1. UJI PRESIPITASImenghasilkan suatu komplek yang terlihat(tidak larut)Proses presipitasi pertama kali ditemukan oleh Kraus tahun 1897 saat kultur bakteri enterik membentuk presipitat bila dicampur dengan antibodi spesifik.Media : cair(zona ekuivalen) atau semisolid /gel(prozone effect)Pembentukkan presipitat terjadi apabila konsentrasi Ag dan Ab seimbang (zona ekivalen = ZE)ZE sempit Ag bersifat mudah larutZE lebar Ag bersifat tdk mudah larut, BM besar, & multikomponen AgKonsentrasi Ag berlebih Komplek Ag-Ab yg terbentuk larut kembali disebut postzone effectKonsentrasi Ab berlebih Komplek Ag-Ab yg terbentuk tetap larut disebut prozone effectFaktor yg mempengaruhi :Aviditas Ab stabilitas komplek Ag-AbSuhu (optimal 0-37oC)pH (netral = 6-7,5), pH < 6 ; >7,5 mudah disosiasiMolaritas (molaritas < 0,15 M) ; >0,15 M men-cegah presipitasiTerdapat beberapa cara pengujian pada metode presipitasi, yakni:A.Uji tabungDengan mencampur pada tabung, masukkan dilusi antigen atau antibodi dengan jumlah tertentu. Dilusi dilakukan dari konsentrasi tinggi (tabung pertama) sampai konsentrasi terendah (tabung terakhir). Presipitat timbul pada tabung yang mengandung Ag dan Ab secara proporsional.Contoh:uji CRPB.Presipitasi CincinAntigen dilapiskan pada serum (antibodi), terjadi difusi setelah mencapai ikatan proporsional dengan antibodi akan menghasilkan presipitasi berbentuk cincin.C.Difusi GelPada pengujian ini memungkinkan antigen dan antubodi berdifusi perlahan dari arah tertentu melalui gel. Pada cara ini homogenitas dan derajat kemurnian dari berbagai antigen dapat diuji. Pita presipitasi terbentuk pada setiap antigen dapat saling bertemu, atau bersilangan menunjukkan:-bersambungan, antigen identik secara imunologik (terhadap serum uji)-bercabang, antigen berhubungan sebagian-bersilangan, menunjukkan antigen tidak berhubunganMetode difusi tunggalDi sini anti serum dalam agar semi solid, zona buffer dari agar dan antigen terpisah secara vertikal dalam tabung. Garis presipitasi terbentuk dalam zona buffer.Imunodifusi gandaAgar dituang pada plat. Dibuat sumur yang terletak ditengah dan sumur-sumur lain disekitarnya.kemudian ke dalam sumur-sumur dimasukkan antigen dan ke dalam sumur yang terletak ditengah dimasukkan antibodi.Pita presipitasi terbentuk dalam gel pada posisi Ag dan Ab mencapai proporsi optimal setelah berdifusi. Dapat dimodifikasi dengan uji mikrodilusi menggunakan obyek gelasImmunoelektroforesisDigunakan untuk mendeteksi Ag dan emisahkan fraksi protein(Ab) dalam serum. Komponen serum dipisahkan dengan elektroforesis dalam agar gel .Adapun tahapnya:Dibuat sumur sejajar dengan garis migrasi Ab,lalu ke dalam sumur yang berisi Ab, dimasukkan antiserum,kemudian dibiarkan berdifusi dan membentuk presipitas berbentuk busur,sehingga masing-masing fraksi dapat diidentifikasi secara terpisah .Elektroforesis "roket"Metodepengukuran Ag secara kuantitatif,Tahapnya: dilakukan elektroforesis antigen ke dalam gel yang telah mengandung antibodi. Terjadi reaksi Ag-Ab yang kemudian akan mengendap pada titik optimum,sehingga apabila reaksi selesai ,presipitas tadi tampak sebagai kerucut(roket).Panjang masing-masing roket menunjukkan konsentrasi antigen.Immunodifusiradial tunggalJames Odin adalah orang pertama menggunakan gel untuk reaksi presipitasi, dan tehknik pertama yang diperkenalkannya adalahsingle diffusionAntiserum monospesifik ditambahkan ke dalam gel, kemudian dituang pada slide petridisk atau lempeng plastik. Dibuat lubang gel, larutan antigen dimasukkan pada lubang. Terjadi difusi sehingga terbentuk zona sirkuler yang menunjukkan jarak proporsional dengan jumlah antigen yang ditambahkan pada setiap lubang. Kuantitasi antigen