IDENTIFIKASI MOLEKULER BELATUNG LALAT YANG DITEMUKAN DARI MAYAT SELAMA

INVESTIGASI KEJADIAN KEMATIAN DI MALAYSIA

Akhmad Fajrin Priadinata1102008270

Ilmu Kedokteran Forensik dan MedikolegaUniversitas YARSI

ABSTRAK

Identifikasi belatung lalat dari mayat sangat penting dalam menentukan interval post-mortem. Identifikasi morfologi larva, dan urutan DNA dalam mitokondria lalat ini dapat berguna dalam mengkonfirmasikan identitas kematian. Selain itu, hubungan kekerabatan lalat ini

dapat dijelaskan dari DNA mitokondria.

Analisis filogenetik mengkonfirmasikan adanya 5 spesies lalat. C. megacephala dan C. rufifacies adalah spesies lalat utama yang ditemukan dihabitat kejadian kematian yang ditemukan diperkotaan, hutan dan perairan daerah di Malaysia

PENDAHULUAN

Bukti serangga (Insect Evidence) sangat berharga untuk membuktikan perkirakan waktu minimum kematian atau interval post-mortem (PMI) dalam penyelidikan forensik.

Pemeriksaan PMI jika dilakukan secara akurat,Estimasi PMI dapat membantu dalam identifikasi seseorang yang meninggal

Dalam beberapa tahun terakhir, telah terjadi peningkatan dalam penggunaan urutan DNA dalam studi bangkai lalat (carrion flies), sebagai bantuan secara akurat untuk mengidentifikasi serangga bahkan dalam tahap dewasa

Mitokondria genom digunakan untuk analisis serta diterapkan untuk identifikasi tingkat spesies, sitokrom oksidase subunit I (COI) berguna untuk identifikasi Chrysomyinae (Diptera: Calliphoridae)

PEN DAHULUAN

Studi penelitian ini menilai kegunaan COI 'barcode' untuk identifikasi spesimen larva yang dikumpulkan dari mayat selama investigasi kejadian kematian di Malaysia.

Tujuannya adalah untuk membantu dalam pelaksanaan masa depan forensik entomologi khususnya pendekatan molekuler sebagai alat dalam TKP investigasi di Malaysia.

BAHAN DAN METODE

Spesimen : Spesimen belatung dikumpulkan dari 33 mayat selama

investigasi kejadian kematian, 37 belatung spesimen tersedia untuk identifikasi morfologi dan molekuler.

Spesimen belatung dikumpulkan langsung ke botol gelas yang berisi 70% Ethanol untuk identifikasi morfologi dan molekuler, disesuaikan dengan prosedur yang ditetapkan (Institut Penelitian Medis, 2011). V

oucher deposito dari semua spesimen disimpan di Entomologi Medical Unit, Institute for Medical Research, yang telah WHO bangun sebagai Pusat Vektor sejak tahun 1985. Rincian semua belatung sam-prinsip disajikan pada Tabel 1.

PENGOLAHAN LARVA UNTUK IDENTIFIKASI MORFOLOGI.

Prosedur yang digunakan mengikuti prosedur Kavitha et al. (2011). Secara singkat, spesimen yang dikumpulkan dalam etanol 70% kemudian direndam dalam 10% kalium hidroksida (KOH) semalam. Organ internal belatung lalat telah dihapus dan direndam dalam asam asetat selama 10 menit dan kemudian dalam serangkaian etanol konsentrasi bertingkat.

Belatung kemudian direndam dalam alkohol absolut, dibersihkan dalam minyak cengkeh dan tenggelam dalam xilena sebelum dipasang pada slide kaca dengan balsam Kanada. Belatung diidentifikasi di bawah mikroskop cahaya pada Perbesaran 100x dan 400x menggunakan tombol taksonomi Zumpt (1965) dan Omar (2002).

DNA EKSTRAKSI

DNA total dibuat dari spesimen menggunakan QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN Inc, Valen-cia, CA). Kemudian diekstraksi dengan DNA dielusi dalam 200μl buffer elusi dan disimpan pada -20 ° C untuk penyimpanan jangka panjang. Fraksi DNA diekstraksi adalah spektrofotometri kuantitatif menilai dan diencerkan dengan konsentrasi 50ng/μl sebelum untuk PCR amplifikasi.

