23

III. METODOLOGI PENELITIAN

1.1. Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilaksanakan pada bulan Februari 2019 sampai Juli 2019.

Penelitian dilakukan di Labolatorium Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas

Pertanian Peternakan, Universitas Muhammadiyah Malang.

1.2. Alat dan Bahan

1.2.1. Alat

Alat-alat yang digunakan adalah sendok, pisau, timbangan digital (camry

model: EK5055), pengaduk, panci, kompor, botol, kain saring, dan saringan. Alat-

alat yang digunakan untuk analisa adalah gelas beaker, erlenmeyer, termometer,

corong kaca, gelas ukur, pH meter merk Schott Gerate, viscometer merk Brook

Field, timbangan analitik merk Mettler AJ150, Inkubator merk QUALTEX model

IA245, penyaring, dan aluminium foil.

1.2.2. Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah nanas varietas Cayenne

(Ananas comosus L) umur panen 5 bulan yang diambil dari pasar besar Malang,

starter kefir (1%, 3%, 5%, dan 7%) yang dibeli dari Balai Peternakan Batu, gula

pasir dan gula merah yang dibeli dari toko supermarket Malang, skim yang dibeli

dari toko kue di Malang. Bahan kimia yang digunakan adalah aquades, NaOH 0,1

N, indikator PP (Fenolftalein), natrium thiosulfat, KI, H2SO4, K2CrO4, Luff

Schoorl, MRS agar dan PDA (Potato Dextrose Agar 39g/lt), spiritus yang dibeli

dari toko bahan kimia di Malang.

24

1.3. Metode Penelitian

Penelitian menggunakan metode eksperimen dengan rancangan acak

kelompok (RAK) faktorial yang terdiri dari dua faktor, yaitu jenis gula (B), dan

konsentrasi starter (S) :

Faktor I: Konsentrasi Starter Kefir, dengan 2 level:

B1= Gula pasir 5%

B2= Gula merah 5%

Faktor II: Konsentrasi starter (S), dengan 4 level:

S1= Konsentrasi starter kefir 1% (b/v)

S2= Konsentrasi starter kefir 3% (b/v)

S3= Konsentrasi starter kefir 5% (b/v)

S4= Konsentrasi starter kefir 7% (b/v)

Sehingga diperoleh 8 kombinasi perlakuan dan 1 kontrol (kefir susu).

Masing-masing perlakuan diulang sebanyak 3 kali, sehingga terdapat 24

perlakuan. Matriks delapan (8) kombinasi perlakuan dapat diihat pada tabel 6

sebagai berikut :

Tabel 6. Matriks Kombinasi Perlakuan Konsentrasi Starter dan Jenis

Sukrosa

Jenis Sukrosa Konsentrasi Starter Kefir

S1 S2 S3 S4

B1 B1S1 B1S2 B1S3 B1S4

B2 B2S1 B2S2 B2S3 B2S4

Keterangan :

B1S1 : Gula pasir + konsentrasi starter kefir 1% (b/v)

B1S2 : Gula pasir + konsentrasi starter kefir 3% (b/v)

B1S3 : Gula pasir + konsentrasi starter kefir 5% (b/v)

25

B1S4 : Gula pasir + konsentrasi starter kefir 7% (b/v)

B2S1 : Gula merah + konsentrasi starter kefir 1% (b/v)

B2S2 : Gula merah + konsentrasi starter kefir 3% (b/v)

B2S3 : Gula merah + konsentrasi starter kefir 5% (b/v)

B2S4 : Gula merah + konsentrasi starter kefir 7% (b/v)

1.4. Prosedur Pelaksanaan Penelitian

1.4.1. Pembuatan Sari Nanas

Minuman kefir nanas dibuat dari bahan baku nanas varietas Cayenne yang

dengan umur panen 5 bulan. Adapun tahapan pembuatan kefir nanas, yaitu :

a. Penyortiran

Buah yang dipilih dilakukan penyortiran terlebih dahulu untuk memilih

buah yang matang secara normal atau cukup dan tidak busuk.

b. Pencucian

Buah nanas yang telah disortir dikupas dan dicuci dengan menggunakan

air bersih yang mengalir untuk menghilangkan kotoran dan getah yang terdapat

pada buah.

c. Penghalusan

Buah kemudian dihaluskan menggunakan blender dengan penambahan air

perbandingan 1:3 (500 g nanas : 1,5 liter air). Kemudian didiamkan untuk

mengendapkan padatan-padatan yang masih ada pada filtrat.

d. Penyaringan

Filtrat yang dihasilkan disaring menggunakan saringan untuk memisahkan

ampas. Kemudian bagian yang jernih diambil.