yang diperiksa diketahui dari perbandingan cincin presipitasi dibandingkan dengan cincin presipitasi kontrol.2.UJI AGLUTINASITeknik ini merupakan metoda klasik dalam penetapan antibody atau antigenAg bentuk partikeldireaksikan dengan Ab spesifik membentukAglutinasiReaksi 2 tahap :oAb dgn salah satuantigen binding site(Fab) bereaksi dgn AgoFab yg lainnya berikatan dgn Ag lain yg sudah berikatan dgn Ab gumpalan(lattice)Faktor yang mempengaruhi: Muatan listrik protein,molaritas medium,vaksositas media,dan fenomena prozoneJumlahantigen & antibodi hrs seimbangContoh pemeriksaan:oWidal,ogol darahotes kehamilanMacam-macam Aglutinasia.Aglutinasi DirekUntuk menetapkan Ab terhadap Ag yang berupa partikel atau selcontoh pemerksaan: reaksi Widal(deteksi antibodi terhadapS.tiphy),penyakit hemolitik, tes rheumatoid faktor (IgM dan IgG), tes syphilis dan tes kehamilan.Interpretasi:GumpalanPositifTidak ada gumpalanNegatifb.Aglutinasi IndirekUntuk menetapkan antibodi terhadap Ag yang larut dengan melekatkan dengan antigen ini terlebih dahulu pada suatu partikel yang di sebut carrier.Partikel yang digunakan dalam teknik ini adalah lateks, eritrosit, karbon dan lain-lainFaktor yang mempengaruh:afinitas konjugat antigen terhadap carrier, waktu inkubasi dengan serum penderita dan interaksi yang terjadi pada lingkungan mikro (pH dan konsentrasi protein).Contoh pemeriksaan: tes streptococcus grup A,Treponema pallidum,hormon tiroid,dan deteksi anti-HbsInterpretasi:Tidak ada gumpalanpositifAda GumpalanNegatifc.Hambatan aglutinasi (Aglutination Inhibition)Modifikasi teknik aglutinasi untuk mendeteksi antigen yang larutCara kerja: 1. serum atau cairan yang akan diperiksa direaksikan terlebih dahulu dengan antibodi spesifik.2.direaksikan dengan Ag yang dilekatkan pada suatu partikel.3. Dilihat ada tidaknya aglutinasiInterpretasi:1.Ag yang ada pada serum atau cairan yang diperiksa, mengikat Ab spesifik sehingga Ab tidak mampu lagi bereaksi dengan Ag pada permukaan partikelUji positif(+)/tidak terjadi aglutinasi2.Apabila dalam serum atau cairan yang diperiksa tidak tedapat Ag, maka antibodi yang bebas dapat bereaksi dengan Ag melekat pada permukaan partikelUji negatif(-)/terjadi aglutinasiContoh Pemeriksaan: uji kehamilan,penetapan FDP,mendeteks berbagaivirusseperti rubella, influenza ,parainfluenza, dan mumpsd.Aglutinasi Pasif TerbalikUntuk menyatakan Ag yang larut dalam serum atau partikel lain.Ab spesifik terhadap Ag bersangkutan dilekatkan pada permukaan carrier,baik eritrosit maupun partikel lain.Reaksi Aglutinasie. fiksasi komplemenReaksi fiksasi komplemen dapat menentukan kadar antibodi yang rendah yangtidak dapat dideteksi dengan cara uji presipitasi ataupun aglutinasi.Melekat pada permukaan sel pathogen dan berperan dalam penghancuran dengan aktifitas lisis sistem komplemenTahap :1. Pengikatan sejumlah komplemen oleh kompleks Ag Ab2. Penghancuran Eritrosit yg telah dilapisi hemolisin(sebagai indicator) oleh komplemen yang tersisaInterpretasiosel darah merah ditambahkan dengan anti-red-cell-antibody, sel darah merah akan lisis ketika ditambahkan komplementes negative(-)oSerum mengandung antibodi maka complemen akan menfiksasi ikatan antigen dan antibodi sehingga ketika ditambahkan anti-red-cell antibodi tidak menghasilkan hemolisisTes positif(+)Contoh pemeriksaan :-Sifilis-Jamur (Blastomyces, Coccicioides, & Histoplasma)-Virus Herpes-Virus Rubella-Tripanosoma-SchistisomaReaksi pada teknik fiksasi komplemen3. UJI MUNOFLOURESCENTMerupakan kombinasi antara zat warna fluoresein dengan antibodi sehingga menimbulkan warna pendaran ketika dilihat pada mikroskop dengan sinar ultra violetMereaksikan antibody dan antigen spesifik dan