PCR AMPLIFIKASI.DNA mitokondria diekstraksi dan 328 pasangan basa nukleotida dari

mitokondria sitokrom oksidase subunit saya diperkuat. PCR campuran amplifikasi-tion siap untuk memuat: 100ng template DNA, 1 unit Ta q polimerase (Promega ™, USA), 1x PCR reaksi penyangga (Promega ™), 1,5 mM MgCl2 (Promega ™) dan 200 pM setiap dNTP (Promega ™) dan 0,4 M masing-masing primer maju dan mundur (1st Base). Reaksi am-plification dilakukan di T1 thermocycler (Biometra ™). Primer yang digunakan dalam penelitian ini dirancang berdasarkan deskripsi Sperling et al. (1994): C1-N-2800 (5'-CATTTCAAGCTGTGTAAGCATC-3')danC1-J-2495 (5'CAGCTACTTTATGAGCTTTAGG-3'). Itu Kondisi PCR bersepeda adalah sebagai berikut: denaturasi awal pada 95 ° C selama 5 menit, 35 siklus denaturasi pada 95 ° C selama 1 menit, annealing pada 45 ° C selama 2 menit, perpanjangan 72 ° C selama 2 menit, dan pemanjangan akhir pada 72 ° C selama 7 menit. Produk PCR dipisahkan elektroforesis pada 1% gel agarosa (Promega ™) dan divisualisasikan setelah etidium bro-mide pewarnaan.

Pemurnian produk PCR.PCR produk dimurnikan sebelum kloning atau sequencing langsung, menggunakan QIAquick yang ® PCR Pemurnian Kit dan QIAquick ® Gel Extraction Kit (QIAGEN ™), sesuai dengan protokol produsen. Keberhasilan PCR pemurnian produk dikonfirmasi oleh elektroforesis gel agarosa.

Kloning dan sequencing .Produk PCR dimurnikan kemudian diklon ke ®-T sistem vektor pGEM Easy (Promega ™) untuk memfasilitasi prosedur sekuensing DNA. Sequencing dilakukan dengan menggunakan ABI Prism ™ BigDye ™ Terminator Cy cle-Sequencing Siap Reaksi Kit (versi 3.1 Terapan Biosystems ®, Foster City). Kedua DNA maju dan mundur helai semua sampel disekuensing. Electrophoresis dan deteksi produk-produk reaksi sekuensing dilakukan dengan menggunakan elektroforesis kapiler sistem ABI PRISM ™ 3730xl sequencer DNA kapiler dengan panjang kapiler 80cm.

Sequence alignment DNA dan analisis filogenetik. Urutan acuan dilaporkan sebelumnya dari lalat pulih yang berasal dari mayat di Malaysia (Lee et al., 2004) yang diambil dari GenBank dan digunakan untuk analisis filogenetik, yaitu Calliphora vicina AJ417702, Chrysomya bezziana AF295548, Chrysomya megacephala AF295551, Chrysomya nigripe GU174026, Chrysomya pinguis AY092759, Chrysomya rufifacies AF083658, Chrysomya villeneuvi FJ195382, Hemipyrellia ligurriens AY097334, Hermetia illucens GQ465783, Lucilia cuprina AJ417707, Megaselia scalaris AF217464, Ophyra spinigera EU627714, Sarcophaga ruficornis EF405941 dan Synthesiomyia nudiseta EU627713. Urutan keselarasan dan tetangga-bergabung pohon (Saitou dan Nei 1987) dibuat dengan menggunakan dukungan bootstrap berasal dari 1.000 MEGA 4 ( Tamura et al., 2007) dan ulangan dan menghargai di atas 50% yang akan ditampilkan. Semua urutan yang diperoleh dari 37 sampel belatung dimasukkan dalam analisis filogenetik

HASIL

Dari kejadian kematian, dimana mayat-mayat yang telah ditemukan diklasifikasikan menjadi 3 ekotipe: 17 mayat ditemukan di perumahan daerah, 11 mayat di daerah pedesaan dan 5 di sungai (disebut 'Air') (Tabel 1).

Mayat laki-laki yang dilaporkan dalam 21 kasus dan mayat perempuan dalam 12 kasus. Dalam sebagian besar kasus, kesulitan-kesulitan yang dihadapi dalam mengidentifikasi asal etnis mayat karena mereka berada di stadium lanjut dekomposisi posisi (Tabel 1).

