DISAIN NESTED PRIMER GEN HEMOLISIN UNTUK

MENDETEKSI Vibrio harveyi PADA UDANG PENAEID

MELALUI PCR

WAWAN ABDULLAH SETIAWAN

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2014

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN

SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Disain Nested Primer

Gen Hemolisin untuk Mendeteksi Vibrio harveyi pada Udang Penaeid Melalui

PCR adalah benar karya saya bersama dengan komisi pembimbing dan belum

diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber

informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak

diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam

Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.

Bogor, Agustus 2014

Wawan Abdullah Setiawan

NRP P051100031

RINGKASAN

WAWAN ABDULLAH SETIAWAN. Disain Nested Primer Gen Hemolisin

untuk Mendeteksi Vibrio harveyi pada Udang Penaeid Melalui PCR. Dibimbing

oleh UTUT WIDYASTUTI dan MUNTI YUHANA.

Litopenaeus vannamei atau udang putih merupakan salah satu komoditas

unggulan dalam budidaya perikanan di Indonesia. Spesies penaeid ini memiliki

beberapa keunggulan dibanding spesies udang lainnya, antara lain

produktivitasnya yang tinggi dapat mencapai lebih dari 13.600 kg/ha, masa

panennya lebih cepat, serta lebih resisten terhadap penyakit. Meskipun lebih

resisten, penyakit bakterial vibrio berpendar yang disebabkan oleh Vibrio harveyi

masih menjadi kendala dalam usaha pembenihan udang putih di Indonesia.

Aplikasi teknik PCR (Polymerase Chain Reaction) memungkinkan untuk

melakukan deteksi dini suatu penyakit yang disebabkan oleh bakteri, termasuk

vibriosis pada udang. Nested PCR merupakan variasi dari reaksi PCR biasa. Pada

nested PCR dilakukan 2 kali reaksi PCR dimana hasil dari PCR pertama menjadi

DNA cetakan bagi PCR kedua. Keuntungan dari nested PCR adalah

meminimalkan kesalahan amplifikasi gen dengan menggunakan 2 pasang primer

yang sekaligus juga dapat meningkatkan sensitivitas PCR. Gen hemolisin

diketahui mempunyai spesifisitas dan sensitivitas yang lebih baik dibanding gen

toxR dan gen gyrB sebagai penanda molekuler dalam mendeteksi V. harveyi.

Penelitian ini bertujuan untuk mendisain primer nested PCR menggunakan gen

hemolisin untuk mendeteksi Vibrio harveyi pada udang penaeid.

Sekuen gen hemolisin dari sampel V. harveyi MR5339 dan V. harveyi 275

dideteksi menggunakan primer yang didisain dari sekuen gen lengkap hemolisin

V. harveyi strain VIB 391 (nomor akses: DQ640264) mulai dari urutan ke-133

sampai urutan ke-756. Primer nested PCR didesain dari sekuen gen hemolisin

isolat V. harveyi MR 5339 yang berhasil teramplifikasi oleh primer awal. PCR I

nested PCR didesain untuk mengamplifikasi urutan ke-52 sampai urutan ke-405

dan PCR II nested PCR didesain untuk mengamplifikasi urutan ke-204 sampai

urutan ke-405. Hasil uji spesifisitas menunjukkan bahwa primer nested PCR hasil

disain hanya mampu mengamplifikasi isolat-isolat V. harveyi. Hasil PCR bagi

isolat-isolat bakteri V. parahaemolyticus, V. campbelli, Salmonella sp.,

Edwardsiella tarda, Aeromonas hydrophila, dan Streptococcus iniae yang juga

diujikan diketahui tidak terdapat hasil amplifikasi. Berdasarkan uji sensitivitas

diketahui bahwa primer nested PCR hasil disain mampu menDisain Primer V.

harveyi sampai kepadatan 100

cfu/ml atau konsentrasi DNA sampai 101 fg/l.

Melalui uji surveillance diketahui bahwa deteksi terendah adalah pada sampel hari

ke-3 ekstrak DNA udang mati suspect V. harveyi MR 5339 infeksi awal sebanyak

101

cfu/ml.

Kata kunci: V. harveyi, L. vannamei, hemolisin, DNA, nested PCR.

