IDENTIFIKASI DAN PENETAPAN KOEFISIEN EKSTINGSI VITAMIN B 12

DENGAN SPEKTROFOTOMETER UV-VIS

Hari/Tanggal : Jum’at/19 Maret 2015

I. PENDAHULUAN

Vitamin B12 disebut juga sianokobalamin, adalah sebuah vitamin larut air yang

berperan penting dalam berfungsi normalnya otak dan sistem saraf, serta dalam pembentukan

darah. Vitamin ini merupakan salah satu dari delapan vitamin B. Umumnya, vitamin ini

terlibat dalam metabolisme setiap sel dalam tubuh, terutama pengaruhnya pada sintesis dan

regulasi DNA serta pada sintesis asam lemak dan produksi energi.

Vitamin B12 merupakan kumpulan senyawa-senyawa yang terhubung secara kimia,

yang semuanya memiliki aktivitas sebagai vitamin. Secara struktur, vitamin B12 adalah

vitamin yang paling kompleks dan mengandung elemen kobal yang jarang tersedia secara

biokimia. Biosintesis dari struktur dasar vitamin ini hanya dapat dilakukan oleh bakteri,

namun konversi antara bentuk-bentuknya yang berbeda dapat terjadi dalam tubuh. Suatu

bentuk sintesis yang umum dari vitamin ini, sianokobalamin, tidak terjadi di alam, namun

digunakan dalam banyak sediaan farmasi dan suplemen, dan juga sebagai bahan tambahan

makanan karena kestabilannya dan harganya yang lebih murah. Dalam tubuh, vitamin ini

diubah menjadi bentuk fisiologisnya, metilkobalamin dan adenosilkobalamin, dengan

membuang gugus sianida nya walaupun dalam konsentrasi minimal. Baru-baru ini,

hidroksokobalamin (suatu bentuk kobalamin yang dihasilkan dari bakteri), metilkobalamin,

dan adenosilkobalamin juga dapat ditemukan pada produk farmakologi dan suplemen

makanan yang mahal. Kegunaaan dari zat-zat ini masih diperdebatkan.

Spektrofotometer UV-Visible sering digunakan untuk keperluan penetapan kadar dan

identifikasi suatu senyawa. Panjang gelombang yang secara maksimum diabsorbsi ditentukan

dengan mengukur absorbansi sampel pada rentang panjang gelombang yang telah ditentukan.

Setelah cahaya melewati larutan uji, energi cahaya yang melewati  phototube dinyatakan

sebagai rasio transmitansi cahaya I (cahaya yang melewati sample) terhadap cahaya incident

I0 (intensitas cahaya dari sumber sebelum melewati sample). Cahaya yang diterima phototube

adalah diukur sebagai persen transmitansi (%T)  atau sebagai log kebalikannya, absorbansi

(A).

Jika I lebih kecil dari Io, artinya sampel menyerap sejumlah sinar. Dalam hal ini

terdapat hubungan yang sederhana antara absorbansi (A) dengan intensitas cahaya yang

melewati sampel dan intensitas cahaya sebelum melewati sampel, yakni :

Bagian sinar yang diserap akan tergantung pada berapa banyak molekul yang

beinteraksi dengan sinar. Dengan kata lain nilai absorbansi sangat bergantung pada

konsentrasi suatu senyawa. Hubungan antara banyaknya cahaya yang diserap dengan

konsentrasi suatu senyawa dinyatakan secara kuantitatif melalui persamaan Hukum

Lambert-Beer :

Log I0 / I = ε. L. C ................................... *)

Keterangan :

I0   =    Intensitas cahaya sebelum melewati sample

I     =    Intensitas cahaya setelah melewati sample

ε      =  Koefisien ekstingsi, yaitu konstanta yang tergantung pada sifat alami dari senyawa

substansi dan panjang gelombang yang digunakan untuk analisis

L    =    Panjang atau jarak cahaya yang melewati sample

C   =    Konsentrasi dari larutan yang dianalisa

Koefisien ekstingsi sering pula dinyatakan dalam koefisien absorptivitas molar. Nilai

absorptivitas molar dapat bervariasi. Dalam pengukuran kemurnian suatu senyawa dapat

dilakukan dengan menentukan harga serapan relatifnya. Serapan relatif adalah perbandingan

harga serapan pada 2 ujung panjang gelombang tertentu dimana untuk zat tertentu besarnya

tertentu pula, sehingga dapat digunakan untuk mengidentifikasi kemurnian zat tersebut.