anti-antibodi yang dilabel dengan Fluoresence Isothiocyanat (FITC) sehingga terpancar sinar warna hijau atau label denganRodhaminmenghasilkan warna merahFluorescent Antibody Technique (FAT) untuk penggunaan didalam mikrobiologi telah diperlihatkan pertama kali oleh Coons, at all pada tahun 1942 dan mulai diperkenalkan sejak tahun 1962 dalam bidang pemeriksaan parasitologi dengan memakai tekhnikindirect fluorescent antibody testJenis sampel:serum, cairan ludah, cairan otak,cairan mata ,urine,mukosa usus, mukosa mulut, dan dalam jaringan. Jenis pemeriksaan : 1. Echerchia antibody,2. Fluorescent Treponemal antibody (FTA)3. Legionnella antibody4. Mumps IgM antibody5. Q Fever antibody6. Rocky Mountain Spotted Fever antibody7. Toxoplasma IgG antibody8. Typhus antibodyJenis-jenis Imunoflourecent:1.Direct immunoflourescent:Untuk pemeriksaan antigenAb dilabel denganmarker fluorescent Ab secara langsung diberikan pada jaringan yg diinginkanCara Pemeriksaan.1. Sel padadeck cover glassyang diinfeksi dengan virus difiksasi dengan aceton-20oC selama 15 menit.2. Cuci dengan PBS dan keringkan pada temperature ruangan sampai kering.3. Masukandeck cover glasspada PBS yang mengandung 1%FCS dan biarkan 15 menit.4. Siapkan serum sampel dan encerkan dengan PBS sesuai keperluan.5. Teteskan 20l serum sampel di atas glass obyek.6. Taruhdeck cover glassdi atas sampel dengan bagian sel di bawah dan letakkan dalam kotak dan kertas yang telah dibasahi dengan air.7. Inkubasi pada incubator denagan temperatur 37oC selama 45 menit.8. Cuci dengan PBS 1%FCS selama 15 Menit.9. Siapkan Konjugat fragmen Imunoglobulin dengan pengenceran 1:100l.10. Teteskan Konjugat 20l di atas glas obyek dan letakkandeck coverglassdi atasnya.11. Inkubasi pada incubator dengan temperatur 37oC selama 15 menit12. Cuci dengan PBS 1%FCS selama 15 menit dan selanjutnya angkatdeck cover glassdan sentuhkandeck cpver glasspada kertas tissue agar airnya berkurang, sehingga kering tapi basa.13. Teteskan Glycerin 50% 20l di atas glass obyek dan selanjutnyadeck cover glassdi taruh diatasnya dan langsung dilihat hasilnya dengan mikroskop fluorescent pada pembesaran 40x. catatan preparat ini dapat disimpan pada 4oC sampai 2-3 minggu.2.In-direct immunoflourescentUntuk mendeteksi antibody terhadap jaringan atau komponen sel tertentuMenggunakan Ab yg tdk berlabel thd Ag yg diuji dengan Ab sekunder yang berlabel (yang berikatan spesifik dg Ab pertama). Semakin banyak ikatan Ab sekundersinyal floresen semakin meningkatCara pemeriksaan:1. Antigen mikroba diletakkan dalam kaca objek dan diberi bahan fiksatif2. Serum pasien yang telah diencerkan diinkubasi bersama antigen pada kacaobjek, kemudian dicuci3.Ditambahkan Antibodi berlabel flouresen (konjugat)4. Kaca objek dicuci hemudian dikeringkan, kemudian dibaca dibawah mikroskop flouresenPreparat diamati adanya area terang berfloresensi warna hijau dan dibandingkan dengan control positif dan negatif. Adanya floresensi hijau menandakan adanya antibodi terhadap antigen.RADIOIMMUNOASSAY Radioimmunoassay pertama kali dikembangkan oleh Rosalyn Yalow dan Solomon A. Berson dari amerika serikat, pertama kali mereka bekerja untuk mempelajari tentang hormon khususnya insulin yaitu hormon yang mengatur kadar gula dalam darah . Teknik RIA merupakan cara diagnostik yang mampu mengukur konsentrasi antigen maupun antibodi yang berkadar rendah, sehingga memungkinkan untuk mendeteksi adanya kelainan tubuh secara dini. Prinsip dasarnya dalah reaksi antara antigen dan antibodi di dalam reaksinya adalah sifat kekhususannya, sebuah antigent yang bereaksi dengan antibody yang spesifik untuknya dan tidak mengadakan reaksi silang (cross reaction) dengan tipe