III. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil

Foto hasil pengamatan praktikum pewarnaan Alizarin Red

Foto A.1. Fetus ikan di dalam larutan NaCl fisiologis

Foto A.2. Fetus ikan setelah dimasukkan dalam larutan

alkohol 96%

Foto A.3. Fetus ikan setelah dimasukkan dalam akuades

Foto A.4. Fetus ikan setelah dimasukkan dalam larutan

KOH 1%

Foto A.5. Fetus ikan setelah dimasukkan dalam larutan

alizarin red

Foto A.6. Fetus ikan setelah dimasukkan dalam larutan

penjernih A

Tabel 1. Data Pengamatan Perbandingan Tulang yang Terkalsifikasi

(Rombongan V)

No Kelompok Tulang yang terwarnai

1 1

Dentary, para sphenoid, ceratobranchial, frontal bone, sirip caudal, rib, sirip pectoral (pectoral fin), otolith, proximal radial,

dorsal fin (terlepas), dan operculum

2 2Ikan terwarnai hanya pada dorsal fin pada saat diberi larutan

penjernih A. bagian selain tulang menjadi transparan

Foto A.7. Fetus ikan setelah dimasukkan dalam larutan

penjernih B

Foto A.8. Fetus ikan setelah dimasukkan dalam larutan

penjernih C

Gambar skematis tulang ikan nilem (Osteochilus hasselti)

3 3 Tidak ada tulang yang terwarnai

4 4

Rib, frontal bone, neural spine, dentary, parietal bone, caudal fin, caudal vertebrae, paras phenoid, sceiles, platoquadrate,

ceratobranchial, ceratohyal, otolith,dan opercle

5 5

Tulang sirip anal, tulang parasphenoid, ceratobranchial, tulang dentary

Tulang yang terlihat : caudal vertebrae, rib, neural spine, pectoral fin, dentary, paras phenoid, ceretobranchial, frontal

bone, parietal bone, scales,dorsal fin

6 6Tulang terwarnai : Frontal bone, scales, dorsal fin, anal fin, rib,

pectoral fin dan neural spin.

B. Pembahasan

Berdasarkan hasil pengamatan, bagian-bagian tulang yang sudah

mengalami kalsifikasi adalah Rib, frontal bone, neural spine, dentary, parietal

bone, caudal fin, caudal vertebrae, paras phenoid, sceiles, platoquadrate,

ceratobranchial, ceratohyal, otolith dan opercle. Hasil tulang ikan yang terwarnai

berbeda pada setiap kelompok, hal itu dikarenakan ukuran ikan yang tidak sama

dan umur ikan yang tidak sama. Pertumbuhan tulang ikan pada setiap individu

juga mempengaruhi terjadinya perbedaan hasil pada setiap kelompok. Menurut

karyadi, (2003) Perkembangan tulang terdiri dari bertambahnya ukuran (tumbuh),

kedewasaan dan umur. Perubahan dari perkembangan membranous dan

kartilaginous tulang keras disebut pendewasaan tulang. Terdapat 5 periode

pembentukan tulang yaitu: (1) periode embrionik: mandibula, maksila, humerus,

radius, ulna, femur, dan fibia (2) periode fetal: scapula, illium, fibula (3) tulang

muda: epiphisis pada anggota badan, karpal, tarsal, dan sesamoids (4) tulang

remaja: scapula, tulang rusuk, tulang pinggul/pinggang (5) tulang dewasa (Jessop,

1988).

Berdasarkan hasil tersebut di atas, dapat diketahui bahwa belum semua

tulang dapat terwarnai oleh larutan Alizarin Red, hal ini dikarenakan proses

kalsifikasi tulang terjadi pada waktunya masing-masing sehingga tidak

terkalsifikasi secara bersamaan. Begitu pula dengan tulang dasar cranial dan

seluruh tulang cranial menunjukan perubahan warna jika dilakukan pewarnaan

Alizarin Red. Perubahan kenampakan warnanya berbeda–beda dari merah sampai

merah tua tergantung pada pertumbuhannya (Anat, 1969). Perbedaan-perbedaan

dalam perkembangan terjadi karena beberapa dari tulang-tulang embrio

diendapkan dalam mesenkim yang belum terdiferensiasi. Sedangkan, pada bagian-

bagian lain dari tubuh terjadi pembentukan tulang yang didahului oleh sistem

tulang rawan penumpu yang sementara. Proses osifikasi kedua hal ini pada

dasarnya sama (Djuhanda, 1983).

