A. Radiasi Elektromagnetik

Radiasi elektromagnetik, yang mana sinar ultraviolet dan sinar tampak

merupakan salah satunya, dapat dianggap sebagai energi yang merambat dalam

bentuk gelombang. Beberapa istilah dan hubungan digunakan untuk menggambarkan

gelombang ini. Panjang gelombang ke titik yang bersebelahan pada panjang

gelombang yang berdekatan. DImensi panjang gelombang adalah panjang (L) yang

dapat dinyatakan dalam centimeter (cm) atau angstrom.

Gambar 1.Suatu panjang gelombang yang merupakan jarak dalam arah perambatan antara 2 titik yang

besesuaian

Frekuensi merupakan banyaknya gelombang yang melewati suatu titik

tertentu dalam satuan waktu. Dimensi frekuensi adalah seper waktu. Frekuensi biasa

disimbolkan dengan huruf latin nu (v). Bilangan panjang gelombang (1/λ) sehingga

satuannya adalah 1/panjang. Jika panjang gelombang dinyatakan dengan cm.

hubungan antara energi yang dimiliki radiasi elektromagnetik, frekuensi, dan panjang

gelombang yang bersangkutan.

E = h.v

V = Cλ

, dengan menggabungkan kedua persamaan diatas.

E = h . c

λ

Yang mana :

E = Energi radiasi cahaya

h = tetapan planck, 6,626x10-34 joule

c = kecepatan cahaya yang harganya 2,998x1010 joule

λ = panjang gelombang

Kisaran panjang gelombang frekuensi, dan spektrum elektromanetik. Sinar

ultraviolet mempunyai panjang gelombang antara 200-400 nm, sementara sinar

tampak mempunyai panjang gelombang 400-750 nm.

Gambar 2.Kisaran panjang gelombang, frekuensi, dan spektrum elektromagnetiknya

Warna sinar tampak dapat dihubungkan dengan panjang gelombangnya. Sinar

putih mengandung radiasi pada semua panjang gelombang di daerah sinar tampak.

Sinar pada panjang gelombang tunggal (radiasi monokromatik) dapat dipilih dari

sinar putih (sebagai contoh dengan alat prisma). Warna-warna yang dihubungkan

dengan panjang gelombang diringkas pada tabel.1. pada kolom ketiga disebutkan

juga warna komplementer, yang mempunyai makna jika salah satu komponen warna

putih dihilangkan maka sinar yang dihasilkan akan nampak sebagai komplemen

warna yang diserap tadi.

Tabel.1Panjang gelombang Warna yang diserap Warna yang diamati/

Warna komlementer

400 - 435 nm Ungu Hijau kekuningan

450 – 480 nm Biru Kuning

480 – 490 nm Biru kehijauan Orange

490 – 500 nm Hijau kebiruan Merah

500 – 560 nm Hijau Merah anggur

560 – 580 nm Hijau kekuningan Ungu

580 – 595 nm Kuning Biru

595 – 610 nm Orange Biru keunguan

610 – 750 nm Merah Hijau kebiruan

B. Penyerapan Radiasi oleh molekul

Semua molekul mempunyai energi yang dapat digambarkan menjadi beberapa

fenomena. (1) Molekul secara keseluruhan dapat bergerak yang kejadian ini disebut

dengan translasi; energi yang berhubungan dengan translasi tersebut disebut energi

translasional, Etrans, (2) bagian molekul (atom atau sekelompok atom) dapat bergerak

karena berkenaan satu sama lain. Gerakan ini disebut dengan vibrasi dan energinya

dinamakan dengan energi vibrasional, Evib, (3) molekul dapat berotasi pada sumbunya

dan rotasi ini dikarakterisasi dengan energi rotasional, Erot; (4) di samping bentuk

gerakan-gerakan tersebut suatu molekul memiliki konfigurasi elektronik, dan

energinya (energi elektronik, Eelek) tergantung pada keadaaan elektronik molekul.