antigent yang sama. Bahan pereaksi dalam radioimmunoassay ialah antigen radioaktif dan antibody spesifik. Terdapat dua cara pemeriksaan RIA:A.Reaksi antigen antibodi dalam larutan (liquid phase )/Kompetitif1.Antibodi diimobilisasi (ditempelkan) pada suatu fase padat misalnya dinding tabung plastic2.Sampel pasien Ag ditambahkan bersama dengan sejumlah tertentu Ag berlabel radioaktif yang akan berinteraksi dengan antibodi yang timbul.3.Ag-Ag berlabel-Ab bereaksi kompetitf dan membentuk kompleks Ag-Ab-Ag berlabel4.Pemisahan kompleks Ag-Ab-Ag berlabel dengan mengendapkannya secara kimiawi menggunakan ammonium sulfat,asam trichlorasetat/polietilen glikol,maupun mereaksikannya dengan antibody kedua atau filtrasi dengan gelB.Reaksi pada zat padat atau partikel (solid phase)/Non Kompetitif/Sandwich1.Melekatkan Ag atau Ab pada suatu partikel2.Mereaksikannya dengan specimen(Ag) yang akan di uji.3.Ditambahkan Ab berlabel4.Terbentuk kompleks Ab-Ag-Ab berlabel,lalu dipisahkan dan diukur radioaktivitasnya5.Banyaknya Ab berlabel yang terikat pada kompleks merupakan kadar Ag dalam spesimen Keuntungan : Sensitivitas dan presisi yang tinggi ,Mudah dikerjakan, Pekerjaannya lebih cepat dan tidak memerlukan sampel yang besar. Kerugian : Reagen kurang stabil, Memerlukan proteksi terhadap bahan radioaktif (radioactive hazardous) Contoh pemriksaan : HBsAg,anti HBs,macam-macam hormone,macam-macam pertanda ganas,dan IgE spesifikELISA ELISAdiperkenalkan pada tahun 1971 oleh Peter Perlmann dan Eva Engvall untuk menganalisis adanya interaksiantigendenganantibodidi dalam suatu sampel dengan menggunakanenzimsebagai pelapor. Untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu sampeldengan menggunakan enzimSyarat Enzim:tidak boleh mengurangi sifat imunologi Ag/Ab,didapat dalam keadaan murni,bersifat stabil.Contoh Enzyme : horseradish peroxidase, phosphatase,,glukosa oksidase,dan beta galaktosidasePrinsip ELISA: mereaksikan (Ag) dalam sampel dengan Ab yang dilabelkan dengan enzim.Kompleks Ag-Ab enzim yang terbentuk kemudian dipisahkan ,lalu diinkubasi dengan substrak kromeogenik yang berwarna ketika dihidrolisis dengan enzim.Intensitas warna yang terbentuk diukur dengan alat Colorimetri danmerupakan parameter Ag yang diuji Contoh pemeriksaan : utk deteksi fungsi hati, fungsi trombositopenia, gangguan fungsi hormonal Jenis-jenis ELISA:A. Metode KompetitifUntuk menguji antigenTahapnya:1.Ab spesifik dilekatkan pada partikel(benda padat) seperti bagian dalam dinding tabung atau sumur2.Sampel(serum) bersama Ag berlabel enzim direaksikan dengan Ab tersebut.Ag dalam specimen apabila ada akan bersaing dengan Ag enzim untuk mengikat Ab3.Setelah reakan yang tidak bereaksi dibuang dengan pencucian,dimasukkan substract,lalu diinkubasi.Hidrolisis substrat oleh enzim yang terikat pada kompleks akan menyebabkan perubahan warna,dan intensitas perubahan warna merupakan kadar Ag enzim yang terikat dan merupakan parameter Ag dalam sampel.A. Metode Non KompetitifUntuk menguji AbTahapnya:1.Ag dilekatkan pada permukaan benda padat2.Spesimen yang mengandung Ab direaksikan dengan Ag tersebut,setelah itu kelebihan specimen dicuci3.Antiimunoglobulin yang dilabel enzim dimasukkan kemudian diinkubasi dan kelebihannya dicuci4.Setelah itu dimasukkan substract kromogenik yang selanjutnya dihidrolisis oleh enzim yang terdapat pada kompleks Ag-Ab-Ag enzim.Banyaknya substrat yang dihidrolisis sesuai dengan banyaknya enzim pada kompleks,sehingga hal itu dipakai sebagai parameter kadar Ab dalam specimen.C. MetodeSandwich1. Disiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi penangkap2. Semua non spesifikbinding sitespada permukaan diblokir3. Sampel berisi antigen