BAB 3

KERANGKA KONSEPTUAL DAN HIPOTESIS PENELITIAN

1.1. Kerangka Konseptual

Pada metabolisme parasetamol, oksidasi parasetamol oleh enzim

sitokrom P450 akan menghasilkan N-Acetyl-p-benzoquinon-imina

(NAPQI) yang merupakan senyawa antara yang sangat reaktif. Pada

pemberian parasetamol dosis terapi NAPQI akan didetoksifikasi secara

efisien melalui konjugasi dengan glutation membentuk APAP-GSSG.

Pemberian parasetamol dosis tinggi, akan meningkatkan

pembentukan NAPQI. Terbentuknya NAPQI dalam jumlah yang besar

akan menyebabkan deplesi glutation hepatoselular secara relatif, karena

persediaan glutation tidak cukup untuk mengkonjugasi semua NAPQI

yang terbentuk. Sebagai akibatnya metabolit reaktif yang bebas akan

berikatan dan merusak molekul target, baik melalui ikatan kovalen

maupun melalui ikatan non kovalen. Keadaan ini akan menimbulkan

stress oksidatif (nekrosis sel hati) yang ditandai dengan peningkatan

aktivitas plasma enzim hepatik SGPT.

Pemberian ekstrak daun sambioto yang memiliki efek antioksidan

kuat diharapkan akan meningkatkan aktivitas antioksidan pada sel hati.

Peningkatan antioksidan tersebut akan meredam dampak negatif

senyawa oksigen reaktif pada hati, sehingga diharapkan kerusakan

jaringan hati akan berkurang. Penurunan kerusakan jaringan hati dapat

diamati sebagai penurunan aktivitas plasma enzim SGPT.

Gambar 3.1. Kerangka konseptual

3.2. Hipotesis Penelitian

Pemberian ekstrak daun sambiloto dapat menurunkan kadar SGPT

dalam darah tikus putih jantan (Rattus norvegicus) yang diinduksi

parasetamol dosis tinggi, tunggal.

Parasetamol

NAPQI

APAP-GSSG

Peningkatan H2O2

Stres Oksidatif

SGPT

Deplesi

GLutation

Seimbang

Sitokrom P-450

Ekstrak Daun Sambiloto

(Andrographis Paniculata)

Glutation

BAB 4

METODE PENELITIAN

4.1. Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental murni

laboratories yang dilakukan dalam laboratorium dimana baik sampel

(hewan coba) maupun perlakuan lebih terkendali, terukur dan pengaruh

perlakuan dapat lebih dipercaya. Rancangan penelitian ini tergolong jenis

penelitian Randomized, the post only control group design. Secara

skematis rancangan penelitian tersebut dapat digambarkan sebagai

berikut:

Gambar 4.1 Skema rancangan penelitian

Keterangan:

S : Sampel

R : Randomisasi

Aq : Aquades

Es : Ekstrak daun sambiloto

CMC-Na : Na-Carboxyl Methyl Cellullose 0,5%

APAP : Parasetamol

K- : Kelompok kontol negatif diberi aqua personde selama 10

hari dan CMC 0,5% pada hari ke-8

K+ : Kelompok kontrol positif diberi aqua personde selama 10

hari dan parasetamol 1200 mg/kg BB pada hari ke-8

P : Kelompok perlakuan diberikan ekstrak daun sambiloto 400

mg/kg BB/hari selama 10 hari dan pada hari ke 8 diberikan

parasetamol 1200 mg/kg BB

O- : Kadar SGPT kelompok kontrol negatif pada hari ke-10

O+ : Kadar SGPT kelompok kontrol positif pada hari ke-10

O : Kadar SGPT kelompok perlakuan P pada hari ke-10

4.2 Populasi, Sampel, Besar Sampel, dan Teknik Pengambilan

Sampel

4.2.1 Populasi

Hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus putih

jantan jenis Wistar (Rattus norvegicus) dewasa.

4.2.2 Sampel

Sampel yang digunakan yaitu tikus jantan strain Wistar berumur 2-3

bulan dengan berat badan awal antara 150-200 gram sebanyak 30 ekor

yang diperoleh dari Laboratorium Biokimia Jurusan Kedokteran Umum

UHT.

4.2.3 Besar sampel

Besar sampel yang digunakan untuk setiap kelompok perlakuan

berdasar rumus (Steel and Torrie, 1991):

n = (Zα/2 + Zβ)² σ²

δ

α = 0,05

Zα/2 = 1,96

1-β = 0,80

Zβ = 0,85

Pada penelitian eksperimental σ²/ δ = 1

Sekarang :

n = (1,96+0,85)² = 7,9 dibulatkan menjadi 8.

