepatan 120 rpm Pada suhu ruang selama 24 jam

Dipipet 1 mL ( 5% starter )

Ditumbuhkan dalam labu erlenmenyer 100 mL yang berisikan 20 mL kitin cair dengan ph 7

Digoncang dengan shaker pada kecepatan 120 rpm pada suhu ruang selama 72 jam

Kultur bakteri kitinolitik

Disentrifungsikan dengan kecepatan 6000 rpm selama 20 menit pada suhu ruang

supernatan endapan

Kitinase kasar Uji aktifitas berdasarkan pengaruh Suhu

Hasil


Lampiran 6. Penentuan Aktifitas Kitinase dengan variasi Suhu

3 mL Kitinase kasar Dimasukan kedalam tabung reaksi

Ditambahkan 3 mL subtrat kitin dalam 50 mM

buffer pospat dengan pH 7.

Diinkubasi pada berbagai suhu (50, 55, 60, 65 dan

70 oC)

Disentrifugasi (6000 rpm, 20 menit)

Supernatant N-asetil glikosamin Endapan

Dipipet 0,5 mL

Dimasukan kedalam tabung reaksi

Ditambah 0,1 mL larutan Na2B4O7 0,8 M

Dipanaskan 3 menit

Didinginkan

Ditambah 3 mL larutan B

Divorteks

Diukur serapan dengan spektrofotometer pada panjang

gelombang 538 nm

Serapan


Lampiran 7. Alur Kerja Pembuatan Kurva Standard N-asetil Glukosamin

(GlcAc)

Larutan standar GlcNAc

dibuat pengenceraan 20, 30, 50, 80, 100 µg/ml

dipipet 0,5 ml kedalam tabung reaksi

0,5 ml larutan standar

GlcNac dalam tabung reaksi

ditambahkan 0,1 ml larutan A

dipanaska selama 30 menit

didinginkan

ditambahkan 3ml larutan B

divorteks

diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37ºC

diukur absorbansi warna dengan spektrofotometer

pada panjang gelombang 538 nm Absorbansi

Dibuat kurva standar dan persamaan regresinya

Kurva standar


Lampiran 8. Peta Lokasi Sumber Isolat

Peta Situasi Tinggi Raja


Lampiran 9 Pengamatan Uji Biokimia Sederhana.

TR 1 TR 2 TR 3 TR 4 TR 5

A. Keterangan : Gambar A Gambar B TR 1 TR 2 TR 3 TR 4 TR 5 Uji SCA Uji SIM

Uji TSIA

Uji Gelatin B


58

Lampiran 10. Data penentuan kurva standar GlcNAc dengan menggunakan

spektrofotometer λ = 538 nm

No Konsentrasi GlcNAc (µg/ml) Absorbansi

1 0 0

2 20 0.132

3 30 0.169

4 50 0.24

5 80 0.342

6 100 0.455

Dari tabel di atas dapat ditentukan persamaan garis regresi kurva standar larutan

GlcNAc dengan metode Least Square sebagai berikut :

Y = a + bX

Dimana: a = intersep

b = slope (koefisien regresi)

bXYa −=

( )∑ ∑∑ ∑ ∑

−

−= 22 )(

))(()(

XXn

YXXYnb

No X Y X2 Y2 XY 1 0 0 0 0 0 2 20 0.132 400 0.0174 2.64 3 30 0.169 900 0.0286 5.07 4 50 0.24 2500 0.0576 12 5 80 0.342 1600 0.117 27.36 6 100 0.455 10000 0.207 45.5 n=6 ∑ X= 280 ∑ Y=1.338 ∑ X2=15400 ∑ Y2= 0.4276 ∑ XY=92.57

59

( )( ) ( )( )( ) ( )

0042,0280202006

338,128057,926)(

))(()(

2

22

=−

−=

−

−=

∑ ∑∑ ∑ ∑

b

b

XXn

YXXYnb

( )027,0

67,460042,0223,0=

−=−=

aa

bXYa

( )( )

( ) ( )

( )( )

( ) ( )

9925,0

6338,14276,0

628020200

6338,128057,92

22

22

22

=

⎥⎦

⎤⎢⎣

⎡−⎥

⎦

⎤⎢⎣

⎡−

−=

⎥⎥⎦

⎤

⎢⎢⎣

⎡−

⎥⎥⎦

⎤

⎢⎢⎣

⎡−

−=

∑ ∑∑ ∑

∑ ∑∑

r

r

nY

YnX

X

nYX

XYr

Persamaan garis regresinya adalah : Y = 0,027 + 0,0042X dengan korelasi r = 0,9925

60

Lampiran 11. Daftar Sidik Ragam & Uji Duncan 5 isolat bakteri Kitinase Termofilik

Daftar Sidik Ragam Konsentrasi Kitinase Kasar TR 1 terhadap Suhu.

Ftabel SK Db JK KT Fhitung 0.05 0.01

Suhu 4 13.15 3.2875 65.75** 3.48 5.99 Galat Percobaan 10 0.5 0.05

Total 14 13.65

Keterangan ** = berbeda Sangat nyata pada α (0.01) KK = 6.50 %


Ftabel SK Db JK KT Fhitung 0.05 0.01

Suhu 4 15.17 3.79 2.87tn 3.48 5.99Galat Percobaan 10 13.18 1.32

Total 14 28.35

Keterangan tn = tidak berbeda nyata pada α (0.01) dan α (0.05) KK = 31.54 % Karena tidak berbeda nyata maka tidak dilakukan uji Duncan

61


SK Db JK KT Fhitung Ftabel 0.05 0.01

Suhu 4 6,78 1.70 3.74** 3.48 5.99Galat Percobaan 10 4.53 0.45

Total 14 11.31

Keterangan ** = berbeda sangat nyata pada α (0.01)

* = berbeda nyata pada α (0.05) KK= 20.33%


Ftabel SK Db JK KT Fhitung

0.05 0.01

Perlakuan 4 54.02 13.51 56.29** 3.48 5.99 Galat Percobaan 10 2.42 0.24

Total 14 56.44

Keterangan ** = berbeda Sangat nyata pada α (0.01) Koefisien Keragaman KK = 7.46 %.

62


SK Db JK KT Fhitung Ftabel 0.05 0.01

Perlakuan 4 7.71 1.93 24.13 3.48 5.99Galat Percobaan 10 0.79 0.08

Total 14 8.5

Keterangan ** = berbeda Sangat nyata pada α (0.01) Koefisien Keragaman. = 5.17 %

63

Lampiran 12. Foto-foto pengamatan sifat fisik air panas Tinggi Raja

Foto 1. pengukuran pH air panas Tinggi Raja

Foto 2. pengukuran suhu

64

suhu 63oC pH 7.2

x

suhu 57 oC pH 7,1 x Suhu 59 oC pH 6,9 x

Foto 3. Beberapa titik pengambilan air panas

65

Foto 4. Panorama Alam Sumber Air Panas Tinggi Raja

isolasi bakteri dan uji aktivitas kitinase termofilik kasar dari sumber ...

Documents

Transcript of isolasi bakteri dan uji aktivitas kitinase termofilik kasar dari sumber ...