Energi suatu molekul merupakan jumlah dari komponen-komponen energi

translasional, vibrasional, rotasional, dan elektronik.

E = Etrans + Evibr + Erot + Eelek

Menurut teori mekanika kuantum, komponen-komponen energi tersebut dpat

dianggap hanya memiliki nilai tertentu pada suatu molekul tetentu; dan energi-energi

ini dikatakan terkuantitasi Level energi energi tersebut berhubungan erat dengan

struktur molekulnya. Kita dapat mengharapkan bahwa tidak ada 2 molekul yang

mempunyai energi vibrasonal, rotasional, dan elektronik yang identik,

Jika suatu molekul bergerak dari suatu tingkat energi ke tingkat energ yang

lebih rendah maka beberapa energi akan dilepaskan. Energi ini dapat hilang sebagai

radiasi dan dapat dikatakan telah terjadi emisi radiasi. Jika suatu molekul dikenai

suatu radiasi elektromagnetik pada frekuensi yang sesuai sehingga energi molekul

tersebut ditingkatkan ke level yang lebih tinggi, maka terjadi peristiwa penyerapan

(absorpsi) energi oleh molekul. Supaya terjadi absorpsi, perbedaan energi antara dua

tingkat energi harus setara dengan energi foton yang diserap. Secara matematis,

pernyataan ini dapat diekspresikan dengan :

E2-E1 = hv

Yang mana :

E = energi pada tingkat yang lebih rendah

E = energi pada tingkat yang lebih tinggi

V = frekuensi foton yang diabsorpsi.

Suatu grafik yang menggambarkan proses ini dapat dilihat pada gambar 2.

Energi ini yang melompat dari suatu tingkat ke tingkat lain disebut dengan transisi,

dan komponen energi yang terlibat dalam proses penyerapan dapat dikatakan dengan

transisi rotasional, vibrasional, elektronik.

Gambar 3.Penyerapan (absorpsi) frekuensi (v) radiasi yang menyebabkan transisi dari tingkat energi 1

(rendah) ketingkat 2 (rendah).

Secara eksperimental, sangat mudah untuk mengukur banyaknya radiasi yang

diserap oleh suatu molekul secara fungsi frekuensi radiasi. Suatu grafik yang

menghubungkan antara banyaknya sinar yang diserap dengan frekuensi sinar

merupakan spektrum abbsorpsi. Transisi yang dibolehkan untuk suatu molekul

dengan struktur kimia yang berbeda adalah tidak sama sehingga spektra absorpsinya

juga berbeda. Dengan demikian, spektra dapat digunakan sebagai bahan informasi

yang bermanfaat untuk analisis kualitatif. Banyaknya sinar yang diabsorpsi pada

panjang gelombang tertentu sebanding dengan banyaknya molekul yang menyerap

radiasi, sehingga spektra absorpsi juga dapat digunakan untuk analisis kuantitatif.

Sinar ultraviolet dan sinar tampak memberikan energi yang cukup untuk

terjadinya transisi elektronik. Dengan demikian, spektra ultraviolet dan spektra

tampak dikatakan sebagai spektra elektronik keadaan energi yang paling rendah

disebut dengan keadaan dasar. Transisi-transisi elektronik akan meningkatkan energi

molekuler dari keadaan dasar ke satu atau lebih tingkat energi tereksitasi.

Jika suatu molekul sederhana dikenakan radiasi elektromagnetik maka

molekul tersebut akan menyerap radiasi elektromagnetik ini akan meningkatkan

energi potensial elektron pada tingkat keadaan tereksitasi, Apabila pada molekul yang

sederhana tadi hanya terjadi transisi elektronik pada satu macam gugus yang terdapat

pada molekul, maka hanya akan terjadi satu absorpsi yang merupakan garis spektrum

sebagaimana dalam gambar 4.

