23
III. METODOLOGI PENELITIAN
1.1. Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan pada bulan Februari 2019 sampai Juli 2019.
Penelitian dilakukan di Labolatorium Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas
Pertanian Peternakan, Universitas Muhammadiyah Malang.
1.2. Alat dan Bahan
1.2.1. Alat
Alat-alat yang digunakan adalah sendok, pisau, timbangan digital (camry
model: EK5055), pengaduk, panci, kompor, botol, kain saring, dan saringan. Alat-
alat yang digunakan untuk analisa adalah gelas beaker, erlenmeyer, termometer,
corong kaca, gelas ukur, pH meter merk Schott Gerate, viscometer merk Brook
Field, timbangan analitik merk Mettler AJ150, Inkubator merk QUALTEX model
IA245, penyaring, dan aluminium foil.
1.2.2. Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah nanas varietas Cayenne
(Ananas comosus L) umur panen 5 bulan yang diambil dari pasar besar Malang,
starter kefir (1%, 3%, 5%, dan 7%) yang dibeli dari Balai Peternakan Batu, gula
pasir dan gula merah yang dibeli dari toko supermarket Malang, skim yang dibeli
dari toko kue di Malang. Bahan kimia yang digunakan adalah aquades, NaOH 0,1
N, indikator PP (Fenolftalein), natrium thiosulfat, KI, H2SO4, K2CrO4, Luff
Schoorl, MRS agar dan PDA (Potato Dextrose Agar 39g/lt), spiritus yang dibeli
dari toko bahan kimia di Malang.
24
1.3. Metode Penelitian
Penelitian menggunakan metode eksperimen dengan rancangan acak
kelompok (RAK) faktorial yang terdiri dari dua faktor, yaitu jenis gula (B), dan
konsentrasi starter (S) :
Faktor I: Konsentrasi Starter Kefir, dengan 2 level:
B1= Gula pasir 5%
B2= Gula merah 5%
Faktor II: Konsentrasi starter (S), dengan 4 level:
S1= Konsentrasi starter kefir 1% (b/v)
S2= Konsentrasi starter kefir 3% (b/v)
S3= Konsentrasi starter kefir 5% (b/v)
S4= Konsentrasi starter kefir 7% (b/v)
Sehingga diperoleh 8 kombinasi perlakuan dan 1 kontrol (kefir susu).
Masing-masing perlakuan diulang sebanyak 3 kali, sehingga terdapat 24
perlakuan. Matriks delapan (8) kombinasi perlakuan dapat diihat pada tabel 6
sebagai berikut :
Tabel 6. Matriks Kombinasi Perlakuan Konsentrasi Starter dan Jenis
Sukrosa
Jenis Sukrosa Konsentrasi Starter Kefir
S1 S2 S3 S4
B1 B1S1 B1S2 B1S3 B1S4
B2 B2S1 B2S2 B2S3 B2S4
Keterangan :
B1S1 : Gula pasir + konsentrasi starter kefir 1% (b/v)
B1S2 : Gula pasir + konsentrasi starter kefir 3% (b/v)
B1S3 : Gula pasir + konsentrasi starter kefir 5% (b/v)
25
B1S4 : Gula pasir + konsentrasi starter kefir 7% (b/v)
B2S1 : Gula merah + konsentrasi starter kefir 1% (b/v)
B2S2 : Gula merah + konsentrasi starter kefir 3% (b/v)
B2S3 : Gula merah + konsentrasi starter kefir 5% (b/v)
B2S4 : Gula merah + konsentrasi starter kefir 7% (b/v)
1.4. Prosedur Pelaksanaan Penelitian
1.4.1. Pembuatan Sari Nanas
Minuman kefir nanas dibuat dari bahan baku nanas varietas Cayenne yang
dengan umur panen 5 bulan. Adapun tahapan pembuatan kefir nanas, yaitu :
a. Penyortiran
Buah yang dipilih dilakukan penyortiran terlebih dahulu untuk memilih
buah yang matang secara normal atau cukup dan tidak busuk.
b. Pencucian
Buah nanas yang telah disortir dikupas dan dicuci dengan menggunakan
air bersih yang mengalir untuk menghilangkan kotoran dan getah yang terdapat
pada buah.
c. Penghalusan
Buah kemudian dihaluskan menggunakan blender dengan penambahan air
perbandingan 1:3 (500 g nanas : 1,5 liter air). Kemudian didiamkan untuk
mengendapkan padatan-padatan yang masih ada pada filtrat.
d. Penyaringan
Filtrat yang dihasilkan disaring menggunakan saringan untuk memisahkan
ampas. Kemudian bagian yang jernih diambil.