SUMMARY

WAWAN ABDULLAH SETIAWAN. Nested Primer Design of Haemolysin

Gene to Detect Vibrio harveyi in Penaeid Shrimp By PCR. Under direction of

UTUT WIDYASTUTI and MUNTI YUHANA.

Litopenaeus vannamei or white shrimp is one of the most important

aquaculture commodity in Indonesia. This penaeid species have several

advantages compared to other shrimp species, such as higher productivity that can

reach more than 13,600 kg/ha, growth faster and at beginning of introduction it

was believed more resistant against diseases. However the later it was known that

luminous Vibrio disease still becomes problem in white shrimp hatchery in

Indonesia.

Application of PCR (Polymerase Chain Reaction) could allow early

detection of disease caused by bacteria, including Vibriosis in shrimp. Nested

PCR is a modification of the regular PCR reaction, which use two successive runs

of PCR. The first PCR fragment product is used as template for the second PCR.

The advantage of nested PCR is to minimize error by using 2 pairs of primers

which also means increasing the PCR sensitivity. Haemolysin gene was known

has better specificity and sensitivity than toxR gene and gyrB gene as molecular

marker to detect V. harveyi. The aim of this study was to design nested PCR

primers using haemolysin gene to detect V. harveyi in penaeid shrimp.

Haemolysin gene sequences from V. harveyi MR5339 and V. harveyi 275

samples was detected by primer pair that designed from complete sequence of V.

harveyi VIB391 haemolysin gene (accesion number: DQ640264) from 133 to 756

sequence. Nested PCR primers was designed from sequencing result of V. harveyi

MR5339 haemolysin gene which have been successfully amplified by the initial

primers. Primer pairs I of nested PCR was designed to amplified the DNA

fragment from positions 52 to 405. Primer pairs II of nested PCR was designed to

amplified the positions 204 to 405. Specificity test showed that nested PCR

primers just only amplified V. harveyi isolates. PCR results for isolates V.

parahaemolyticus, V. campbelli, Salmonella sp., Edwardsiella tarda, Aeromonas

hydrophila, dan Streptococcus iniae was known has no amplification. Based on

sensitivity test was known that nested PCR primers designed was able to detect V.

harveyi cells density of 100 cfu/ml or at concentration of 10

1 fg/l extracted DNA.

From surveillance test, it was observed that lowest concentration was detected on

dead shrimp DNA extract suspect V. harveyi MR 5339 initial infected 101 cfu/ml.

.

Keywords: V. harveyi, L. vannamei, haemolysin, DNA, nested PCR.

Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014

Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau

menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,

penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau

tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB

Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini

dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

DISAIN NESTED PRIMER GEN HEMOLISIN UNTUK

MENDETEKSI Vibrio harveyi PADA UDANG PENAEID

MELALUI PCR

WAWAN ABDULLAH SETIAWAN

Tesis

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Magister Sains pada

Program Studi Bioteknologi

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2014

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr Ir Iman Rusmana, MSi

Judul Tesis : Disain Nested Primer Gen Hemolisin Untuk Mendeteksi

Vibrio harveyi pada Udang Penaeid Melalui PCR

Nama : Wawan Abdullah Setiawan

NRP : P051100031

Disetujui oleh

Komisi Pembimbing

Dr Ir Utut Widyastuti, MSi Dr Munti Yuhana, SPi, MSi

Ketua Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi Dekan Sekolah Pascasarjana

Bioteknologi

Prof Dr Ir Suharsono, DEA Dr Ir Dahrul Syah, MSc Agr

Tanggal Ujian: 30 Mei 2014 Tanggal Lulus:

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia

dan rahmat-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang

dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Oktober 2011 sampai

bulan April 2013 ini ialah disain nested primer gen hemolisin untuk mendeteksi

Vibrio harveyi pada udang penaeid melalui PCR.

