Sekuensing DNADari Wikipedia bahasa Indonesia, ensiklopedia bebasSekuensing DNAataupengurutan DNAadalah proses atau teknik penentuan urutanbasanukleotidapada suatu molekulDNA. Urutan tersebut dikenal sebagaisekuens DNA, yang merupakan informasi paling mendasar suatugenataugenomkarena mengandung instruksi yang dibutuhkan untuk pembentukan tubuhmakhluk hidup.[1]Sekuensing DNA dapat dimanfaatkan untuk menentukan identitas maupun fungsi gen atau fragmen DNA lainnya dengan cara membandingkan sekuens-nya dengan sekuens DNA lain yang sudah diketahui.[2]Teknik ini digunakan dalam riset dasarbiologimaupun berbagai bidang terapan sepertikedokteran,[3]bioteknologi,forensik,[4]danantropologi.[5]Teknik sekuensing DNA mulai dikembangkan pada tahun 1970-an dan telah menjadi hal rutin dalam penelitianbiologi molekularpada dekade berikutnya berkat dua metode yang dikembangkan secara independen namun hampir bersamaan oleh timWalter GilbertdiAmerika Serikatdan timFrederick SangerdiInggrissehingga kedua ilmuwan tersebut mendapatkanPenghargaan Nobel Kimiapada tahun1980.[6][7]Selanjutnya, metode Sanger menjadi lebih umum digunakan dan berhasil diautomatisasi pada pertengahan 1980-an. Sejak tahun 1995, berbagai proyekgenomyang bertujuan menentukan sekuens keseluruhan DNA pada banyakorganismetelah diselesaikan, termasukProyek Genom Manusia. Sekuensing DNA seluruh genom semakin terjangkau dan cepat dilakukan berkat pengembangan sejumlah teknik sekuensing generasi berikutnya mulai tahun 2000-an.Daftar isi[sembunyikan] 1Aplikasi 2Sejarah 3Metode 3.1Metode Maxam-Gilbert 3.2Metode Sanger 3.2.1Metode Sanger asli 3.2.2Sekuensingdye terminator 3.2.3Automatisasi dan penyiapan sampel 3.3Sekuensing generasi berikutnya 3.3.1Pyrosequencing 4Sekuensing DNA skala besar 5Lihat pula 6Referensi 7Pranala luar

[sunting]AplikasiSekuens DNA menyandikan informasi yang diperlukan bagimakhluk hidupuntuk melangsungkan hidup danberkembang biak. Dengan demikian, penentuan sekuens DNA berguna di dalam ilmu pengetahuan 'murni' mengenai mengapa dan bagaimana makhluk hidup dapat hidup, selain berguna dalam penerapan praktis. Karena DNA merupakan ciri kunci makhluk hidup, pengetahuan akan sekuens DNA dapat berguna dalam penelitianbiologimanapun. Sebagai contoh, dalamilmu pengobatansekuensing DNA dapat digunakan untuk mengidentifikasi, mendiagnosis, dan mengembangkan pengobatanpenyakit genetik. Demikian pula halnya, penelitian pada agen penyebab penyakit (patogen) dapat membuka jalan bagi pengobatanpenyakit menular.Bioteknologi, yang dapat pula memanfaatkan sekuensing DNA, merupakan bidang yang berkembang pesat dan berpotensi menghasilkan banyak barang dan jasa berguna. Pengetahuan akan sekuens DNA berguna untuk mengetahui sekuensasam aminoyang disandikan oleh gen.[8]Karena RNA dibentuk dengantranskripsidari DNA, informasi yang dikandung RNA juga terdapat di dalam DNA cetakannya sehingga sekuensing DNA cetakan tersebut sudah cukup untuk membaca informasi pada RNA. Namun demikian, sekuensingRNAdibutuhkan khususnya padaeukariota, karena molekul RNA eukariota tidak selalu sebanding dengan DNA cetakannya karena pemotonganintronsetelah prosestranskripsi.[sunting]SejarahPada mulanya, sekuensing DNA dilakukan dengan mentranskripsikannyake dalam bentukRNAterlebih dahulu karena metode sekuensing RNA telah ditemukan sebelumnya. Pada tahun 1965,Robert Holleydan timnya dariCornell UniversitydiNew York,Amerika Serikat, mempublikasikan sekuenstRNAalanindarikhamiryang terdiri atas 77nukleotida.[9]Sekuensing tRNA tersebut membutuhkan waktu 7 tahun dan hasilnya merupakan sekuens molekulasam nukleatyang pertama kali dipublikasikan.