SPEKTROFOTOMETER UV-VIS

Spektrofotometer adalah alat untuk menukur transmitan atau absorban suatu sampel

sebagai fungsi panjang gelombang. Spektrofotometer merupakan gabungan dari alat optic dan

elektronika serta sifat-sifat kimia fisiknya. Spektrofotometer sesuai dengan namanya merupakan

alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer. Spektrometer menghasilkan sinar dari

spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas

cahaya yang ditransmisikan atau yang diabsorbsi. Jadi spektrofotometer digunakan untuk

mengukur energi cahaya secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan, direfleksikan atau

diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang. Suatu spektrofotometer tersusun dari sumber

spektrum sinar tampak yang sinambung dan monokromatis. Sel pengabsorbsi untuk mengukur

perbedaan absorbsi antara cuplikan dengan blanko ataupun pembanding. Spektrofotometer Uv-

Vis merupakan spektrofotometer yang digunakan untuk pengukuran didaerah ultra violet dan

didaerah tampak. Semua metode spektrofotometri berdasarkan pada serapan sinar oleh senyawa

yang ditentukan, sinar yang digunakan adalah sinar yang semonokromatis mungkin.

Spektrofotometer UV-Vis (Ultra Violet-Visible) adalah salah satu dari sekian banyak instrumen

yang biasa digunakan dalam menganalisa suatu senyawa kimia. Spektrofotometer umum

digunakan karena kemampuannya dalam menganalisa begitu banyak senyawa kimia serta

kepraktisannya dalam hal preparasi sampel apabila dibandingkan dengan beberapa metode

analisa. Spektrofotometri UV/Vis melibatkan energi elektronik yang cukup besar pada molekul

yang dianalisis, sehingga spetrofotometer UV/Vis lebih banyak dpakai ntuk analisis kuantitatif

dibanding kualitatif. Spektrofotometri UV-vis adalah pengukuran serapan cahaya di daerah

ultraviolet (200–350 nm) dan sinar tampak (350 – 800 nm) oleh suatu senyawa. Serapan cahaya

uv atau cahaya tampak mengakibatkan transisi elektronik, yaitu promosi elektron-elektron dari

orbital keadaan dasar yang berenergi rendah ke orbital keadaan tereksitasi berenergi lebih

tinggi.Dimana detector dapat mengukur intensitas cahaya yang dipancarkan secara tidak

langsung cahaya yang diabsorbsi. Tiap media akan menyerap cahaya pada panjang gelombang

tertentu tergantung pada senyawa atau warna yang terbentuk

Tipe Instrumen Spektrofotometer

Pada umumnya terdapat dua tipe instrumen spektrofotometer, yaitu single-beam dan double-

beam. gambar Single-beam instrument dan Double-beam instrument

1. Single-beam instrument dapat digunakan untuk kuantitatif dengan mengukur absorbansi

pada panjang gelombang tunggal. Single-beam instrument mempunyai beberapa

keuntungan yaitu sederhana, harganya murah, dan mengurangi biaya yang ada

merupakan keuntungan yang nyata. Beberapa instrumen menghasilkan single-beam

instrument untuk pengukuran sinar ultra violet dan sinar tampak. Panjang gelombang

paling rendah adalah 190 sampai 210 nm dan paling tinggi adalah 800 sampai 1000 nm

(Skoog, DA, 1996).Single-beam instrument

1. Double-beam instrument Double-beam dibuat untuk digunakan pada panjang gelombang

190 sampai 750 nm. Double-beam instrument dimana mempunyai dua sinar yang

dibentuk oleh potongan cermin yang berbentuk V yang disebut pemecah sinar. Sinar

pertama melewati larutan blangko dan sinar kedua secara serentak melewati sampel,

mencocokkan fotodetektor yang keluar menjelaskan perbandingan yang ditetapkan secara

elektronik dan ditunjukkan oleh alat pembaca (Skoog, DA, 1996).

Spektrofotometri UV-Vis merupakan gabungan antara spektrofotometri UV dan Visible.