Penulis sangat menyadari bahwa proses penyelesaian penelitian dan

penulisan tesis ini tidak akan dapat berjalan dengan lancar tanpa dukungan banyak

pihak. Karena itu, pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih yang

tak terhingga kepada Ibu Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.S. dan Ibu Dr. Munti Yuhana,

S.Pi, M.Si. sebagai pembimbing atas ilmu, cara berfikir, dana dan fasilitas

penelitian kepada penulis. Terimakasih penulis haturkan juga atas waktu,

kesabaran, serta semangat, bimbingan dan semua masukan yang sangat berarti

mulai dari penyusunan proposal, pelaksanaan penelitian hingga penulisan tesis ini

yang insya Alloh akan penulis jadikan acuan dalam melangkah ke depan. Penulis

juga menyampaikan terima kasih kepada Bapak Dr. Ir. Iman Rusmana, M.S.

selaku penguji atas saran dan perbaikan untuk kesempurnaan tesis ini.

Terimakasih dan rasa hormat juga penulis sampaikan kepada Bapak Prof. Dr. Ir.

Suharsono, DEA sebagai ketua program studi Bioteknologi yang telah banyak

memberikan ilmu, saran, dan masukan sejak awal perkuliahan, penelitian, hingga

selesainya tesis ini.

Terima kasih penulis sampaikan pula kepada Kementerian Pendidikan dan

Kebudayaan Nasional, kepada Bapak Bambang Irawan, Bapak Sumardi, dan Ibu

C. N. Ekowati, serta Bapak/Ibu dosen Jurusan Biologi Universitas Lampung

sebagai orang tua penulis atas arahan, kesempatan, dan penyediaan beasiswa

sehingga penulis dapat melanjutkan pendidikan pada program Magister di Insitut

Pertanian Bogor. Semoga penulis dapat mengaplikasikan ilmu yang penulis

dapatkan bagi sebesar-besarnya kemajuan di tanah kelahiran penulis, tempat

orangtua penulis mencari penghidupan pada khususnya dan khasanah ilmu

pengetahuan pada umumnya.

Terimakasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya kepada Ibu Dr. Ince

Ayu Khairana Kadriah atas semua kebaikannya sehingga penulis dapat

mengerjakan penelitian ini. Terima kasih dan penghargaan juga penulis

sampaikan kepada Mbak Peppy Elvavina selaku teknisi di Laboratorium BIORIN

atas semua masukan, kemudahan, serta kebaikannya selama penelitian. Kepada

Pak Keresyanto, Pak Mulya, Pak Yanto, A Saeri, Mbak Nia, Mbak Ara, Pak

Asep, Mbak Pipit, Pak Ranta, dan Mas Rahman, penulis ucapkan banyak

terimakasih atas semua kebaikan dan kebersamaannya kepada penulis. Bapak/Ibu

dan rekan-rekan Lab. BIORIN: Pak Muzuni, Bu Ratna, Pak Radite, Bu Cinta, Pak

Ulung, Pak Asri, Pak Ilyas, Bu Ifa, Mbak Fajri, Mbak Nurul, Mbak Nuril, Ahya,

serta adik-adik tingkat PS Bioteknologi, penulis menyampaikan terima kasih

untuk semua kebersamaan yang telah memberi semangat, masukan, dan

pengalaman yang tak terlupakan. Terima kasih karena sudah berbagi kebahagiaan,

ilmu, dan menjadi pendukung di saat-saat tersulit dalam penyelesaian tesis ini.

Teman-teman PS BTK angkatan 2010 : Mbak Goli, Ratna, Seagames, Mbak

Atun, Stephani, Mas Asep, Rani, Ista, Mbak Cynthia, Ricky, Nanda, Evan, Mas

Aji, Mas Swastika, Mas Fajarudin, Delih, Mbak Anky, Mbak Neng, dan Mbak

Ihat, penulis menyampaikan terima kasih untuk semua kebersamaan yang telah

memberi semangat dan pengalaman yang tak terlupakan.

Terima kasih dan penghargaan yang tinggi penulis haturkan kepada istri

tersayang Ulia Fajriah, keempat orangtua, dan adik-adik tersayang untuk semua

cinta, kasih sayang, dukungan dan perhatiannya selama ini. Terimakasih juga

kepada semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu yang telah

membantu dan memberikan dukungan moril maupun materiil sehingga penulis

mampu menyelesaikan program S2 di Institut Pertanian Bogor.