26
Gambar 3. Diagram Alir Pembuatan Sari Nanas ( Riyan, 2014 ) yang dimodifikasi
1.4.2. Peremajaan Starter Kefir dan Pembuatan Starter Kefir Nanas
Starter kefir diinokulasikan ke dalam susu yang telah dipasteurisasikan
dan diinkubasi pada suhu kamar (25oC) selama 24 jam (Hotri,2008). Kefir grain
yang telah diinokulasi selama 24 jam kemudian dipindahkan ke dalam media sari
nanas untuk penelitian.
1.4.3. Pembuatan Kefir Nanas
Sari buah nanas yang diperoleh, yaitu sebanyak 800mL dibagi menjadi
dua bagian. Sebanyak 400mL buah nanas ditambahkan 5% gula pasir dan susu
skim 5%, sedangkan 400mL bagian yang lain ditambahkan 5% gula merah dan
susu skim 5%. Kemudian dilakukan proses selanjutnya, seperti
Penyortiran
Pencucian dengan
air mengalir
Buah Nanas
Penambahan
Air dengan
perbandingan
1:3 (nanas: air)
Ampas
Penghalusan
menggunakan blender
Sari nanas
Penyaringan
dengan saringan
27
a. Pasteurisasi
Sari buah nanas yang telah ditambahkan jenis gula pasir 5% dan susu skim
5% serta gula merah 5% dan susu skim 5% dipasteurisasi pada suhu 80oC selama
15 menit.
b. Pendinginan
Sari buah nanas yang telah diberi dipasteurisasi didinginkan hingga suhu
menurun 25 oC atau suhu kamar. Hal tersebut bertujuan untuk menghambat bakteri
yang masih hidup agar tidak tumbuh kembali. Kemudian sari nanas dituang dalam
botol 100mL
c. Inokulasi
Setelah sari nanas dalam keadaan dingin, ditambahkan inokulum starter
kefir pada masing-masing botol steril sebanyak 1%, 3%, 5%, dan 7% (b/v) dari
jumlah sari buah nanas. Kemudian diaduk hungga tercampur rata dan menutupnya
rapat untuk menghasilkan water kefir nanas.
d. Inkubasi
Inkubasi dilakukan selama 24 jam pada suhu 37 oC pada inkubator.
e. Analisa
Kemudian kefir nanas dengan berbagai macam perlakuan tersebut
dilakukan analisa untuk mengetahui kualitasnya. Analisa kimia meliputi
pengujian total asam tertitrasi (TAT), derajat keasaman (pH), gula reduksi, dan
alcohol. Analisa mikrobiologi meliputi pengujian total bakteri asam laktat (BAL)
dan total yeast, sedangkan analisa hedonik dengan uji organoleptik, meliputi rasa,
aroma, kesukaan, dan mouthfeel.
28
Gambar 4. Diagram Alir Proses Pembuatan Kefir Nanas (Inka, 2017) yang
Dimodifikasi
1.4.4. Kontrol (Kefir Susu Komersil)
Kefir susu dikirim dari Jakarta Barat, Cengkareng, DKI Jakarta. Fermentasi
pada kefir susu sapi dilakukan pada fermentasi 24 jam hingga tercapai pH 4. Susu
kefir yang digunakan adalah susu kefir prima.