Alat ini menggunakan dua buah sumber cahaya yang berbeda, yaitu sumber cahaya UV dan

sumber cahaya Visible. Larutan yang dianalisis diukur serapan sinar ultra violet atau sinar

tampaknya. Konsentrasi larutan yang dianalisis akan sebanding dengan jumlah sinar yang

diserap oleh zat yang terapat dalam larutan tersebut

Warna yang diserap oleh suatu senyawa merupakan warna komplementer dari warna

yang teramati. Beberapa warna yang diamati dan warna komplementernya terdapat pada

tabel berikut ini :

Panjang gelombang Warna terlihat Warna

komplementer

<400 Ultraviolet -

400-450 Violet Kuning

450-490 Biru Jingga

490-550 Hijau Merah

550-580 Kuning Ungu

580-650 Jingga Biru

650-700 Merah Hijau

>700 Inframerah

Sinar dari sumber cahaya akan dibagi menjadi dua berkas oleh cermin yang berputar pada

bagian dalam spektrofotometer. Berkas pertama akan melewati kuvet berisi blanko,

sementara berkas kedua akan melewati kuvet berisi sampel. Blanko dan sampel akan

diperiksa secara bersamaan. Adanya blanko, berguna untuk menstabilkan absorbsi akibat

perubahan voltase dari sumber cahaya.

Prinsip kerja

Spektrofotometri uv-vis mengacu pada hukum Lambert-Beer. Apabila cahaya

monokromatik melalui suatu media (larutan), maka sebagian cahaya tersebut akan

diserap, sebagian dipantulkan dan sebagian lagi akan dipancarkan.

Bagian-bagian Spektrofotometer UV-Vis

1. Sumber cahaya

Sumber cahaya pada spektrofotometer harus memiliki panacaran radiasi yang stabil

dan intensitasnya tinggi. Sumber  cahaya pada spektrofotometer UV-Vis ada dua

macam :

a. Lampu Tungsten (Wolfram) Lampu ini digunakan untuk mengukur sampel

pada daerah tampak. Bentuk lampu ini mirip dengna bola lampu pijar biasa.

Memiliki panjang gelombang antara 350-2200 nm. Spektrum radiasianya

berupa garis lengkung. Umumnya memiliki waktu 1000jam pemakaian.

b. Lampu Deuterium Lampu ini dipakai pada panjang gelombang 190-380 nm.

Spektrum energy radiasinya lurus, dan digunakan untuk mengukur sampel

yang terletak pada daerah uv. Memiliki waktu 500 jam pemakaian.

2. Monokromator

Monokromator adalah alat yang akan memecah cahaya polikromatis menjadi  cahaya

tunggal (monokromatis) dengan komponen panjang gelombang tertentu. Bagian-

bagian monokromator, yaitu :

a. Prisma

Prisma akan mendispersikan radiasi elektromagnetik sebesar mungkin supaya

di dapatkan resolusi yang baik dari radiasi polikromatis.

b. Grating (kisi difraksi)

Kisi difraksi memberi keuntungan lebih bagi proses spektroskopi. Dispersi

sinar akan disebarkan merata, dengan pendispersi yang sama, hasil dispersi

akan lebih baik. Selain itu kisi difraksi dapat digunakan dalam seluruh

jangkauan spektrum.

c. Celah optis

Celah ini digunakan untuk mengarahkan sinar monokromatis yang diharapkan

dari sumber radiasi. Apabila celah berada pada posisi yang tepat, maka radiasi

akan dirotasikan melalui prisma, sehingga diperoleh panjang gelombang yang

diharapkan.

d. Filter

Berfungsi untuk menyerap warna komplementer sehingga cahaya yang

diteruskan merupakan cahaya berwarna yang sesuai dengan panjang

gelombang yang dipilih.

3. Kompartemen sampel

Kompartemen ini digunakan sebagai tempat diletakkannya kuvet. kuvet merupakan

wadah yang digunakan untuk menaruh sampel yang akan dianalisis. Pada

spektrofotometer double beam, terdapat dua tempat kuvet. Satu kuvet digunakan

sebagai tempat untuk menaruh sampel, sementara kuvet lain digunakan untuk menaruh

blanko. Sementara pada spektrofotometer single beam, hanya terdapat satu kuvet.