Proses yang pertama kali dilakukan adalah melumpuhkan ikan nilem

dengan didinginkan pada air es. Kemudian ikan direndam dalam larutan NaCl

fisiologis, lalu alkohol 96% selama 12 jam, tubuhnya menjadi pucat, dan ikan

masih tenggelam. Selanjutnya ikan di rendam akuades selama 10 menit, ikan

terapung dan ikan masih pucat dan tidak terjadi perubahan warna ataupun

stukturnya. Selanjutnya ikan direndam dengan KOH 1% selama 1,5 jam, ikan

terapung, bagian dalam jaringan otot abdomen ikan menjadi transparan, isi

abdomen terlihat jelas, larutan KOH 1% berubah menjadi sangat keruh dan berbau

amis. Setelah itu ikan direndam dengan pewarna alizarin red selama 4 jam, ikan

terapung, rongga insang dan rongga mata mulai tampak terwarnai namun ikan

seperti merapuh,bagian dalam ikan menghilang hanya terlihat bagian tulang ikan

saja dan warna cairan menjadi coklat keruh. Selanjutnya ditambahkan penjernih

A, B, dan C, selama 1 jam, tulang ikan terlihat namun bagian ikan menjadi

semakin sedikit, bagian daging dan ekor mulai menghilang serta air menjadi lebih

jernih. Langkah terakhir merendam ikan dengan gliserin murni sebagai pengawet

dan langsung diamati hasilnya.

Praktikum ini menggunakan beberapa larutan yang masing-masing larutan

memiliki fungsinya masing-masing. Larutan alkohol 96% ini berfungsi sebagai

fiksatif. Akuades digunakan untuk membersihkan alkohol 96% dari hewan uji.

Larutan KOH 1% berfungsi menyebabkan otot menjadi transparan dan

skeletonnya terlihat jelas. Larutan pewarna alizarin sebagai pewarna skeleton

hingga terwarna merah tua atau ungu. Pada penanganan embrio muda dapat

ditinggalkan karena dapat mengakibatkan embrio menjadi terlalu lunak dan

mudah hancur. Larutan penjernih A, B dan C berfungsi untuk mengurangi

kelebihan pewarna yang masuk ke dalam jaringan otot sehingga otot menjadi

lebih transparan. Larutan glisern murni yang berfungsi sebagai pengawet

spesimen (Bevalender, 1988).

Hasil yang didapat pada praktikum pewarnaan alizarin red digunakan

untuk mendeteksi proses kalsifikasi pada tulang embrio, tulang yang terwarnai

seharusnya adalah tulang tengkorak (tulang kepala), tulang tengkorak merupakan

tulang yang dibentuk dengan cara osifikasi intra membran. Proses ini berasal dari

saat kolagen dimasuki zat ossin (protein tulang), kemudian fibroblast pembentuk

mengalami transformasi menjadi osteoblast dan osteoclast. Osteoblast pembentuk

tulang, osteoclast peresapzat yang akandirombak menjadi tulang (Kalthoff, 1996).

Menurut Puchtler (1969), Larutan pewarna alizarin red, menimbulkan

proses pewarnaan skeleton menjadi merah tua atau ungu yang menandakan bahwa

tulang yang telah terwarnai dengan warna tersebut telah terjadi adanya proses

kalsifikasi pada hewan uji yang digunakan tersebut. Faktor-faktor yang

mempengaruhi pewarnaan alizarin red, yaitu :

1. Makanan berpengaruh dalam proses kalsifikasi. Hal ini khususnya berlaku

terhadap cukupnya persediaan dan tersedianya mineral-mineral seperti

kalsium dan fosfor, yang merupakankomponen-komponenan organic utama

dari tulang

2. Hormon paratiroid, kalsitonin, dan vitamin D yang bertanggungjawab

terhadap tingkat kadar kalsium darah yang normal, yang akan mempengaruhi

proses kalsifikasi. Kalsitonin adalahh ormon yang berasal dari sel-sel

parafolikul rikelen jartiroid. Hormon tersebut mempunyai aksi dalam

menurunkan kadar kalsium darah dan menghambat presorpsi tulang sehingga

mempengaruhi proses kalsifikasi.

Makanan juga berpengaruh dalam proses kalsifikasi. Hal ini khususnya

berlaku terhadap cukupnya persediaan dan tersedianya mineral-mineral seperti

kalsium dan fosfor, yang merupakan komponen-komponen anorganik utama dari

tulang. Kekurangan kalsium atau fosfor dalam makanan mengakibatkan

pelanggaran dan kerapuhan tulang. Situasi dimana kalsium cukup tetapi vitamin D

kurang, terjadilah gangguan dalam penyerapan mineral dan mineralisasi pada

tulang yang sedang tumbuh (diantaranya tahap kalsifikasi) menjadi terhambat

(Yatim, 1983).

Proses pembentukan tulang tidak terlepas dari pembentukan matriks. Bone

Morphogenetic Proteins (BMP) diproduksi oleh sel osteogen dan sangat penting

digunakan dalam pembuatan tulang. Ion organik merupakan dasar dari

pembentukan dari hidroxypatite dan itu ditranspor oleh sel osteogenik yang

fungsinya sangat penting dalam kalsifikasi matriks tulang (Suzuki, 2006). Tubuh

vertebrata mengandung banyak Ca yang tidak termobilisasi pada skeleton. Peran

yang dijalankannya selain menyimpan Ca, tulang juga penting untuk menopang

tubuh vertebrata, memungkinkan adanya pergerakan melalui pergerakan otot dan

tendon (Venovelen et al., 2011).