Kecuali untuk kasus nomor 3, 6, 10 dan 16 yang memiliki kutu ganda belatung lalat, semua kasus lain terdiri kutu belatung tunggal. Berdasarkan molekul filogeni gen COI (gambar 1), 5 jenis meniup spesies lalat diidentifikasi, yaitu C. megacephala, C. rufifacies, C. nigripes, H. ligurriens dan Sarcophaga ruficornis. Berdasarkan COI barcode, C. megacephala diidentifikasi dalam 22 kasus, C. rufifacies di 9 kasus, C. nigripes dalam 2 kasus, H. Lig-urriens dalam 1 kasus dan S. ruficornis dalam 3 kasus (Tabel 1). C. meg-acephala dan C. rufifacies adalah spesies utama yang ditemukan dalam Adegan kematian.

HASIL

Identifikasi spesies berdasarkan morfologi dibandingkan filogeni molekuler dalam konkordansi di 30 spesimen (91%). Dalam 4 spesimen, dari kasus-kasus nomor 8, 9, 14 dan 27, ada perbedaan antara morfologi dan identifikasi molekuler. Dalam 3 dari spesimen, dari kasus-kasus 11, 17 dan 18, identifikasi morfologi tidak bisa dilakukan karena kehadiran hanya telur dan larva instar 1. Sebuah pohon filogenetik dibangun oleh tetangga-bergabung (NJ) metode yang didasarkan pada COI urutan nukleotida sampel belatung dikumpulkan dari TKP bersama urutan referensi diambil dari GenBank, dan pohon diuji dengan 1.000 bootstrap ulangan (Gambar 1).

Chrysomya megacephala, C. rufifacies dan C. nigripes semua baik dipisahkan meskipun mereka berasal dari genus yang sama, menyiratkan bahwa urutan COI berguna untuk identifikasi dari spesies congeneric. Semua C. megacephala, C. rufifacies dan C. nigripes isolat membentuk satu cluster dengan bercabang menunjukkan variasi nukleotida kecil dalam spesies yang sama. H. ligurriens dan S. ruficornis jelas dipisahkan dinilai dari C. megacephala, C. rufifacies dan C. nigripes dan semua 5 isolat berkumpul bersama-sama

PEMBAHASAN

Pengetahuan Entomologi dapat diterapkan dalam investigasi kriminal. Secara khusus, perhitungan umur larva memungkinkan penentuan minimal post-mortem interval (PMI), yang sering merupakan detail penting bagi polisi dalam investigasi.

Hal ini, dengan demikian cukup penting untuk secara benar mengidentifikasi larva dari mayat untuk menghitung PMI minimum benar .

Langkah awal yang diperlukan untuk mengamankan penggunaan Calliphoridae untuk estimasi PMI adalah identifikasi secara akurat tingkat spesies dari spesimen setiap tahap siklus hidup.

Jika penentuan spesies salah, estimasi selang post-mortem dan kesimpulan lainnya akan valid. Wilayah COI 'barcode' ini dievaluasi sebagai penanda molekuler untuk resolusi spesies-level 5, spesies lalat di Malaysia selama TKP investigasi.

Pendekatan ini berguna untuk identifikasi akurat-fikasi dari Calliphoridae Malaysia dan mungkin menjadi strategi mengetik sensitif bagi Calliphoridae lalat dikaitkan dengan kerja kasus forensik.

Beberapa penelitian menggunakan identifikasi berbasis DNA dari beberapa spesimen terbangforensik penting telah kembali

Alat molekular ini dapat mengatasi berbagai kesulitan yang berhubungan dengan masalah morfologi jika perlu untuk mengidentifikasi fragmen kecil dari bahan serangga atau larva yang sangat muda (Preativa-tanyou et al., 2010).

DNA mitokondria (mtDNA) menawarkan beberapa keunggulan dibandingkan DNA inti: yang terakhir mengalami tingkat mutasi yang relatif lambat dibandingkan dengan mtDNA sehingga identifikasi akan membutuhkan lebih lama nukleotida se-quence daripada yang diperlukan dengan mtDNA. Hal ini membuat mtDNA alat yang lebih baik untuk mengetahui perbedaan urutan spesies terkait erat (Waugh, 2007) dan, karena itu, berguna untuk identifikasi molekuler

Penelitian ini adalah yang pertama untuk melaporkan sequencing COI lalat yang dikumpulkan dari mayat selama kejadian kematian dalam penyelidikan di Malaysia.