26

Gambar 3. Diagram Alir Pembuatan Sari Nanas ( Riyan, 2014 ) yang dimodifikasi

1.4.2. Peremajaan Starter Kefir dan Pembuatan Starter Kefir Nanas

Starter kefir diinokulasikan ke dalam susu yang telah dipasteurisasikan

dan diinkubasi pada suhu kamar (25oC) selama 24 jam (Hotri,2008). Kefir grain

yang telah diinokulasi selama 24 jam kemudian dipindahkan ke dalam media sari

nanas untuk penelitian.

1.4.3. Pembuatan Kefir Nanas

Sari buah nanas yang diperoleh, yaitu sebanyak 800mL dibagi menjadi

dua bagian. Sebanyak 400mL buah nanas ditambahkan 5% gula pasir dan susu

skim 5%, sedangkan 400mL bagian yang lain ditambahkan 5% gula merah dan

susu skim 5%. Kemudian dilakukan proses selanjutnya, seperti

Penyortiran

Pencucian dengan

air mengalir

Buah Nanas

Penambahan

Air dengan

perbandingan

1:3 (nanas: air)

Ampas

Penghalusan

menggunakan blender

Sari nanas

Penyaringan

dengan saringan

27

a. Pasteurisasi

Sari buah nanas yang telah ditambahkan jenis gula pasir 5% dan susu skim

5% serta gula merah 5% dan susu skim 5% dipasteurisasi pada suhu 80oC selama

15 menit.

b. Pendinginan

Sari buah nanas yang telah diberi dipasteurisasi didinginkan hingga suhu

menurun 25 oC atau suhu kamar. Hal tersebut bertujuan untuk menghambat bakteri

yang masih hidup agar tidak tumbuh kembali. Kemudian sari nanas dituang dalam

botol 100mL

c. Inokulasi

Setelah sari nanas dalam keadaan dingin, ditambahkan inokulum starter

kefir pada masing-masing botol steril sebanyak 1%, 3%, 5%, dan 7% (b/v) dari

jumlah sari buah nanas. Kemudian diaduk hungga tercampur rata dan menutupnya

rapat untuk menghasilkan water kefir nanas.

d. Inkubasi

Inkubasi dilakukan selama 24 jam pada suhu 37 oC pada inkubator.

e. Analisa

Kemudian kefir nanas dengan berbagai macam perlakuan tersebut

dilakukan analisa untuk mengetahui kualitasnya. Analisa kimia meliputi

pengujian total asam tertitrasi (TAT), derajat keasaman (pH), gula reduksi, dan

alcohol. Analisa mikrobiologi meliputi pengujian total bakteri asam laktat (BAL)

dan total yeast, sedangkan analisa hedonik dengan uji organoleptik, meliputi rasa,

aroma, kesukaan, dan mouthfeel.

28

Gambar 4. Diagram Alir Proses Pembuatan Kefir Nanas (Inka, 2017) yang

Dimodifikasi

1.4.4. Kontrol (Kefir Susu Komersil)

Kefir susu dikirim dari Jakarta Barat, Cengkareng, DKI Jakarta. Fermentasi

pada kefir susu sapi dilakukan pada fermentasi 24 jam hingga tercapai pH 4. Susu

kefir yang digunakan adalah susu kefir prima.