Alizarin red adalah metode yang digunakan untuk mendeteksi proses

klasifikasi pada tulang ikan. Pewarna alizarin red dipilih karena merupakan salah

satu zat warna organik yang bersifat biodegradable. Alizarin red sering disebut

natrium alizarin sulfonat. Tulang yang diwarnai dengan alizarin red akan

berwarna merah tua apabila tulang tersebut telah mengalami kalsifikasi. Warna ini

muncul karena zat warna yang diberikan terikat oleh kalsium pada matriks tulang.

Pembentukan sistem rangka pada ikan dapat diikuti perkembangannya

menggunakan suatu metode pewarnaan tertentu diantaranya pewarnaan alizarin

red (Soeminto, 2002).

Tulang yang diwarnai dengan alizarin red akan berwarna merah tua

apabila tulang tersebut telah mengalami kalsifikasi. Warna ini muncul karena zat

warna yang diberikan terikat oleh kalsium pada matriks tulang (Sweetman, 2005).

Tulang maupun tulang rawan adalah bentuk jaringan penyambungan padat yang

terspesialisasi yang matriksnya lentur dan luwes. Kedua jaringan itu melakukan

fungsi kerangka yang bersifat struktural dan menanggung beban didalam tubuh.

Tulang secara arsitektur direncanakan sebagai jaringan yang ringantapi luar biasa

kuat untuk menanggung beban yang garis kekuatannya mengikuti garis tekanan

yang diakibatkan oleh dukungan beban. Tulang rawan sel sel batangnya

proliferasi dan membentuk kondrosit kondrosit yang cepat mengelilingi mereka

dengan matriks (Fernandes, 2012).

IV. KESIMPULAN

A. Kesimpulan

Berdasarkan pengamatan dan pembahasan di atas, maka dapat diambil

kesimpulan sebagai berikut:

1. Pewarna Alizarin Red digunakan untuk mendeteksi proses kalsifikasi pada

tulang.

2. Proses pembentukan tulang melalui dua cara yaitu osifikasi intra membran dan

osifikasi endokondral.

3. Bagian-bagian tulang yang terkalsifikasi adalah tengkorak, rongga insang,

tulang punggung, sirip-punggung, sirip ekor, rongga mata, tulang rusuk, dan sirip

perut.

B. Saran

Saran bagi praktikum pewarnaan alizarin red ini materi praktikum agar

dijelaskan lebih detail.

DAFTAR REFERENSI

Anat, J.1969. The in Vivo Staining of Bone with Alizarin Red. Hal 533-545.

Bevalender, Geneser. 1988. Dasar-dasar Histologi. Erlangga, Jakarta.

Djuhanda, T. 1983.EmbriologiPerbandingan. Armico. Bandung.

Fernandes, F. A. Costoula-sauza, C. Sarmeto, C.A.P, Goncalves, L. Favaron, P.O, Miglino, M.A. 2012. Placental Tissues as Sources of Stem Cells. Open Journal of Animal Sciences. 2(3): 166-173.

Geneser, Finn. 1993. Textbook of Histology. Munksgaard, Copenhagen.

Kalthoff, K. 1996. Analysis of Biological Development. McGraw-Hill Inc, NewYork.

Karyadi, Bhakti., dkk. 2003. Pemberian Rasio Kalsium dan Fosfor Terhadap Osifikasi Tulang Embrio Puyuh. Jurnal Penelitian UNIB. Vol. IX, No 2, Hal. 76-80. Bengkulu.

Puchtler, Holde., Susan N. Meloan and Mary S. Terry. 1969. On The History And Mechanism Of Alizarin And Alizarin Red S Stains For Calcium. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. Vol. 17(2).

Pattern, B.M. 1971. Early Embriology of The Chick. Mc. Graw-Hill Publishing.

Soeminto. 2002. Embriologi Vertabrata. Fakultas Biologi UNSOED, Purwokerto.

Suzuki, A. 2006. Enhanced Expression of the Inorganic Phosphate Transporter Pit-1 Is Involved in BMP-2–Induced Matrix Mineralization in Osteoblast-Like Cells.

Sweetman, Chantry, A D., Farrell, E.R., Munsterberg, A. and Smith, T. (2005). The conserved glutamine-rich region of chick csal1 and csal3 mediates

protein interactions with other spalt family members. Implications for townes-brocks syndrome. J Biol Chem 278: 6560-6.

Venovelen, J. Janssens, A. Huitema, L.F.A. Hammond, C.L. Metz, J.R. Flik, G. Voets, T. Merker, S.S. 2011. Trpv5/6 is vital for epithelial calcium uptake andbone formation. The FASEB Journal.Research Communication.Vol. 25 September 2011.

Yatim, W. 1983. Embryologi. Tarsito, Bandung.