II. TUJUAN

1. Memahami prinsip identifikasi vitamin B12 melalui metode spektrofotometer UV-VIS

2. Menentukan koefisien ekstingsi absorptivitas molar (ε) melalui vitamin B12 dengan alat

spektrofotometer UV-VIS

III. METODE PRAKTIKUM

A. ALAT DAN BAHAN

Alat yang digunakan pada praktikum ini adalah spektrofotometer UV-VIS, Tabung

reaksi, Gelas beker, Tisu, Pipet, Mortar, kertas saring, corong, erlenmeyer.

Bahan yang digunakan pada praktikum ini adalah vitamin B12, aquadest

B. PROSEDUR KERJA

B.1 Preparasi sampel

Ditimbang sampe B 12, dilarutkan dengan 8 ml aquades lalu disaring. Ditepatkan

sampai volumenya 10 ml. Untuk vitamin B 12 yang berbentuk ampul, dilihat konsentrasinya,

dan diencerkan sampai kurang lebih menjadi 40 ppm.

B.2 Pengukuran nilai serapan relatif

Dinyalakan alat, minimal 15 menit sebelum digunakan. Disiapkan larutan blanko

aquades, dimasukkan kedalam kuvet, dikeringkan bagian sisi terang kuvet agar tidak ada

larutan yang menempel di luar kuvet. Dipilih aplikasi wavelength program. Dipilih lampu

yang akan digunakan dan dipilih berapa kali ulangan pembacaan. Dimasukkan sejumlah

sampel yang akan diukur dandiberi nama. Diklik autozero, dimasukkan kuvet yang telah

berisi sampel ke holder. Diklik ok. Ditunggu sampai pembacaan atau nilai absorbansi 0.00.

Setelah kalibrasi,diganti kuvet bagian depan dengan sampel atau larutan yang akan dicari

nilai serapannya. Dibilas kuvet terlebih dahulu dengan aquades, kemudian bilas dengan

sampel yang akan diukur. Diklik start dan diukur sampel. Diperhatikan serapan yang muncul.

Diikuti perintah berikutnya sampai semua sampel selesai diukur. Dihitunglah perbandingan

serapan pada 361/550nm dan 361/278 nm.

IV. HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

Pada praktikum kali ini dilakukan identifikasi vitamin untuk mengetahui kemurnian

vitamin B12 yang terkandung dalam sampel yang akan dianalisa serta melakukan penetapan

koefisien ekstingsi vitamin B12 dengan alat instrumentasi spektrofotometer UV-VIS. Sampel

yang digunakan adalah neurobion dimana pada sampel ini terkandung vitamin diantaranya

vitamin B12. Sampel yang telah dibuat menjadi larutan terlebih dahulu kemudian dibaca

serapannya pada panjang gelombang 200-600 nm dengan spektrofotometer UV-VIS.

Tabel I. Hasil Pengamatan spektrofotometer UV-VIS

Panjang gelombang (nm) Serapan Koefisien ekstingsi (ε)

550 0,684 5,955

361 2,527 2,200

278 10.000 0,087

Konsentrasi Vitamin B12 114860

Struktur Vitamin B12

Berdasarkan praktikum yang dilakukan, diperoleh serapan pada panjang gelombang

550 nm, 361 nm, dan 278 nm masing-masing adalah 0,684; 2,527; 10.000. Dari serapan

diatas diperoleh nilai serapan relatif yaitu 3,694 untuk 361/550 dan 0,2527 untuk 361/278.