Kuvet yang baik harus memenuhi beberapa syarat sebagai berikut :

a. Permukaannya harus sejajar secara optis

b. Tidak berwarna sehingga semua cahaya dapat di transmisikan

c. Tidak ikut bereaksi terhadap bahan-bahan kimia

d. Tidak rapuh

e. Bentuknya sederhana

Terdapat berbagai jenis dan bentuk kuvet pada spektrofotometer. Umumnya pada

pengukuran di daerah UV, digunakan kuvet yang terbuat dari bahan kuarsa atau

plexiglass. Kuvet kaca tidak dapat mengabsorbsi sinar uv, sehingga tidak digunakan

pada saat pengukuran di daerah UV.  Oleh karena itu, bahan kuvet dipilih berdasarkan

daerah panjang gelombang yang digunakan. Gunanya agar dapat melewatkan daerah

panjang gelombang yang digunakan.

• UV : fused silika, kuarsa

• Visible : gelas biasa, silika atau plastik

• IR : KBr, NaCl, IRTRAN atau kristal dari senyawa ion

Bahan Panjang gelombang

Silika 150-3000

Gelas 375-2000

Plastik 380-800

4. Detektor

Detektor akan menangkap sinar yang diteruskan oleh larutan. Sinar kemudian diubah

menjadi sinyal listrik oleh amplifier dan dalam rekorder dan ditampilkan dalam bentuk

angka-angka pada reader (komputer).Terdapat beberapa jenis detector pada

spektrofotometer :

Jenis detector λ range (nm) Sifat pengukuran Penggunaan

Phototube 150 – 1000 arus listrik UV

Photomultiplier 150 – 1000 arus listrik UV/Vis

Solid state 350 – 3000

Thermocouple 600 – 20.000 arus listrik IR

Thermistor 600 – 20.000 hambatan listrik IR

Syarat-syarat ideal sebuah detector adalah :

a. Mempunyai kepekaan tinggi

b. Respon konstan pada berbagai panjang gelombang

c. Waktu respon cepat dan sinyal minimum tanpa radiasi

d. Sinyal listrik ayng dihasilkan harus sebanding dengan tenaga radiasi

5. Visual display

Merupakan system baca yang memperagakan besarnya isyarat listrik, menyatakan

dalam bentuk % Transmitan maupun Absorbansi.

Prosedur Kerja

Cahaya yang berasal dari lampu deuterium maupun wolfram yang bersifat polikromatis

di teruskan melalui lensa menuju ke monokromator pada spektrofotometer dan filter cahaya pada

fotometer. Monokromator kemudian akan mengubah cahaya polikromatis menjadi cahaya

monokromatis (tunggal). Berkas-berkas cahaya dengan panjang tertentu kemudian akan

dilewatkan pada sampel yang mengandung suatu zat dalam konsentrasi tertentu. Oleh karena itu,

terdapat cahaya yang diserap (diabsorbsi) dan ada pula yang dilewatkan. Cahaya yang

dilewatkan ini kemudian di terima oleh detector. Detector kemudian akan menghitung cahaya

yang diterima dan mengetahui cahaya yang diserap oleh sampel. Cahaya yang diserap sebanding

dengan konsentrasi zat yang terkandung dalam sampel sehingga akan diketahui konsentrasi zat

dalam sampel secara kuantitatif

Hal-hal yang harus diperhatikan

1. Larutan yang dianalisis merupakan larutan berwarna

Apabila larutan yang akan dianalisis merupakan larutan yang tidak berwarna, maka

larutan tersebut harus diubah terlebih dahulu menjadi larutan yang berwarna. Kecuali

apabila diukur dengan menggunakan lampu UV.