Pasteurisasi
(pada suhu 80oC ,15 menit)
Sari buah nanas
800 mL
Pendinginan
( T=25oC)
Water kefir
Nanas
Inokulasi
Inkubasi selama (t = 24
jam, T = 37oC)
Penambahan
Perlakuan jenis
Sukrosa gula
pasir 5%, gula
merah 5%, susu
skim 5%
Parameter Pengujian
Total asam tertitrasi
(TAT)
pH
Total BAL
Total yeast
Gula Reduksi
Warna
Alkohol
Uji Organoleptik (
kesukaan, aroma, rasa,
mouthfeel )
Inokulum starter
kefir ( 1%, 3%,
5%, 7%)
29
1.5. Parameter Pengamatan.
1.5.1. Total Asam Tertitrasi (AOAC, 1995)
Pengujian total asam dinyatakan sebagai total asam. Keasaman diukur
dengan metode titrasi yang dinyatakan sebagai persentase asam laktat. Adapun
metode yang dilakukan adalah
1. Sampel sebanyak 10 ml ditambahkan dengan 2-3 tetes indikator
fenolftalein,
2. Dititrasi dengan larutan NaOH 0,1 N sampai berwarna merah muda dan
stabil, sesuai dengan larutan standart.
3. Keasaman titrasi dihitung dengan rumus :
Keterangan :
a = ml NaOH 0,1 N x N NaOH 0,1 N
b = berat sampel(g)
N NaOH = 1
3.5.2. Penentuan pH ( Sudarmadji, 1997)
Penentuan pH dilakukan dengan menggunakan pH meter. Adapun
metodenya adalah mula-mula dilakukan standarisasi pH meter. Adapun langkah-
langkah yang dilakukan adalah
1. Dinyalakan pH meter.
2. Elektroda dan temperature prob dibilas menggunakan akuades dan
mengeringkannya;
( )
( )
30
3. Dilakukan kalibrasi dengan mencelupkan elektroda pada larutan
penyangga (pH 7) serta asam (pH 4) dan membersihkannya;
4. Elektroda dibilas kembali menggunakan akuades dan mengeringkan;
5. Elektroda dicelupkan pada sampel, dengan menekan tombol Ar (hold) dan
Enter kemudian mengunggu pembacaan pada layer stabil serta muncul
indicator autolock pada layar;
6. Dicatat nilai yang tertera pada layar digital.
3.5.3. Uji Total BAL (Nurliyani,2014)
1. Diambi1 ml sampel kemudian memasukkan ke dalam tabung reaksi.
2. 9 ml aquades steril ditambahkan kemudian menutup dan mengocoknya.
Lakukan pengenceran bertingkat sampai pengenceran ke enam (10-6
)
dengan cara mengambil 1 ml suspensi dan menaruhnya dalam tabung
reaksi ke dua kemudian menambahkannya 9 ml aquades.
3. Melakukan hal yang sama pada tabung ke tiga sampai enam.
4. Diambil 1 ml suspensi pada tabung ke enam kemudian memasukkan ke
dalam cawan petri. Setelah itu, memasukkan medium de Man Ragosa and
Sharpe Agar (MRSA) steril yang telah didinginkan sampai suhu 45 OC
sebanyak 15 ml.
5. Gerakkan cawan petri untuk penyebaran sel-sel bakteri asam laktat secara
merata dan memadat. Menginkubasi di dalam inkubator pada suhu 37OC
dengan posisi cawan terbalik selama 24 jam.
6. Kemudian koloni dihitung yang tumbuh menggunakan colony counter.
Total koloni yang terhitung harus memenuhi Standar Internasional
31
Commition of Food (ICMF), yaitu antara 30 sampai 300 koloni per cawan
petri.
3.5.4. Uji Gula Reduksi ( SNI,1992 )
Pengujian gula reduksi dilakukan dengan metode Luff Schoorl. Adapun
langkah-langkahnya adalah
1. Lima gram substrat fermentasi diambil dari botol tiap 24 jam,
kemudian ditambah 50 mL air distilasi dan dicampur merata.
2. Suspensi dicentrifuge pada 4000 rpm selama 20 menit, dan supernatan
digunakan untuk menguji kadar gula reduksi.
3. Pipet 10 mL supernatan ke labu didih kemudian tuangkan 10 mL
reagen Luff Schoorl.
4. Sampel dididihkan pada refluks selama 10 menit, kemudian
tambahkan 6 mL KI 20% and 10 mL H2SO4 dengan hati-hati melalui
dinding labu.
5. Titrasi sampel dengan Na2S2O3 0,1 N hingga berwarna kuning, lalu
tambah amilum 1% titrasi dilanjutkan sampai warna biru hilang.