Penulis menyadari bahwa tesis ini masih jauh dari sempurna karena

keterbatasan pengetahuan dan wawasan penulis dalam bidang ini. Oleh karena

itu, penulis mengharapkan saran, masukan, dan kritikan untuk perbaikan

penulisan selanjutnya. Bagaimanapun, penulis berharap semoga tesis ini

bermanfaat bagi kemajuan ilmu pengetahuan.

Bogor, Agustus 2014

Wawan Abdullah Setiawan

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR ISI ...................................................................................................... ix

DAFTAR GAMBAR ................................................................................ xi

DAFTAR TABEL ............................................................................................. xii

DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................... xiii

1 PENDAHULUAN ........................................................................................... 1

1.1 Latar Belakang ................................................................................... 1

1.2 Tujuan Penelitian ............................................................................... 2

2 TINJAUAN PUSTAKA ................................................................................... 3

2.1 Vibriosis pada Udang Putih ................................................................ 3

2.2 Nested PCR ........................................................................................ 5

2.3 Disain Primer ..................................................................................... 6

3 BAHAN DAN METODE 8

3.1 Bahan ................................................................................................. 8

3.2 Peremajaan Isolat Bakteri ................................................................... 8

3.3 Ekstraksi DNA Bakteri ....................................................................... 8

3.4 Analisa DNA Vibrio dengan Elektroforesis ........................................ 9

3.5 Uji Kemurnian dan Penghitungan Konsentrasi DNA ........................... 9

3.6 Desain Primer Awal Gen Hemolisin V. harveyi ................................ 10

3.7 PCR Menggunakan Primer Awal Gen Hemolisin V. harveyi ............ 10

3.8 Elusi Sekuen Gen Hemolisin V. harveyi dan Pengurutan Sekuen

Gen Hemolisin ................................................................................. 11

3.9 Disain Primer Nested PCR ............................................................... 11

3.10 Nested PCR ...................................................................................... 11

3.11 Uji Sensitivitas Primer Nested PCR .................................................. 12

3.12 Uji Spesifisitas Primer Nested PCR .................................................. 12

3.13 Surveillance Test .............................................................................. 12

4 HASIL DAN PEMBAHASAN 14

4.1 PCR Menggunakan Primer Awal Gen Hemolisin V. harveyi MR5339

dan Pengurutan Sekuen Gen Hemolisin .............................................. 14

4.2 Disain Primer Nested PCR ................................................................. 16

4.3 Uji Sensitivitas Primer Nested PCR .................................................... 16

4.4 Uji Spesifisitas Primer Nested PCR .................................................... 19

4.5 Surveillance Test ................................................................................ 22

5 SIMPULAN DAN SARAN 25

5.1 Simpulan ............................................................................................ 25

5.2 Saran .................................................................................................. 25

DAFTAR PUSTAKA 26

LAMPIRAN 29

RIWAYAT HIDUP 34

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1 Hasil uji aktivitas hemolisin isolat V. harveyi, V. parahaemolyticus,

Salmonella sp., Edwardsiella tarda, Aeromonas hydrophila, dan

Streptococcus iniae pada medium agar darah ................................................... 4

2 Visualisasi hasil PCR dengan primer awal ...................................................... 15

3 Uji sensitivitas primer nested PCR menggunakan DNA V. harveyi

MR5339 ......................................................................................................... 17

4 Uji sensitivitas primer nested PCR menggunakan DNA V. harveyi 275 .......... 18

5 Hasil uji spesifisitas pada kepadatan bakteri 105 cfu/ml s.d 10

0 cfu/ml ........... 19

6 Hasil uji spesifisitas pada ekstrak DNA konsentrasi 102 ng/l s.d 10

1 fg/l ..... 21

7 Visualisasi hasil PCR dengan nested PCR bagi surveillance test .................... 22

8 Visualisasi hasil PCR dengan nested PCR bagi surveillance test

sampel ke-7 ..................................................................................................... 23

DAFTAR TABEL

Halaman

1 Komposisi pereaksi PCR ................................................................................ 10

2 Program awal pada alat thermocycler ............................................................. 10

3 Hasil penghitungan uji kemurnian dan konsentrasi DNA isolat bakteri ........... 14

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1 Similaritas sekuen gen hemolisin V harveyi MR5339 ...................................... 29

2 Similaritas sekuen gen hemolisin V harveyi 275 .............................................. 31

3 Daerah amplifikasi primer nested PCR hasil disain ......................................... 33

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN

SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Disain Nested Primer

Gen Hemolisin untuk Mendeteksi Vibrio harveyi pada Udang Penaeid Melalui

PCR adalah benar karya saya bersama dengan komisi pembimbing dan belum

diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber

informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak

diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam

Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.