Pada kenyataannya, spektrum UV-Vus merupakan korelasi antara absorbansi

(sebagai ordinat) dan panjang gelombang (sebagai absis) bukan merupakan garis

spektrum akan tetapi merupakan suatu pita spketrum. Terbentuknya pita spektrum

UV-Vis tersebut disebabkan oleh terjadinya eksitasi elektronik lebih dari satu macam

pada gugus molekul yang sangat kompleks. Gambar 5 menggambarkan prinsip dasar

terbentuknya pita spektrum UV-Vis diberikan oleh molekul dengan struktur yang

lebih kompleks karena terjadi beberapa transisi. Sehingga mempunyai lebih dari satu

panjang gelombang maksimal.

Gambar 4Garis spektrum dengan model yang sederhana

Gambar 5.Gambaran terjadinya pita spektrum UV-Vis

C. Penyerapan Sinar Ultraviolet dan Sinar Tampak oleh Molekul

Penyerapan radiasi sinar ultraviolet dan sinar tampak oleh spesies atom atau

molekul (M) dapat dipertimbangkan sebagai proses 2 langkah; yang pertama adalah

melibatkan eksitasi sebagaimana ditunjukkan oleh persamaan berikut :

M + hv M*

Hasil reaksi antara M dengan foton (hv) merupakan partikel yang terkesitasi

secara elektronik yang disimbolkan dengan M*. Waktu hidup M* sangat pendek, dan

keberadaanya dapat diakhiri dengan berbagai relaksasi. Kebanyakan tipe relaksasi

melibatkan konversi energi eksitasi manjadi panas, sesuai dengan persamaan berikut :

M* M + panas

Relaksasi juga terjadi dekomposisi M* membentuk spesies baru, sebagaimana

suatu proses yang disebut dengan reaksi fotokimia, ALternatifnya, relaksasi juga

melibatkan emisi radiasi kembali yang dikenal dengan fluoresensi dan fosforesensi.

Penyerapan (absorpsi) sinar UV dan sinar tampak pada umumnya dihasilkan oleh

eksitasi elektron-elektron ikatan, akibatnya panjang gelombang pita yang

mengabsorpsi dapat dihubungkan dengan ikatan yang mungkin ada dalam suatu

molekul.

Ada tiga macam proses penyerapan energi ultraviolet dan sinar tampak yaitu :

(1) penyerapan oleh transisi elektron ikatan dan elektron anti ikatan, (2) penyerapan

oleh transisi elektron d dan f dari molekul kompleks; dan (3) penyerapan oleh

perpindahan muatan.

D. Aspek Kualitatif dan kuantitatif Spektrofotometri UV-Vis

Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan sekaligus dapat

digunakan untuk analisis kuantitatif.

1. Aspek Kualitatif

Data spectra UV-Vis secara tersendiri tidak dapat digunakan untuk identifikasi

kualitatif obat atau metabolitnya. Akan tetapi jika digabung dengan cara lain seperti

spektroskopi infra merah, resonansi magnet inti, dan spektroskopi massa, maka dapat

digunakan untuk maksud identifikasi/analisis kualitatif suatu senyawa tersebut. Data

yang diperoleh dari spektroskopi UV dan Vis adalah panjang gelombang maksimal,

intensitas, efek PH, dan pelarut, dan kesemuanya itu dapat diperbandingkan dengan

data yang sudah dipublikasikan (Published data). Dari spectra yan diperoleh dapat

dilihat, misalnya :

Serapan (absorbansi) berubah atau tidak karena perubahan pH. Jika berubah,

bagaimana perubahannya apakah batokromik ke hipokromik atau sebaliknya.

Obat – obat yang netral misalnya kefein, kloramfenikol, atau obat-obat yang

berisi ausokrom yang tidak terkonjugasi sepeti amfetamin, siklizin dan

pensiklidin.

2. Aspek Kuantitatif

Dalam aspek kuantitatif, suatu berkas radiasi dikenakan pada cuplikan (larutan

sampel) dan itensitas sinar radiasi yang diteruskan diukur besarnya. Radiasi yang

diserap oleh cuplikan ditentukan dengan membandingkan intensitas yang diteruskan

dengan intensitas sinar yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya.