Pasteurisasi

(pada suhu 80oC ,15 menit)

Sari buah nanas

800 mL

Pendinginan

( T=25oC)

Water kefir

Nanas

Inokulasi

Inkubasi selama (t = 24

jam, T = 37oC)

Penambahan

Perlakuan jenis

Sukrosa gula

pasir 5%, gula

merah 5%, susu

skim 5%

Parameter Pengujian

Total asam tertitrasi

(TAT)

pH

Total BAL

Total yeast

Gula Reduksi

Warna

Alkohol

Uji Organoleptik (

kesukaan, aroma, rasa,

mouthfeel )

Inokulum starter

kefir ( 1%, 3%,

5%, 7%)

29

1.5. Parameter Pengamatan.

1.5.1. Total Asam Tertitrasi (AOAC, 1995)

Pengujian total asam dinyatakan sebagai total asam. Keasaman diukur

dengan metode titrasi yang dinyatakan sebagai persentase asam laktat. Adapun

metode yang dilakukan adalah

1. Sampel sebanyak 10 ml ditambahkan dengan 2-3 tetes indikator

fenolftalein,

2. Dititrasi dengan larutan NaOH 0,1 N sampai berwarna merah muda dan

stabil, sesuai dengan larutan standart.

3. Keasaman titrasi dihitung dengan rumus :

Keterangan :

a = ml NaOH 0,1 N x N NaOH 0,1 N

b = berat sampel(g)

N NaOH = 1

3.5.2. Penentuan pH ( Sudarmadji, 1997)

Penentuan pH dilakukan dengan menggunakan pH meter. Adapun

metodenya adalah mula-mula dilakukan standarisasi pH meter. Adapun langkah-

langkah yang dilakukan adalah

1. Dinyalakan pH meter.

2. Elektroda dan temperature prob dibilas menggunakan akuades dan

mengeringkannya;

( )

( )

30

3. Dilakukan kalibrasi dengan mencelupkan elektroda pada larutan

penyangga (pH 7) serta asam (pH 4) dan membersihkannya;

4. Elektroda dibilas kembali menggunakan akuades dan mengeringkan;

5. Elektroda dicelupkan pada sampel, dengan menekan tombol Ar (hold) dan

Enter kemudian mengunggu pembacaan pada layer stabil serta muncul

indicator autolock pada layar;

6. Dicatat nilai yang tertera pada layar digital.

3.5.3. Uji Total BAL (Nurliyani,2014)

1. Diambi1 ml sampel kemudian memasukkan ke dalam tabung reaksi.

2. 9 ml aquades steril ditambahkan kemudian menutup dan mengocoknya.

Lakukan pengenceran bertingkat sampai pengenceran ke enam (10-6

)

dengan cara mengambil 1 ml suspensi dan menaruhnya dalam tabung

reaksi ke dua kemudian menambahkannya 9 ml aquades.

3. Melakukan hal yang sama pada tabung ke tiga sampai enam.

4. Diambil 1 ml suspensi pada tabung ke enam kemudian memasukkan ke

dalam cawan petri. Setelah itu, memasukkan medium de Man Ragosa and

Sharpe Agar (MRSA) steril yang telah didinginkan sampai suhu 45 OC

sebanyak 15 ml.

5. Gerakkan cawan petri untuk penyebaran sel-sel bakteri asam laktat secara

merata dan memadat. Menginkubasi di dalam inkubator pada suhu 37OC

dengan posisi cawan terbalik selama 24 jam.

6. Kemudian koloni dihitung yang tumbuh menggunakan colony counter.

Total koloni yang terhitung harus memenuhi Standar Internasional

31

Commition of Food (ICMF), yaitu antara 30 sampai 300 koloni per cawan

petri.

3.5.4. Uji Gula Reduksi ( SNI,1992 )

Pengujian gula reduksi dilakukan dengan metode Luff Schoorl. Adapun

langkah-langkahnya adalah

1. Lima gram substrat fermentasi diambil dari botol tiap 24 jam,

kemudian ditambah 50 mL air distilasi dan dicampur merata.

2. Suspensi dicentrifuge pada 4000 rpm selama 20 menit, dan supernatan

digunakan untuk menguji kadar gula reduksi.

3. Pipet 10 mL supernatan ke labu didih kemudian tuangkan 10 mL

reagen Luff Schoorl.

4. Sampel dididihkan pada refluks selama 10 menit, kemudian

tambahkan 6 mL KI 20% and 10 mL H2SO4 dengan hati-hati melalui

dinding labu.

5. Titrasi sampel dengan Na2S2O3 0,1 N hingga berwarna kuning, lalu

tambah amilum 1% titrasi dilanjutkan sampai warna biru hilang.