Bogor, Agustus 2014

Wawan Abdullah Setiawan

NRP P051100031

RINGKASAN

WAWAN ABDULLAH SETIAWAN. Disain Nested Primer Gen Hemolisin

untuk Mendeteksi Vibrio harveyi pada Udang Penaeid Melalui PCR. Dibimbing

oleh UTUT WIDYASTUTI dan MUNTI YUHANA.

Litopenaeus vannamei atau udang putih merupakan salah satu komoditas

unggulan dalam budidaya perikanan di Indonesia. Spesies penaeid ini memiliki

beberapa keunggulan dibanding spesies udang lainnya, antara lain

produktivitasnya yang tinggi dapat mencapai lebih dari 13.600 kg/ha, masa

panennya lebih cepat, serta lebih resisten terhadap penyakit. Meskipun lebih

resisten, penyakit bakterial vibrio berpendar yang disebabkan oleh Vibrio harveyi

masih menjadi kendala dalam usaha pembenihan udang putih di Indonesia.

Aplikasi teknik PCR (Polymerase Chain Reaction) memungkinkan untuk

melakukan deteksi dini suatu penyakit yang disebabkan oleh bakteri, termasuk

vibriosis pada udang. Nested PCR merupakan variasi dari reaksi PCR biasa. Pada

nested PCR dilakukan 2 kali reaksi PCR dimana hasil dari PCR pertama menjadi

DNA cetakan bagi PCR kedua. Keuntungan dari nested PCR adalah

meminimalkan kesalahan amplifikasi gen dengan menggunakan 2 pasang primer

yang sekaligus juga dapat meningkatkan sensitivitas PCR. Gen hemolisin

diketahui mempunyai spesifisitas dan sensitivitas yang lebih baik dibanding gen

toxR dan gen gyrB sebagai penanda molekuler dalam mendeteksi V. harveyi.

Penelitian ini bertujuan untuk mendisain primer nested PCR menggunakan gen

hemolisin untuk mendeteksi Vibrio harveyi pada udang penaeid.

Sekuen gen hemolisin dari sampel V. harveyi MR5339 dan V. harveyi 275

dideteksi menggunakan primer yang didisain dari sekuen gen lengkap hemolisin

V. harveyi strain VIB 391 (nomor akses: DQ640264) mulai dari urutan ke-133

sampai urutan ke-756. Primer nested PCR didesain dari sekuen gen hemolisin

isolat V. harveyi MR 5339 yang berhasil teramplifikasi oleh primer awal. PCR I

nested PCR didesain untuk mengamplifikasi urutan ke-52 sampai urutan ke-405

dan PCR II nested PCR didesain untuk mengamplifikasi urutan ke-204 sampai

urutan ke-405. Hasil uji spesifisitas menunjukkan bahwa primer nested PCR hasil

disain hanya mampu mengamplifikasi isolat-isolat V. harveyi. Hasil PCR bagi

isolat-isolat bakteri V. parahaemolyticus, V. campbelli, Salmonella sp.,

Edwardsiella tarda, Aeromonas hydrophila, dan Streptococcus iniae yang juga

diujikan diketahui tidak terdapat hasil amplifikasi. Berdasarkan uji sensitivitas

diketahui bahwa primer nested PCR hasil disain mampu menDisain Primer V.

harveyi sampai kepadatan 100

cfu/ml atau konsentrasi DNA sampai 101 fg/l.

Melalui uji surveillance diketahui bahwa deteksi terendah adalah pada sampel hari

ke-3 ekstrak DNA udang mati suspect V. harveyi MR 5339 infeksi awal sebanyak

101

cfu/ml.