2. Panjang gelombang maksimum

3. Panjang gelombang yang digunakan adalah panjang gelombang yang mempunyai

absorbansi maksimal. Hal ini dikarenakan pada panjang gelombang maksimal,

kepekaannya juga maksimal karena pada panjang gelombang tersebut, perubahan

absorbansi untuk tiap satuan konsentrasi adalah yang paling besar. Selain itu disekitar

panjang gelombang maksimal, akan terbentuk kurva absorbansi yang datar sehingga

hukum Lambert-Beer dapat terpenuhi. Dan apabila dilakukan pengukuran ulang, tingkat

kesalahannya akan kecil sekali.

4. Kalibrasi Panjang gelombang dan Absorban Spektrofotometer

digunakan untuk mengukur intensitas cahaya yang dipancarkan dan cahaya yang

diabsorbsi. Hal ini bergantung pada spektrum elektromagnetik yang diabsorb oleh benda.

Tiap media akan menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu tergantung pada

senyawa yang terbentuk. Oleh karena itu perlu dilakukan kalibrasi panjang gelombang

dan absorban pada spektrofotometer agar pengukuran yang di dapatkan lebih teliti.

Sesuai dengan namanya spektrofotometer UV-Vis merupakan gabungan antara

spektrofotometer UV dan Visible. Pada spektrofotometer UV-Vis menggunakan dua buah

sumber cahaya berbeda yakni sumber cahaya UV dan sumber cahaya visible. Spektrofotometer

UV-Vis merupakan spektrofotometer berkas ganda sedangkan pada spektrofotometer VIS

ataupun UV termasuk spektrofotometer berkas tunggal. Pada spektrofotometer berkas ganda

blanko dan sampel dimasukan atau disinari secara bersamaan, sedangkan spektrofotometer

berkas tunggal blanko dimasukan atau disinari secara terpisah.

Spektrofotometer UV-VIS seperti yang tertera pada gambar.

Kini spektrofotometer yang digunakan hanya menggunakan satu lampu sebagai sumber

cahaya. Lampu yang digunakan sebagai sumber cahaya yaitu photodiode yang telah dilengkapi

monokromator. Monokromator disini berfungsi untuk mengubah cahaya yang berasal dari

sumber cahaya sehingga diperoleh cahaya hanya dengan satu jenis panjang gelombang. Zat yang

dapat dianalisis dengan spektrofotometri UV-Vis yaitu zat dalam bentuk larutan dan zat yang

tampak berwarna maupun berwarna. Jenis spektroskopi UV-Vis terutama berguna untuk

analisis kuantitatif langsung misalnya kromofor, nitrat, nitrit dan kromat sedangkan secara tak

langsung misalnya ion logam transisi.

Langkah-langkah utama dalam analisa dengan sinar UV/Vis

Pembentukan molekul yang dapat menyerap sinar UV/Vis

Harus dilakukan jika senyawa yang dianalisa tidak melakukan penyerapan didaerah

UV/Vis

Senyawa harus diubah menjadi bentuk lain yang dapat melakukan penyerapan pada

daerah yang dimaksud. Misalnya mengubah menjadi berwarna atau tidak berwarna.

Pemilihan panjang gelombang agar diperoleh panjang gelombang maksimum.

Pembuatan kurva kalibrasi. Untuk keperluan ini dibuat sejumlah larutan standar dengan

berbagai konsentrasi.

Absorbans larutan standart ini diukur kemudian dibuat grafik A versus C.

Hukum Lambert Beer terpenuhi, jika grafik berbentuk garis lurus yang melalui titik nol.

Pengukuran sampel dilakukan pada kondisi yang sama seperti pada larutan standart.

Interferensi

Pengukuran dengan menggunakan UV-Vis dapat berhasil dengan baik asal kondisi-kondisi

operasional telah dikendalikan dengan sangat seksama. Adapun interferensi yang sering dijumpai

apabila melakukan analisis dengan UV-Vis adalah:

1. Mencari reaksi yang spesifik Misalkan bila kita menetapkan besi yang tercampur

dengan kobalt sebaiknya jangan memakai KCNS, tetapi pakailah cara

Ortophenantrolin. Reaksi yang sifatnya spesifik biasanya biasanya sedikit sekali,

akan tetapi dapat diatasi dengan mengatur pH, pemakaian masking agent,

ekstraksi dengan pelarut atau dengan cara lain. Bila kita melakukan reaksi,

usahakan zat lain tidak ikut bereaksi, apalagi kita menghasilkan senyawa yang

mempunyai λmaks berdekatan.