Urutan data 328 pasangan basa gen COI memiliki potensi untuk mengidentifikasi spesies lalat pukulan dan menempatkan mereka ke dalam kelompok masing-masing. Spesies Calliphoridae antara pengunjung awal merajalela mayat dengan larva mereka (Benecke, 2005).

Meskipun urutan COI dipilih adalah agak pendek, itu cukup spesifik untuk membedakan sebagian besar dikumpulkan pukulan spesimen terbang. Analisis urutan COI singkat telah digunakan untuk membedakan antara spesies lalat forensik penting di Australia Barat (Harley et al., 2003).

Tetangga-bergabung metode adalah metode yang cocok untuk menganalisis urutan COI dan menyelidiki apakah kedua pro-vides resolusi yang cukup untuk mengidentifikasi pukulan lalat dari genus Chrysomya (Nelson et al., 2007). Analisis filogenetik telah terbukti sangat efektif untuk menghindari hasil positif palsu (Rose dkk., 2008).

Data dari analisis molekuler yang sesuai dengan klasifikasi morfologi tradisional dalam banyak kasus yang menunjukkan kegunaannya.

Mitokondria genom telah secara luas digunakan untuk identifikasi spesies-level dan COI ditemukan deskriptif untuk identifikasi Chrysomyinae (Diptera: Calliphoridae) (Wells dan Wil-Liams 2007).

Wilayah ini COI 'barcode' itu ditemukan untuk menjadi yang paling dapat diandalkan untuk membedakan antara Australia Chrys-Omya (Diptera: Calliphoridae), setelah pengujian berbagai daerah gen (Nelson et al, 2007.).

Terlepas dari kenyataan bahwa sebagian besar spesimen lalat bisa diidentifikasi secara molekuler, ada ketidakcocokan identifikasi spesies dengan taksonomi konvensional dan molekuler spe-kalangan bisnis dalam 4 kasus.

Perbedaan ditemukan di Morfologi-kal dan identifikasi molekuler semua terjadi dalam spesies Chrysomya, yang merupakan indikasi dari kekuatan resolusi rendah dari urutan COI singkat untuk mendiagnosa Chrysomya Malaysia. Ketidaksesuaian tersebut tidak dapat dikaitkan dengan kesalahan identifikasi karakteristik taksonomi morfologi belatung lalat, karena ini adalah matang ketiga instar terbang belatung dengan karakteristik taksonomi yang berbeda.

Yang mungkin sifat Misi-dentification selanjutnya ditambahkan oleh adanya spesies saudara dalam lalat. Dalam kasus tersebut, taksonomi konvensional harus didahulukan atas identifikasi molekuler. Mis-pencocokan DNA tidak dapat dianggap sebagai berarti bahwa sampel berasal dari 2 spesies yang berbeda, melainkan mungkin hasil dari mutasi antar-spesies DNA (Wells et al., 2001). Selain itu, di Malaysia, di mana sekitar 9 spesies Chrysomya diketahui, kegunaan dari COI se-quence pendek dalam mengidentifikasi mereka perlu diselidiki lebih lanjut dan dikonfirmasi. Selain urutan COI, COII urutan gen subunit mungkin akan dibutuhkan untuk menjamin peningkatan resolusi spesies Chrysomya.

Berdasarkan hasil penelitian ini, molekul analisisis dapat dipertimbangkan untuk digunakan sebagai suplemen untuk identifikasi akurat pukulan spesimen terbang.

Ketersediaan seperti database DNA akan memfasilitasi kasus forensik dengan memungkinkan tahap dewasa untuk diidentifikasi (Tan et al., 2009).

Hal ini dapat membantu untuk meningkatkan kualitas identifikasi ketika spesimen rusak atau larva diawetkan harus dianalisis. Hal ini terbukti dari penelitian ini bahwa identifikasi molekul lalat forensik penting mungkin berguna dalam melengkapi identifikasi taksonomi konvensional. Namun, mis-matching hasil masih terjadi dan ini perlu penelitian mendalam lebih lanjut, mengingat keragaman spesies dan habitat tumpang tindih lalat seperti di Malaysia