Intensitas atau kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui

satu satuan luas penampang perdetik. Serapan dapat terjadi jika foton/radiasi yang

mengenai cupikan memiliki energy yang sama dengan energy yang dibutuhkan untuk

menyebabkan terjadi perubahan tenaga. Kekuatan radiasi juga mengalami penurunan

dengan adanya penhamburan dan pemantuan cahaya, akan tetapi penurunan karena

hal ini sangat kecil dibandingkan dengan proses penyerapan.

Perhatikan suatu larutan encer senyawa yang mampu menyerap sinar pada

panjang gelombang terpilih untuk suatu percobaan dengan menggunakan pelarut yang

tidak menyerap sinar pada panjang gelombang yang terpilih tersebut. Perlu dicatat

bahwa jika sinar monokromatik dilewatkan melalui suatu lapisan larutan dengan

ketebalan db, maka penurunan intensitas sinar (dl) karena melewati lapisan larutan

tersebut berbanding langsung dengan intensitas radiasi (I), konsentrasi spesies yang

menyerap (c) dan dengan ketebalan lapisan larutan (db), secara matematis,

pernyataan ini dapat dituliskan :

-dl = KIcdb

Persamaan di atas dapat disusun ulang dan diintegritas dengan batas Io (intensitas

sinar mula-mula) dan I ( intensitas sinar setelah melalui larutan dengan ketebalan b).

A = abc

Keterangan :

A = absorbansi

a = absorpsi

b = tebal kuvet (cm)

c = konsentrasi

Persamaan diatas dikenal juga sebagai hokum lambert-Beer. Kualitas

spektroskopi yan diukur biasanya adalah Transmitans (T) = I/Io, dan absorbansi (A);

yang mana

A= log 1/T.

Absorpsitivitas (a) merupakan suatu konstanta yang tidak tergantung pada

konsentrasi, tabel kuvet, dan intensitas radiasi yang mengenai larutan sampel.

Absorptivitas tergantung pada satuan a ditentukan oleh satuan-satuan b dan c. Jika

satuan c dalam molar (M) maka absorptivitas disebut dengan absorptivitas molar dan

disimbolkan dengan ε dengan satuan M-1cm-1 atau liter.mol.-1.cm-1. Jika c dinyatakan

dengan persen berat/volume (g/100 ml) maka absorptivitas dapat ditulis dengan E1 cm1 %

dan juga seringkali ditulis dengan A1cm1% .

Hubungan antara lain nilai E1 cm1 % dengan absorptivitas molar (ε) adalah sebagai

berikut :

Ε = E1 cm1 % X

BM10

Penamaan spektroskopi absorbs dapat membingungkan karena banyaknya istilah

sinonim. Istilah – istilah spektroskopik dan simbol-simbol diringkas dalam tabel.1.

Penting juga untuk memahami penamaan yang lebih digunakan, karena istilah ini

juga digunakan di beberapa literatur. Istilah-istilah yang lebih dulu digunakan ini juga

diringkas pada tabel 1.

Tabel. 1Penamaan spektroskopik

Istilah Simbol Istilah yang lebih dulu

digunakan

Transmittan T Transmisi

Persen transmitan %T Persen transmisi

Absorban A Ekstinsi, E, Densitas, D,

Densitas optik, OD,

Absorbansi

Absorptivitas a Koefisien ekstingsi, indeks

absorbansi, ekstingsi spesifik

E1 cm1 %

Absorptivitas ε Koefisien ekstingsi molar

Tebal kuvet B I,d

Konsentrasi C

Hukum lambert-beer menyatakan bahwa intensitas yang diteruskan oleh larutan

zat penyerap berbanding lurus dengan tebal dan konsentrasi larutan. Dalam hukum

Lambert-Beer tersebut ada beberapa pembatasan yaitu :

Sinar yang digunakan monokromatis

Penyerapan yang terjadi dalam suatu volume yang mempunyai penampang luas

yang sama

Senyawa yang menyerap dalam larutan tersebut tidak tergantung terhadap yang

lain dalam larutan tersebut.