dimasukkan dalamplate4. Platedicuci untuk membuang kelebihan antigen yang tidak terikat5. Antibodi primer ditambahkan, supaya berikatan secara spesifik dengan antigen6. Antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim dimasukkan, yang akan berikatan dengan antibodi primer7. Platedicuci, sehingga konjugat antibodi-enzim yang tidak terikat dapat dibuang8. Ditambahkan reagen yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal berwarna/ berfluoresensi/ elektrokimia9. Diukur absorbansinya untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dari antigenperbedaannya yaitu aglutinasi penggumpalan dalam suatu cairan akibat pemberian suatu bahan ke dalamnya sedangkan koagulasi adalah suatu proses yang rumit di dalam sistem koloid darah yang memicu partikel koloidal terdispersi untuk memulai proses pembekuan, hal itu biasanya terjadi setelah luka pada pembuluh darah dengan rusaknya endotheliumImunoserologi Selain berguna untukterapi kanker, antibodi monoklonal juga digunakan untuk deteksi berbagai zat sangat terbantu dengan penggunaan antibodi sebagai reagensia. Berdasarkan pemahaman bahwa reaksi antigen antibodi berlangsung secara spesifik, maka hal ini dapat dijadikan alat untuk menunjang diagnosis penyakit infeksi. Berbagai metode imunoserologi telah dikembangkan, sehingga antibodi yang telah diketahui identitasnya dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan antigen.Beberapa metode imunoserologi yang sering digunakan adalah :1. Reaksi presipitasiReaksi yang dilakukan untuk mengetahui kadar antibodi dalam serum. Presipitasi terjadi karena reaksi antara antigen yang larut dengan antibodi. Membentuk komplek berupa anyaman.2. Reaksi aglutinasiBerbeda dengan reaksi presipitasi, reaksi aglutinasi ini dilakukan untuk antigen yang tidak larut, berbentuk partikel atau antigen yang larut tapi terikat dengan partikel atau sel. Antigen tersebut bereaksi dengan antibodi membentuk suatu agregat yang dpat dilihat yang disebut aglutinasi.3. Reaksi netralisasiReaksi antara antigen dan antibodi untuk mencegah adanya efek yang berbahaya antara lain adanya eksotoksin bakteri atau virus. Senyawa yang dapat menetralkan toksin disebut dengan antitoksin, merupakan antibodi spesifik yang diproduksi oleh sel hospes.Reaksi antara antitoksin yang dapat menetralkan toksin bakteri disebut dengan reaksi netralisasi.4. Reaksi fiksasi komplemenReaksi fiksasi komplemen dapat menentukan kadar antibodi yang rendah yang tidak dapat dideteksi dengan cara uji presipitasi ataupun aglutinasi.5. Reaksi imunofluoresensiTeknik ini merupakan kombinasi antara zat warna fluoresein dengan antibodi sehingga menimbulkan warna pendaran ketika dilihat pada mikroskop dengan sinar ultra violet. Uji ini merupakan cara yang cepat, sensitif dan sangat spesifik.6. Radioimmuno assay (RIA)Teknik RIA merupakan cara diagnostik yang mampu mengukur konsentrasi antigen maupun antibodi yang berkadar rendah, sehingga memungkinkan untuk mendeteksi adanya kelainan tubuh secara dini.Terdapat dua cara untuk melakukan pemeriksaan dengan teknik RIA ini, pertama dengan penentuan berdasarkan reaksi antigen antibodi dalam larutan (liquid phase radio immuno assay) dan yang kedua adalah berdasarkan reaksi pada zat padat atau partikel (solid phase radio immuno assay).7. Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)ELISA merupakan teknik yang paling luas digunakan dari kelompok enzyme immunoassay (EIA). Terdapat dua cara ELISA yaitu yang ecara langsung mendeteksi antigen dan secara tidak langsung untuk mendeteksi antibodi.Teknik ELISA cukup sederhana sehingga interpretasi terhadap hasil pemeriksaan sangat jelas baik untuk menentukan hasil positif maupun negatif.