6. Buat blanko titrasi menggunakan air sebagai pengganti sampel. Kadar
gula reduksi dihitung dengan rumus :
Koloni per gram = Koloni Jumlah x 1
Faktor pengenceran
Gula Reduksi (%) =
32
Keterangan
AT= angka tabel Luff Shoorls
Fp= faktor pengenceran
3.5.5. Pengujian Alkohol Spektrofotometer ( James, 1995 )
1. Penentuan Kuva standar : digunakan ethanol dengan berbagai konsentrasi
0%, 0,3%, 0,6%, 0,12%, 0,25%, 0,5%, 1%. Masing-masing larutan standar
diukur absorbansinya pada panjang gelombang 600 nm;
2. Sebanyak 0,5 sampel cair, diencerkan dengan akuades 15 ml;
3. K2CrO4 sebanyak 12,5 ml ditambahkan sampai terjadi perubahan warna
menjadi jingga saat ditambahkan kalium dikromat;
4. Campuran sampel dipanaskan. Hal ini bertujuan agar reaksi berlangsung
cepat. Setelah pemanasan, sampel berwarna hijau kehitaman;
5. Campuran yang telah diencerkan didinginkan dan dihomogenkan dengan
vortex, kemudian ukur absorbansi pada panjang gelombang 600 nm.
6. Dihitung kadar alkohol dalam sampel.
3.5.6. Pengujian Total Yeast ( Fardiaz, 1993 )
1. Larutan water kefir nanas 1 ml diambil dan dimasukkan kedalam tabung
reaksi dan tambahkan akuades 9 ml lalu vortex, kemudian encerkan
sampai pangkat 4 pengenceran
2. Pengambilan Isolat khamir yang dihasilkan 1 ml, kemudian ditanam pada
medium PDA (potato dextrose agar 39g/lt) steril;
3. Diinkubasi dengan temperature suhu 25oC, 30
oC dan 37
oC selama 72 jam;
4. Koloni yang tumbuh dihitung jumlahnya sebagai tanda adanya
pertumbuhan yeast.
33
3.5.7.Pengujian Warna Metode L, a, b Hunter ( Yuwono,1998 )
Pengujian warna menggunakan colour reader. Adapun langkah-
langkahnya adalah
1. Disiapkan sampel dalam plastik PP (transparan).
2. Colour reader dinyalakan. Kemudian menentukan target L, a, b.
Dimana; L, adalah kecerahan ; axis a, nilai positif (+) berarti merah,
nilai (-) berarti hijau; axis b, nilai positif (+) berarti kuning, dan nilai
negatif (-) berarti biru.
3. Tombol target ditarget dan kemudian mencatat nilai warna pada
tertera.
3.5.8. Uji Organoleptik Hedonic Scale ( Rahayu, 2001 )
Uji organoleptik yang dilakukan meliputi kesukaan, aroma, rasa, dan
mouthfeel. Pengujian menggunakan uji skala hedonic yang terdiri dari 5 nilai
dapat dilihat pada Tabel 7.
Tabel 7. Skor Organoleptik
Skor Skor Kesukaan Skor Aroma Skor Rasa Skor Mouthfeel
1 Sangat tidak suka Sangat tidak
menyengat
Sangat tidak
asam
Sangat sparkling
2 Tidak suka Tidak menyengat Tidak asam Tidak sparkling
3 Cukup suka Cukup menyengat Cukup asam Cukup
Sparkling
4 Suka Menyengat Asam Sparkling
5 Sangat suka Sangat
menyengat
Sangat asam Sangat sparkling
34
3.6. Analisa Data
Data pengujian total asam, pH, total BAL, total yeast, gula reduksi,
kadar alcohol, dan warna serta organoleptik tiap parameter pada penelitian
ini dianalisis menggunakan analisa data ANOVA (Analysis of Variant) untuk
mengetahui interaksi dan pengaruh dari setiap perlakuan. Jika terdapat
Interaksi, maka akan diuji lanjut menggunakan uji DMRT 5% (Duncan’s
Multiple Range Test) dan untuk memilih kombinasi perlakuan terbaik pada
penelitian ini menggunakan nilai efektivitas uji De Garmo. Penentuan perbedaan
signifikan secara statistik diuji dengan uji t-test (uji T).