Terjadi peristiwa fluoresensi atau fosforisensi

Indeks bias tidak tergantung pada konsenstrasi larutan.

Analsis kuantitatif dengan metode spektroskopi UV-Vis dapat digolonkan atas

tiga macam pelaksanaan pekerjaan, yaitu : (1). Analisis zat tunggal satu komponen;

(2) analisis kuantitatif campuran dua atau tiga macam zat atau analisis dua komponen

dan (3) analisis kuantitatif campuran tiga macam zat atau lebih (analisis multi

komponen)

a. Analisis Komponen Tunggal

Jika absorbansi suatu seri konsentrasi larutan diukur pada panjang gelombang, suhu,

kondisi pelarut yang sama, dan absorbansi masing-masing larutan diplotkan

terhadapn konsentrasinya maka suatu garis lurus akan teramati sesuai dengan

persamaan A = abc. Grafik ini disebut dengan plot hukum Lambert-Beer dan jika

garis yang dihasilkan merupakan suatu garis lurus maka dapat dikatakan bahwa

hukum lambeert-beer dipenuhi pada kisaran konsentrasi yang diamati.

Cara lain untuk menetapkan kadar sampel adalah dengan menggunakan

perbandingan absorbansi sampel dengan absorbansi baku, atau dengan menggunakan

persamaa regresi linier yang menyatakan hubungan antara konsentrasi baku dengan

absorbansinya. Persamaan kurva baku selanjutnya digunakan untuk menghitung

kadar dalam sampel.

b. Analisis 2 campuran secara bersama-sama

Bila diinginkan pengukuran 2 buah senyawa secara bersama-sama secara

spektrofotometri, maka dapat dilakukan pada 2 panjang gelombang yang mana

masing-masing komponen tidak saling mengganggu atau gangguan dari komponen

lain paling kecil. Dua buah kromofor yang berbeda akan mempunyai kekuatan

absorbansi cahaya yang berbeda pua pada satu daerah panjang gelombang.

Pengukuran dilakukan pada masing-masing larutan pada 2 panjang gelombang,

sehingga diperoleh dua persamaan hubungan antara absorbansi dengan konsentrasi

pada dua panjan gelombang, akibatnya konsentrasi masing-masing komponen dapat

dihitung.

E. Hal-hal yang harus diperhatikan dalam analisis spektrofotometri UV-Vis

Ada beberapa hal yang harus diperhatikan dalam analisis dengan spekrofotometri

UV-Vis terutama untuk senyawa yang semula tidak berwarna yang akan dianalisis

dengan spektrosfotometri visibel karena senyawa tersebut harus diubah terlebih

dahulu menjadi senyawa yang berwarna. Berikut adalah tahapan-tahapan yang harus

diperhatikan.

a. Pembentukan molekul yang dapat menyerap sinar UV-Vis

Hal ini perlu dilakukan jika senyawa yang dianalisis tidak menyerap pada daerah

tersebut. Cara yang digunakan adalah dengan merubah menjadi senyawa lain atau

direaksikan dengan pereaksi tertentu. Pereaksi yang digunakan harus memenuhi

beberapa persyaratan yaitu :

Reaksinya selektif dan sensitif

Reaksinya cepat, kuantitatif, dan reprodusibel

Hasil reaksi stabil dalam jangka waktu yang lama

Keselektifan dapat dinaikkan dengan mengatur pH, pemakaian maskin agent, atau

penggunaan teknik ekstraksi.

b. Waktu operasional

Cara ini biasa digunakan untuk pengukuran hasil reaksi atau pembentukan warna.

Tujuannya adalah untuk mengetahui waktu pengukuran stabil. Waktu operasional

ditentukan dengan mengukur hubungan antara waktu dengan absorbansi larutan.

Pada awal terjadi reaksi, absorbansi senyawa yang berwarna ini meningkat

sampai waktu tertentu hingga diperoleh abdorbansi stabil Semakin lama waktu

pengukuran, maka ada kemungkinan senyawa yang berwarna tersebut menjadi rusak

atau terurai sehingga intensitas warnanya turun akibatnya absorbansinya juga turun.