6. Buat blanko titrasi menggunakan air sebagai pengganti sampel. Kadar

gula reduksi dihitung dengan rumus :

Koloni per gram = Koloni Jumlah x 1

Faktor pengenceran

Gula Reduksi (%) =

32

Keterangan

AT= angka tabel Luff Shoorls

Fp= faktor pengenceran

3.5.5. Pengujian Alkohol Spektrofotometer ( James, 1995 )

1. Penentuan Kuva standar : digunakan ethanol dengan berbagai konsentrasi

0%, 0,3%, 0,6%, 0,12%, 0,25%, 0,5%, 1%. Masing-masing larutan standar

diukur absorbansinya pada panjang gelombang 600 nm;

2. Sebanyak 0,5 sampel cair, diencerkan dengan akuades 15 ml;

3. K2CrO4 sebanyak 12,5 ml ditambahkan sampai terjadi perubahan warna

menjadi jingga saat ditambahkan kalium dikromat;

4. Campuran sampel dipanaskan. Hal ini bertujuan agar reaksi berlangsung

cepat. Setelah pemanasan, sampel berwarna hijau kehitaman;

5. Campuran yang telah diencerkan didinginkan dan dihomogenkan dengan

vortex, kemudian ukur absorbansi pada panjang gelombang 600 nm.

6. Dihitung kadar alkohol dalam sampel.

3.5.6. Pengujian Total Yeast ( Fardiaz, 1993 )

1. Larutan water kefir nanas 1 ml diambil dan dimasukkan kedalam tabung

reaksi dan tambahkan akuades 9 ml lalu vortex, kemudian encerkan

sampai pangkat 4 pengenceran

2. Pengambilan Isolat khamir yang dihasilkan 1 ml, kemudian ditanam pada

medium PDA (potato dextrose agar 39g/lt) steril;

3. Diinkubasi dengan temperature suhu 25oC, 30

oC dan 37

oC selama 72 jam;

4. Koloni yang tumbuh dihitung jumlahnya sebagai tanda adanya

pertumbuhan yeast.

33

3.5.7.Pengujian Warna Metode L, a, b Hunter ( Yuwono,1998 )

Pengujian warna menggunakan colour reader. Adapun langkah-

langkahnya adalah

1. Disiapkan sampel dalam plastik PP (transparan).

2. Colour reader dinyalakan. Kemudian menentukan target L, a, b.

Dimana; L, adalah kecerahan ; axis a, nilai positif (+) berarti merah,

nilai (-) berarti hijau; axis b, nilai positif (+) berarti kuning, dan nilai

negatif (-) berarti biru.

3. Tombol target ditarget dan kemudian mencatat nilai warna pada

tertera.

3.5.8. Uji Organoleptik Hedonic Scale ( Rahayu, 2001 )

Uji organoleptik yang dilakukan meliputi kesukaan, aroma, rasa, dan

mouthfeel. Pengujian menggunakan uji skala hedonic yang terdiri dari 5 nilai

dapat dilihat pada Tabel 7.

Tabel 7. Skor Organoleptik

Skor Skor Kesukaan Skor Aroma Skor Rasa Skor Mouthfeel

1 Sangat tidak suka Sangat tidak

menyengat

Sangat tidak

asam

Sangat sparkling

2 Tidak suka Tidak menyengat Tidak asam Tidak sparkling

3 Cukup suka Cukup menyengat Cukup asam Cukup

Sparkling

4 Suka Menyengat Asam Sparkling

5 Sangat suka Sangat

menyengat

Sangat asam Sangat sparkling

34

3.6. Analisa Data

Data pengujian total asam, pH, total BAL, total yeast, gula reduksi,

kadar alcohol, dan warna serta organoleptik tiap parameter pada penelitian

ini dianalisis menggunakan analisa data ANOVA (Analysis of Variant) untuk

mengetahui interaksi dan pengaruh dari setiap perlakuan. Jika terdapat

Interaksi, maka akan diuji lanjut menggunakan uji DMRT 5% (Duncan’s

Multiple Range Test) dan untuk memilih kombinasi perlakuan terbaik pada

penelitian ini menggunakan nilai efektivitas uji De Garmo. Penentuan perbedaan

signifikan secara statistik diuji dengan uji t-test (uji T).