Jika dibandingkan dengan literatur, maka hasil yang diperoleh belum sesuai. Dimana serapan

relatif sianokobalamin berdasarkan referensi Farmakope Indonesia Edisi IV hal. 723 – 724

adalah 3,15 – 3,45 untuk 361/550 dan 1.75-1.98 untuk 361/278. Sehingga dapat dikatakan

bahwa vitamin B12 yang terkandung dalam sampel Neurobion tidak murni melainkan adanya

kandungan vitamin lain sehingga hasil yang diperoleh tidak sesuai dengan yang terdapat

dalam farmakope. Hal ini disebabkan berdasarkan data yang diperoleh dari Merck bahwa

Neurobion merupakan obat yang mengandung sejumlah vitamin selain vitamin B12, yaitu

vitamin B1 dan vitamin B6 dimana vitamin-vitamin tersebut merupakan vitamin neurotropik

yang dapat berfungsi untuk memperbaiki sistem metabolisme tubuh. Dalam satu pil

Neurobion terkandung ketiga vitamin tersebut dengan komposisi yang tertulis pada tabel II.

Tabel II. Komposisi vitamin pada Neurobion

Jenis Vitamin Jumlah

vitamin B1 100 mg

vitamin B6 200 mg

vitamin B12 100 mg

Sianokobalamin memiliki dua puncak serapan dalam spektrum UV-VIS. Dua puncak

serapan ini disebabkan oleh promosi elektron dari pasangan elektron bebas gugus karbonil

dan delokalisasi elektron ikatan rangkap terkonjugasi dari orbital pi ikatan ke orbital pi anti-

ikatan.

Koefisien ekstingsi merupakan konstanta yang tergantung pada sifat alami dari

senyawa substansi dan panjang gelombang yang digunakan untuk analisis. Nilainya dapat

bervariasi. Koefisien ekstingsi juga merupakan absorptivitas molar yang menunjukkan

besarnya cahaya yang terserap oleh senyawa yang dianalisis. Menurut hukum Lambert Beer,

nilai koefisien ekstingsi berbanding lurus dengan serapan. Berdasarkan hasil perhitungan,

diketahui koefisien ekstingsi (ε) untuk panjang gelombang 550 nm, 361 nm dan 278 masing-

masing adalah 5,995; 2,200 dan 0,087. Nilai koefisien ekstingsi yang paling besar terdapat

pada panjang gelombang 550 nm yang menunjukkan bahwa penyerapan cahaya pada panjang

gelombang ini paling banyak diantara panjang gelombang 361 nm dan 278 nm.

V. KESIMPULAN

Berdasarkan praktikum yang diperoleh, dapat diketahui bahwa vitamin B12 yang

terdapat dalam sampel Neurobion belum murni dan diketahui koefisien ekstingsi (ε) untuk

panjang gelombang 550 nm, 361 nm dan 278 nm smasing-masing adalah 5,995; 2,200 dan

0,087.

VI. DAFTAR PUSTAKA

Budavari. 2001. The Merck Index. Encyclopedia od Chemicals, Drugs, and Biologicals.

Thirteenth Edition. White House : Merck & Co., Inc. Page 1170.

Ditjen POM. 1995. Farmakope Indonesia. Edisi IV. Jakarta: Departemen Kesehatan Repubik

Indonesia. Jakarta. Halaman 723 – 724.

Gandjar, I. G. dan Rohman, A. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Cetakan II. Yogyakarta:

Pustaka pelajar. Halaman 246.

LAMPIRAN

Nilai Serapan

- 361/550 = 2,527/0,684 = 3,694

- 361/278 = 2,527/10.000 = 0,2527

Penetapan koefisien ekstingsi

L = 1,1486 gr/10 ml = 114860

- Log I0 / I = ε. L. C

0,684 = ε. 114860. 1

ε = 5,995

- Log I0 / I = ε. L. C

2,527 = ε. 114860. 1

ε = 2,200

- Log I0 / I = ε. L. C

10.000 = ε. 114860. 1

ε = 0,087

Bahasan

Kemurnian

Struktur

Gugus kromofor

Perbedaan panjang gelombang serapan dengan standar, signifikan atau engga. Klo ya

hunbungkan dengan rumus lambert beer