2. Tetapkan pada λ maks, λ maks adalah λ dimana contoh memberikan serapan

(absorbsi) maksimum. λmaks dapat ditetapkan dengan dengan mengalurkan A

terhadap λ dari suatu larutan dalam deret standar. Penetapan pada λmaks akan

memberikan keuntungan antara lain :

a. Kepekaan maksimum, karena pada perubahan konsentrasi larutan akan

memberikan perubahan A yang paling besar (memperkecil kesalahan)

b. Pada λmaks akan didapatkan bentuk kurva kalibrasi yang linier sesuai dengan

Lambert – Beer.

3. Waktu kestabilan reaksi

Suatu reaksi kimia ada yang berlangsung cepat ada pula yang lambat bahkan

setelah waktu tertentu akan terbentuk reaksi atau senyawa lain. Pada penetapan

cara spektrofotometri kestabilan reaksi sangat penting. Pada gambar terlihat reaksi

1 setelah waktu tertentu harga A naik, reaksi 2 reaksi stabil, reaksi 3 setelah waktu

tertentu harga A turun. Oleh karrena itu dalam mengukur Absorbansi contoh

hendaknya diperhatikan masalah waktu. Pengukuran jangan dibiarkan terlalu

lama atau terlalu cepat, misalnya :

a. Penetapan al dengan Eriokrom sianida R harga A ditetapkan setelah 30

menit.

b. Penetapan Fe cara ortophenantrolin harga A ditetepkan setelah 5 – 10

menit.

4. Penyesuaian dengan Lambert – Beer

Kurva kalibrasi menurut Lambert – Beer seharusnya linier. Pada kenyataannya

bila makin pekat kurva akan melengkung. Pada gambar sebaiknya kita membuat

deret standar sampai kepekatan C1 saja. Harga A contoh sebaiknya jangan lebih

dari A1.

5. Pemilihan pelarut

Pelarut yang dipakai hendaknya mempunyai kemurnian yang tinggi, tidak

mengabsorbsi λ pada daerah pengukuran, tidak berinteraksi dengan contoh

6. Kesalahan relatif

Untuk mendapatkan kesalahan relative yang kecil pengukuran sebaiknya pada

absorbsansi 0,2 – 0,7.

Interpretasi dan Pengolahan Data Analisis

Penyebab kesalahan sistematik yang sering terjadi dalam analisis

menggunakanSpektrofotometer UV-Vis adalah:

1. Serapan oleh pelarut. Hal ini dapat diatasi dengan penggunaan blangko, yaitu larutan

yang berisi matrik selain komponen yang akan dianalisis.

2. Serapan oleh kuvet. Kuvet yang biasa digunakan adalah dari bahan gelas atau kuarsa.

Dibandingkan dengan kuvet dari bahan gelas, kuvet kuarsa memberikan kualitas yang

lebih baik, namun tentu saja harganya jauh lebih mahal. Serapan oleh kuvet ini diatasi

dengan penggunaan jenis, ukuran, dan bahan kuvet yang sama untuk tempat blangko dan

sampel.

Kesalahan fotometrik normal pada pengukuran dengan absorbansi sangat rendah atau sangat

tinggi. Hal ini dapat diatur dengan pengaturan konsentrasi, sesuai dengan kisaran sensitivitas dari

alat yang digunakan. (melalui pengenceran atau pemekatan). Sama seperti pHmeter, untuk

mengatasi kesalahan pada pemakaian spektrofotometer. UV-Vis maka perlu dilakukan kalibrasi.