Besar sampel yang diperlukan untuk masing-masing kelompok

adalah menjadi 8 tikus.

4.2.4 Teknik pengambilan sampel

Pemilihan sampel penelitian untuk pengelompokan perlakuan

menggunakan metode Rancangan Acak Lengkap (RAL) atau Randomized

Completely Design (RCD) karena sampel hewan coba diambil secara

acak. Pada rancangan ini dimungkinkan setiap hewan coba berpeluang

sama untuk mendapat kesempatan sebagai sampel baik dalam kelompok

perlakuan maupun dalam kelompok kontrol.

Kriteria inklusi:

1. Jenis Wistar

2. Umur 2-3 bulan

3. Berat badan ± 150-200 gram

4. Jenis kelamin jantan

5. Sehat selama penelitian (keadaan tikus: gerakan lincah, mata

cerah, bulu halus, nafsu makan baik, anatomi tubuh sempurna,

berat badan tidak menurun lebih dari 10% selama masa

adaptasi)

Kriteria eksklusi:

1. Sakit dalam masa persiapan atau adaptasi (tubuh melemah,

kurang lincah, mata pudar, nafsu makan turun, bulu kasar dan

berdiri)

2. Mati dalam masa penelitian

4.3. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional Variabel

4.3.1. Variabel penelitian

Dalam penelitian ini ada 3 variabel, yaitu:

1. Variabel bebas

Ekstrak daun sambiloto

2. Variabel tergantung

SGPT

3. Variabel kendali

Hewan coba, strain, jenis kelamin, umur, berat badan

Keseragaman makanan dan air minum

Jenis kandang dan sanitasi kandang

Teknik pengambilan darah

Daun sambiloto yang digunakan, cara pembuatan

ekstrak daun sambiloto, waktu dan dosis pemberian

ekstrak daun sambiloto

4.3.2. Definisi operasional variabel

1. Ekstrak daun sambiloto adalah:

Ekstrak daun sambiloto yang diperoleh melalui proses ekstraksi

dengan ethanol 70 % di Laboratorium Biologi Universitas

Brawijaya Malang. Ekstrak daun sambiloto diberikan pada tikus

dengan dosis 400 mg/kg BB per hari (Ojha et all., 2009) selama

10 hari

2. Parasetamol adalah:

Paracetamol murni dalam CMC-Na 0,5% diberikan personde

setelah 2 jam pemberian ekstrak daun sambiloto atau aquades

pada hari ke-8 sebesar 1200 mg/kg BB per hari satu kali

pemberian

3. SGPT adalah:

Kadar enzim GPT dalam serum tikus putih yang diperiksa

dengan metode Begmeyer dengan satuan U/l

4. Jenis hewan coba yang digunakan adalah tikus putih jantan

(Rattus norvegicus) strain wistar, umur 2-3 bulan dengan berat

badan 150-200 gram dengan kondisi sehat yang ditandai

dengan bulu mengkilap, aktif bergerak dan tidak terdapat luka.

4.4. Bahan Penelitian

1. Hewan coba

Hewan coba adalah Rattus norvegicus strain Wistar, jenis

kelamin jantan, umur 2-3 bulan dengan berat badan 150-200

gram.

2. Bahan untuk perlakuan

a. Pembuatan ekstrak daun sambiloto

Daun sambiloto dikeringkan pada suhu 45oC kemudian

digiling sampai ukuran serbuk 60 mesh. Ambil 10 gram

serbuk, larutkan dalam ethanol 70% 100 mL (perbandingan

bahan dan pelarut 1:10) kemudian diaduk selama 6 jam dan

didiamkan semalam. Setelah itu dilakukan penyaringan

sehingga akan diperoleh filtrat/sari yang selanjutnya

diuapkan dengan menggunakan alat rotavapor (untuk

menghilangkan ethanol).

b. Parasetamol

Parasetamol pro analisa yang diperoleh dari kimia farma

dengan no lot 4792F

c. Larutan CMC-Na (Na-Carboxyl Methyl Cellulose) 0,5 %

diperoleh dari kimia farma dengan no lot 3572

3. Bahan untuk pemeriksaan SGPT

menggunakan kit dari diasys no lot 14267

4.5. Instrumen Penelitian

1. Alat untuk pemberian ekstrak daun sambiloto, aquades CMC

0,5 % dan parasetamol

Alat suntik (syringe) yang ujungnya dipasang suatu sonde

yang dapat dimasukan ke dalam mulut tikus wistar hingga

mencapai esophagus.

2. Alat untuk menimbang berat badan hewan coba adalah

Timbangan Torbal (Torsion balance).