Karena alasan inilah, maka untuk pengukuran senyawa berwarna (hasil suatu reaksi

kimia) harus dilakukan pada saat waktu operasional.

c. Pemilihan panjang gelombang

Panjang gelombang yang digunakan untuk analisis kuantitatif adalah panjang

gelombang yang mempunyai absorbansi maksimal. Untuk memilih panjang

gelombang maksimal, dilakukan dengan membuat kurva hubungan antara absorbansi

dengan panjang gelombang dari suatu larutan baku pada konsentrasi tertentu.

Ada beberapa alasan mengapa harus menggunakan pada panjang gelombang

maksimal, yaitu :

Pada panjang gelombang maksimal, kepekaan juga maksimal karena pada

panjang gelombang maksimal tersebut, perubahan absorbansi untuk setiap satuan

konsentrasi adalah yang palin besar.

Disekitar panjang gelombang maksimal, bentuk kurva absorbansi datar dan pada

kondisi tersebut hukum Lambert-Beer akan terpenuhi.

Jika dilakukan pengukuran ulang maka kesalahan yang disebabkan oleh

pemasangan ulang panjang gelombang akan kecil sekali, ketika digunakan

panjang gelombang maksimal.

d. Pembuatan kurva baku

Dibuat seri larutan baku dari zat yang akan dianalisis dengan berbagai

konsenstrasi. Masing-masing absorbansi larutan dengan berbagai konsentrasi diukur,

kemudian dibuat kurva yang merupakan hubungan antara absorbansi (y) dengan

konsentrasi (X). Bila hukum Lambert-Beer terpenuhi, maka kurva baku berupa garis

lurus. Kemiringan (a). Kurva baku sebaiknya sering diperiksa ulang. Penyimpanan

dari garis lurus biasanya dapat disebabkan oleh kekuatan ion yan tinggi, perubahan

suhu, reaksi ikutan yan terjadi.

e. Pembacaan absorbansi sampel atau cuplikan

Absorbansi yang terbaca pada spektrofotometri hendaknya 0,2 sampai 0,8 atau

15% sampai 70% jika di baca sebaai transmitrans. Anjuran ini didasarkan anggapan

bahwa kesalahan dalam pembacaan T adalah 0,005 atau 0,5%.

F. Instrumentasi Spektroskopi UV-Vis

Spektrofotometri yang sesuai untuk pengukuran di daerah spektrum ultraviolet

dan sinar tampak terdiri atas suatu sistem optik dengan kemampuan menghasilkan

sinar monokromatis dalam jangkauan panjang gelombang 200-800 nm.

Suatu diagram sederhana spektrofotometri UV-Vis ditunjukkan oleh gambar 1.

Dengan komponen-komponennya meliputi sumber-sumber sinar, monokromator, dan

sistem optik.

i. Sumber-sumber lampu, lampu deuterium digunakan untuk daerah UV pada panjan

gelombang dari 190-350 nm, sementara lampu halogen, kuarsa atau lampu

tungsten digunakan untuk daerah visibel (pada panjang gelombang antara 350-900

nm)

ii. Monokromator, digunakan untuk mendispersikan sinar ke dalam komponen-

komponen panjang gelombangnya yang selanjutnya akan dipilih oleh celah(slit).

Monokromator berputar sedemikian rupa sehingga kisaran panjang gelombang

dilewatkan pada sampel sebagai scan instrumen melewati spektrum.

iii.Optik-optik; dapat didesain untuk memecah sumber sinar sehingga sumber sinar

melewati 2 kompartemen, dan sebagaimana dalam spektrofotometer berkas ganda,

suatu larutan blanko dapat digunakan dalam satu kompartemen untuk mengoreksi

pembacaan atau spektrum sampel. Yang paling sering digunakan sebagai blanko

dalam spektrofotometri adalah semua pelarut yang digunakan untuk melarutkan

sampel dan pereaksi