[10]Sekuens DNA yang pertama kali dipublikasikan adalah DNA sepanjang 12 nukleotida dari suatuvirus, yaitubakteriofaglambda, pada tahun 1971, yang ditentukan dengan cara serupa oleh Ray Wu dan Ellen Taylor, keduanya juga dari Cornell University.[11][12]Pada tahun 1975,Frederick Sangerdan Alan Coulson dari laboratorium biologi molekular Medical Research CouncilInggrisdiCambridgemempublikasikan metode sekuensing DNA secara langsung yang disebut teknik plusminus.[13]Dengan teknik tersebut, tim mereka berhasil melakukan sekuensing DNA sebagian besargenombakteriofag X174 sepanjang 5.375 nukleotida yang dipublikasikan pada Februari 1977.[14]Pada bulan yang sama, metode sekuensing DNA yang dicetuskan Allan Maxam danWalter GilbertdariHarvard UniversitydiCambridge, Massachusetts,Amerika Serikat, dipublikasikan.[15]Sejak pertengahan tahun 1980-an, metode Sanger menjadi lebih umum digunakan.[16]Pada tahun 1986, timLeroy HooddiCalifornia Institute of TechnologydanApplied Biosystemsberhasil membuat mesin sekuensing DNA automatis berdasarkan metode Sanger.[17][18][sunting]Metode[sunting]Metode Maxam-GilbertMetode ini mulanya cukup populer karena dapat langsung menggunakan DNA hasil pemurnian, sedangkan metode Sanger pada waktu itu memerlukankloninguntuk membentuk DNA untai tunggal. Seiring dengan dikembangkannya metode terminasi rantai, metode sekuensing Maxam-Gilbert menjadi tidak populer karena kerumitan teknisnya, digunakannya bahan kimia berbahaya, dan kesulitan dalamscale-up.[sunting]Metode Sanger

Gel sekuensing metode Sanger yang telah dilabel radioaktif.Dewasa ini, hampir semua usaha sekuensing DNA dilakukan dengan menggunakanmetode terminasi rantaiyang dikembangkan olehFrederick Sangerdan rekan-rekannya[1]. Teknik tersebut melibatkan terminasi atau penghentian reaksi sintesis DNAin vitroyang spesifik untuk sekuens tertentu menggunakan substrat nukleotida yang telah dimodifikasi.Pada metode terminasi rantai (metode Sanger), perpanjangan atau ekstensi rantai DNA dimulai pada situs spesifik pada DNA cetakan dengan menggunakan oligonukleotida pendek yang disebutprimeryang komplementer terhadap DNA pada daerah situs tersebut.Primertersebut diperpanjang menggunakanDNA polimerase, enzim yang mereplikasiDNA. Bersama denganprimerdan DNA polimerase, diikutsertakan pula empat jenis basadeoksinukleotida(satuan pembentuk DNA), juga nukleotida pemutus atau penghenti rantai (terminatorrantai) dalam konsentrasi rendah (biasanyadi-deoksinukleotida). Penggabungan nukleotida pemutus rantai tersebut secara terbatas kepada rantai DNA oleh polimerase DNA menghasilkan fragmen-fragmen DNA yang berhenti bertumbuh hanya pada posisi pada DNA tempat nukleotida tertentu tersebut tergabungkan. Fragmen-fragmen DNA tersebut lalu dipisahkan menurut ukurannya denganelektroforesis gel poliakrilamida, atau sekarang semakin lazim dengan elektroforesis menggunakan tabung gelas berjari-jari kecil (pipa kapiler) yang diisi dengan polimer kental.Seiring dengan perkembangannya, kini terdapat beberapa macam metode sekuensing terminasi rantai yang berbeda satu sama lain terutama dalam hal pendeteksian fragmen DNA hasil reaksi sekuensing.[sunting]Metode Sanger asliPada metode yang asli, urutan nukleotida DNA tertentu dapat disimpulkan dengan membuat secara paralel empat reaksi perpanjangan rantai menggunakan salah satu dari empat jenis basa pemutus rantai pada masing-masing reaksi. Fragmen-fragmen DNA yang kemudian terbentuk dideteksi dengan menandai (labelling)primeryang digunakan denganfosforradioaktifsebelum reaksi sekuensing dilangsungkan. Keempat hasil reaksi tersebut kemudian dielektroforesispada empat lajur yang saling bersebelahan pada gel poliakrilamida.Hasil pengembangan metode ini menggunakan empat macamprimeryang ditandai dengan pewarnaberpendar(fluorescent dye). Hal ini memiliki kelebihan karena tidak menggunakan bahanradioaktif; selain menambah keamanan dan kecepatan, keempat hasil reaksi dapat dicampur dan dielektroforesis pada satu lajur pada gel. Metode ini dikenal sebagai metodedye primer sequencing.[sunting]Sekuensingdye terminator