Kalibrasi dalam spektrofotometer UV-Vis dilakukan dengan menggunakanblangko:

Maka dari itu untuk menghindari kesalahan-kesalahan diatas, langkah-langkah utama dalam

analisis kuantitatif adalah ;

Pembentukan warna (untuk zat yang yang tak berwarna atau warnanya kurang kuat),

Penentuan panjang gelombang maksimum,

Pembuatan kurva kalibrasi,

Pengukuran konsentrasi sampel.

Larutan-larutan standar sebaiknya memiliki komposisi yang sama dengan komposisi cuplikan

sementara konsentrasi cuplikan berada diantara konsentrasi-konsentrasi larutan standar.

Dengan membandingkan serapan radiasi oleh sampel terhadap larutan standar yang telah

diketahui konsentrasinya dapat ditentukan konsentrasi sampel. Penentuan konsentrasi zat dalam

contoh dapat ditentukan dengan dua cara, yaitu dengan cara kurva kalibrasi dan cara standar

adisi.

Cara kurva kalibrasi

Hal pertama yang dilakukan dengan menggunakan cara ini adalah pembuatan deret larutan

standar, kemudian diukur serapannya dan dibuat kurva kalibrasi antara konsentrasi dengan

serapan. Dengan mengukur serapan sampel dan memasukannya kedalam persamaan garis yang

dihasilkan dari kurva kalibrasi, maka konsentrasi sampel akan diketahui.

Cara standar adisi.

Hal pertama yang dilakukan adalah menambahkan sejumlah larutan sampel yang sama ke

dalam larutan standar. Cara ini menggunakan persamaan Lamber-Beer; Dimana Ac merupakan

absorbansi campuran antara sampel dan standar sedangkan Vx, Vs, Vt adalah volume standar,

volume standar dan volume total. Sedangkan Cx dan Cs adalah konsentrasi sampel dan standar.

Kurva Ac diperoleh dengan cara mengikuti persamaan di atas. Dimana kurva Ac merupakan

fungsi dari Vs dan berbentuk linier. Dengan menggunakan persamaan tersebut juga dapat

ditentukan konsentrasi sampel ( Cx ). Secara ideal, standar kalibrasi harus mendekati komposisi

sampel yang akan dianalisis, termasuk konsentrasi spesies lain dalam matriks sampel untuk

menekan berbagai komponen terhadap absorbansi yang terukur. Metode ini sangat dianjurkan

untuk matriks yang kompleks, seperti sampel tanah, mineral dan abu tanaman. Teknik

analisisnya dengan menggunakan sederet standar yang berbeda kadarnya terhadap sampel yang

sama jumlahnya.

Kelebihan Spektrofotometer

1. Penggunaannya luas. Dapat digunakan untuk senyawa organic, anorganik dan biokimia

yang diabsorbsi pada daerah ultraviolet maupun daerah tampak

2. Sensitivitasnya tinggi. Batas deteksi untuk mengabsorbsi dapat diperpanjang menjadi 10-

6 sampai 10-7 M

3. Selektivitasnya tinggi

4. Ketelitiannya baik

5. Pengukurannya mudah, dengan kinerja yang cepat

Cara Perawatan dan Penyimpanan Alat

1. Sebelum digunakan, biarkan mesin warming-up selama 15-20 menit.

2. Spektrofotometer sebisa mungkin tidak terpapar sinar matahari langsung, karena cahaya

dari matahari akan dapat mengganggu pengukuran.

3. Simpan spektrofotometer di dalam ruangan yang suhunya stabil dan diatas meja yang

permanen.

4. Pastikan kompartemen sampel bersih dari bekas sampel.

5. Saat memasukkan kuvet, pastikan kuvet kering.

6. Lakukan kalibrasi panjang gelombang dan absorban secara teratur.

TUGAS KIMIA FARMASI II

“ SPEKTROFOTOMETER UV-VIS “

OLEH :

AA DIAH PRADNYANITA ( 111021 ) MADE DWI ARATI ( 111022 ) EKA TANAWATI ( 111023 ) ERLYN PUSPITAYANTHI ( 111024 )

AKADEMI FARMASI SARASWATI DENPASAR

2013