3. Spuit 5 ml untuk mengambil darah

4. Alat untuk pemeriksaan SGPT

a. Tabung reaksi

b. Centrifuge

c. Spektrofotometer

d. Stop watch

e. Kuvet

4.6. Lokasi dan Waktu Penelitian

4.6.1 Lokasi penelitian

Lokasi penelitian ini adalah Laboratorium Biokimia Jurusan

Kedokteran Fakultas Kedokteran Umum Universitas Hang Tuah

Surabaya.

4.6.2 Waktu penelitian

Waktu penelitian dilaksanakan selama 6 bulan, dimulai dari

pengumpulan data untuk dasar teori hingga waktu selama masa

perlakuan.

4.7. Prosedur Pengambilan dan Pengumpulan Data

4.7.1. Aklimatisasi

Aklimatisasi hewan coba selama 7 hari terhadap air, makanan serta

hawa di dalam kondisi laboratorium.

4.7.2. Perlakuan hewan coba

1. Hewan coba dipilih secara random dan dibagi menjadi 3

kelompok

2. Kelompok kontrol negatif diberikan sonde aqua selama 10 hari

dan CMC Na 0,5 % pada hari ke-8, dua jam setelah

pemberian aqua terakhir

3. Kelompok kontrol kelompok kontrol positif diberikan sonde aqua

selama 10 hari dan parasetamol 1200 mg/kg BB dalam CMC

Na 0,5 % pada hari ke-8, dua jam setelah pemberian aqua

terakhir

4. Kelompok perlakuan diberikan sonde ekstrak daun sambiloto

dengan dosis 400mg/kg BB selama 10 hari dan parasetamol

1200 mg/kg BB dalam CMC Na 0,5 % pada hari ke-8, dua jam

setelah pemberian ekstrak daun sambiloto terakhir

5. Setelah 48 jam dari pemberian parasetamol, hewan coba

dilakukan pembiusan dengan ether di dalam stoples

pembiusan. Kurang lebih 2 menit tikus tidak bergerak yang

ditandai mata meredup dan badan tidak bergerak. Selanjutnya

kulit perut diinsisi dengan pisau bedah dan setelah terlihat

jatungnya maka dengan spuit 5 ml darah diambil dari jantung.

Setelah darah diambil, tikus dikorbankan dengan pembiusan

dalam sampai tikus mati.

6. Pemeriksaan SGPT

Selama pemeliharaan dan perlakuan, hewan coba ditempatkan

didalam kandang berukuran 40 x 30 cm, masing-masing kandang berisi 5

ekor. Kandang ditempatkan pada ruangan yang cukup udara dan cahaya

agar tidak lembab, jauh dari kebisingan dan tidak terpapar sinar matahari

secara langsung. Semua hewan coba mendapat pakan standard dan

minum air aqua.

4.8. Cara Analisis Data

Data yang diperoleh dalam penelitian ini diolah dengan melakukan

penghitungan rerata (mean) dan standar deviasi variable SGPT.

Selanjutnya dilakukan uji normalitas variabel tersebut dalam setiap

kelompok pada semua pengamatan, dengan menggunakan uji

Kolmogorov-Smirnov. Tingkat kemaknaan α yang dipakai adalah 5 %

(Steel & Torrie, 1991; Sudjana, 1984).

Untuk mengetahui apakah terdapat perbedaan kadar SGPT yang

bermakna antara kelompok tikus kontrol yang tidak mendapat

parasetamol dan ekstrak daun sambiloto (kelompok kontrol negatif),

kelompok tikus yang mendapat parasetamol dosis tinggi tanpa ekstrak

daun sambiloto (kelompok kontrol positif), dan kelompok tikus yang

mendapat parasetmol dosis tinggi dan ekstrak daun sambiloto 400 mg/kg

BB/hari (kelompok perlakuan), dilakukan analisis dengan menggunakan

uji-t. Tingkat kemaknaan α yang dipakai adalah 5 % (Steel & Torrie, 1991;

Sudjana, 1984).

4.9. Kerangka Operasional Penelitian

Gambar 4.2 Kerangka operasional penelitian

Tikus Wistar jantan, umur 2-3 bln

Randomisasi

Kelompok kontrol negatif

Sonde Aqua selama 10 hr

Kelompok kontrol positif

Sonde Aqua selama 10 hr

Kelompok perlakuan

Sonde Eks.DS 400mg/hr (10hr)

Sonde flavonoid ekst.DS selama 10hrSonde parasetamol (dalam CMC-Na) 1200

mg/KgBB, 2 jam setelah sonde terakhir pada hari ke-8

Sonde CMC Na 0,5%, 2 jam

setelah sonde aqua terakhir pada

hari ke-8

Anestesi

Pengambilan darah

Serum

Pemeriksaan SGPT

Setelah 48 jam