Contoh hasil bacaan suatu sekuensing metodedye terminator.Cara lain pelabelan primer adalah dengan melabel pemutus rantainya, lazim disebut metode sekuensingdye terminator. Keunggulan cara ini adalah bahwa seluruh proses sekuensing dapat dilakukan dalam satu reaksi, dibandingkan dengan empat reaksi terpisah yang diperlukan pada penggunaanprimerberlabel. Pada cara tersebut, masing-masing dideoksinukleotida pemutus rantai ditandai dengan pewarna fluoresens, yang berpendar padapanjang gelombangyang berbeda-beda. Cara ini lebih mudah dan lebih cepat dibandingkan penggunaanprimerberwarna, namun dapat menimbulkan ketidaksamaan tinggi kurva atau puncak (peak) yang disebabkan oleh ketidaksamaan penggabungan pemutus rantai berwarna berukuran besar pada pertumbuhan DNA (ketidaksamaan tersebut bergantung pada DNA cetakan). Masalah tersebut telah dapat dikurangi secara nyata dengan penggunaan macam-macam enzim dan pewarna baru yang meminimalkan perbedaan dalam penggabungan.Metode ini kini digunakan pada sebagian besar usaha reaksi sekuensing karena lebih sederhana dan lebih murah.Primer-primeryang digunakan tidak perlu dilabel secara terpisah (yang bisa jadi cukup mahal untukprimeryang dibuat untuk sekali pakai), walaupun hal tersebut tidak terlalu bermasalah dalam penggunaanuniversal primer.[sunting]Automatisasi dan penyiapan sampelMesin sekuensing DNA automatis modern mampu mengurutkan 384 sampel berlabel fluoresens sekaligus dalam sekalibatch(elektroforesis) yang dapat dilakukan sampai 24 kali sehari. Hal tersebut hanya mencakup proses pemisahan dan proses pembacaan kurva; reaksi sekuensing, pembersihan, dan pelarutan ulang dalamlarutan penyanggayang sesuai harus dilakukan secara terpisah.Untuk memperoleh hasil reaksi berlabel yang dapat dideteksi dari DNA cetakan, metode "sekuensing daur" (cycle sequencing) paling lazim dilakukan. Dalam metode ini dilakukan berturut-turut penempelanprimer(primer annealing), ekstensi oleh polimerase DNA, dan denaturasi (peleburan ataumelting) untai-untai DNA cetakan secara berulang-ulang (2540 putaran). Kelebihan utama sekuensing daur adalah lebih efisiennya penggunaan pereaksi sekuensing yang mahal (BigDye) dan mampunya mengurutkan templat dengan struktur sekunder tertentu sepertihairpin loopatau daerah kaya-GC. Setiap tahap pada sekuensing daur ditempuh dengan mengubah temperatur reaksi menggunakan mesin pendaur panas (thermal cycler)PCR. Cara tersebut didasarkan pada fakta bahwa dua untai DNA yang komplementer akan saling menempel (berhibridisasi) pada temperatur rendah dan berpisah (terdenaturasi) pada temperatur tinggi. Hal penting lain yang memungkinkan cara tersebut adalah penggunaan enzim DNA polimerase dari organisme termofilik (organisme yang hidup di lingkungan bertemperatur tinggi), yang tidak mudah terurai pada temperatur tinggi yang digunakan pada cara tersebut (>95C).[sunting]Sekuensing generasi berikutnya[sunting]PyrosequencingPyrosequencing adalah teknik pemetaanDNAyang berdasarkan deteksi terhadappirofosfat(PPi) yang dilepaskan selamasintesisDNA.[19]Teknik ini memanfaatkanreaksienzimatikyang dikatalisis olehATP sulfurilasedanluciferaseuntuk pirofosfat inorganik yang dilepaskan selama penambahannukleotida.[19] http://id.wikipedia.org/wiki/Southern_blot