Kata kunci: V. harveyi, L. vannamei, hemolisin, DNA, nested PCR.

SUMMARY

WAWAN ABDULLAH SETIAWAN. Nested Primer Design of Haemolysin

Gene to Detect Vibrio harveyi in Penaeid Shrimp By PCR. Under direction of

UTUT WIDYASTUTI and MUNTI YUHANA.

Litopenaeus vannamei or white shrimp is one of the most important

aquaculture commodity in Indonesia. This penaeid species have several

advantages compared to other shrimp species, such as higher productivity that can

reach more than 13,600 kg/ha, growth faster and at beginning of introduction it

was believed more resistant against diseases. However the later it was known that

luminous Vibrio disease still becomes problem in white shrimp hatchery in

Indonesia.

Application of PCR (Polymerase Chain Reaction) could allow early

detection of disease caused by bacteria, including Vibriosis in shrimp. Nested

PCR is a modification of the regular PCR reaction, which use two successive runs

of PCR. The first PCR fragment product is used as template for the second PCR.

The advantage of nested PCR is to minimize error by using 2 pairs of primers

which also means increasing the PCR sensitivity. Haemolysin gene was known

has better specificity and sensitivity than toxR gene and gyrB gene as molecular

marker to detect V. harveyi. The aim of this study was to design nested PCR

primers using haemolysin gene to detect V. harveyi in penaeid shrimp.

Haemolysin gene sequences from V. harveyi MR5339 and V. harveyi 275

samples was detected by primer pair that designed from complete sequence of V.

harveyi VIB391 haemolysin gene (accesion number: DQ640264) from 133 to 756

sequence. Nested PCR primers was designed from sequencing result of V. harveyi

MR5339 haemolysin gene which have been successfully amplified by the initial

primers. Primer pairs I of nested PCR was designed to amplified the DNA

fragment from positions 52 to 405. Primer pairs II of nested PCR was designed to

amplified the positions 204 to 405. Specificity test showed that nested PCR

primers just only amplified V. harveyi isolates. PCR results for isolates V.

parahaemolyticus, V. campbelli, Salmonella sp., Edwardsiella tarda, Aeromonas

hydrophila, dan Streptococcus iniae was known has no amplification. Based on

sensitivity test was known that nested PCR primers designed was able to detect V.

harveyi cells density of 100 cfu/ml or at concentration of 10

1 fg/l extracted DNA.

From surveillance test, it was observed that lowest concentration was detected on

dead shrimp DNA extract suspect V. harveyi MR 5339 initial infected 101 cfu/ml.

.

Keywords: V. harveyi, L. vannamei, haemolysin, DNA, nested PCR.

Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014

Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau

menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,

penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau

tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB

Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini

dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

DISAIN NESTED PRIMER GEN HEMOLISIN UNTUK

MENDETEKSI Vibrio harveyi PADA UDANG PENAEID

MELALUI PCR

WAWAN ABDULLAH SETIAWAN

Tesis

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Magister Sains pada

Program Studi Bioteknologi

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2014

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr Ir Iman Rusmana, MSi

Judul Tesis : Disain Nested Primer Gen Hemolisin Untuk Mendeteksi

Vibrio harveyi pada Udang Penaeid Melalui PCR

Nama : Wawan Abdullah Setiawan

NRP : P051100031

Disetujui oleh

Komisi Pembimbing

Dr Ir Utut Widyastuti, MSi Dr Munti Yuhana, SPi, MSi

Ketua Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi Dekan Sekolah Pascasarjana

Bioteknologi

Prof Dr Ir Suharsono, DEA Dr Ir Dahrul Syah, MSc Agr

Tanggal Ujian: 30 Mei 2014 Tanggal Lulus:

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia

dan rahmat-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang

dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Oktober 2011 sampai

bulan April 2013 ini ialah disain nested primer gen hemolisin untuk mendeteksi

Vibrio harveyi pada udang penaeid melalui PCR.

Penulis sangat menyadari bahwa proses penyelesaian penelitian dan

penulisan tesis ini tidak akan dapat berjalan dengan lancar tanpa dukungan banyak

pihak. Karena itu, pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih yang

tak terhingga kepada Ibu Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.S. dan Ibu Dr. Munti Yuhana,

S.Pi, M.Si. sebagai pembimbing atas ilmu, cara berfikir, dana dan fasilitas

penelitian kepada penulis. Terimakasih penulis haturkan juga atas waktu,

kesabaran, serta semangat, bimbingan dan semua masukan yang sangat berarti

mulai dari penyusunan proposal, pelaksanaan penelitian hingga penulisan tesis ini

yang insya Alloh akan penulis jadikan acuan dalam melangkah ke depan. Penulis

juga menyampaikan terima kasih kepada Bapak Dr. Ir. Iman Rusmana, M.S.

selaku penguji atas saran dan perbaikan untuk kesempurnaan tesis ini.

Terimakasih dan rasa hormat juga penulis sampaikan kepada Bapak Prof. Dr. Ir.

Suharsono, DEA sebagai ketua program studi Bioteknologi yang telah banyak

memberikan ilmu, saran, dan masukan sejak awal perkuliahan, penelitian, hingga

selesainya tesis ini.

Terima kasih penulis sampaikan pula kepada Kementerian Pendidikan dan

Kebudayaan Nasional, kepada Bapak Bambang Irawan, Bapak Sumardi, dan Ibu

C. N. Ekowati, serta Bapak/Ibu dosen Jurusan Biologi Universitas Lampung

sebagai orang tua penulis atas arahan, kesempatan, dan penyediaan beasiswa

sehingga penulis dapat melanjutkan pendidikan pada program Magister di Insitut

Pertanian Bogor. Semoga penulis dapat mengaplikasikan ilmu yang penulis

dapatkan bagi sebesar-besarnya kemajuan di tanah kelahiran penulis, tempat

orangtua penulis mencari penghidupan pada khususnya dan khasanah ilmu

pengetahuan pada umumnya.

Terimakasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya kepada Ibu Dr. Ince

Ayu Khairana Kadriah atas semua kebaikannya sehingga penulis dapat

mengerjakan penelitian ini. Terima kasih dan penghargaan juga penulis

sampaikan kepada Mbak Peppy Elvavina selaku teknisi di Laboratorium BIORIN

atas semua masukan, kemudahan, serta kebaikannya selama penelitian. Kepada

Pak Keresyanto, Pak Mulya, Pak Yanto, A Saeri, Mbak Nia, Mbak Ara, Pak

Asep, Mbak Pipit, Pak Ranta, dan Mas Rahman, penulis ucapkan banyak

terimakasih atas semua kebaikan dan kebersamaannya kepada penulis. Bapak/Ibu

dan rekan-rekan Lab. BIORIN: Pak Muzuni, Bu Ratna, Pak Radite, Bu Cinta, Pak

Ulung, Pak Asri, Pak Ilyas, Bu Ifa, Mbak Fajri, Mbak Nurul, Mbak Nuril, Ahya,

serta adik-adik tingkat PS Bioteknologi, penulis menyampaikan terima kasih

untuk semua kebersamaan yang telah memberi semangat, masukan, dan

pengalaman yang tak terlupakan. Terima kasih karena sudah berbagi kebahagiaan,

ilmu, dan menjadi pendukung di saat-saat tersulit dalam penyelesaian tesis ini.

Teman-teman PS BTK angkatan 2010 : Mbak Goli, Ratna, Seagames, Mbak

Atun, Stephani, Mas Asep, Rani, Ista, Mbak Cynthia, Ricky, Nanda, Evan, Mas

Aji, Mas Swastika, Mas Fajarudin, Delih, Mbak Anky, Mbak Neng, dan Mbak

Ihat, penulis menyampaikan terima kasih untuk semua kebersamaan yang telah

memberi semangat dan pengalaman yang tak terlupakan.

Terima kasih dan penghargaan yang tinggi penulis haturkan kepada istri

tersayang Ulia Fajriah, keempat orangtua, dan adik-adik tersayang untuk semua

cinta, kasih sayang, dukungan dan perhatiannya selama ini. Terimakasih juga

kepada semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu yang telah

membantu dan memberikan dukungan moril maupun materiil sehingga penulis

mampu menyelesaikan program S2 di Institut Pertanian Bogor.

Penulis menyadari bahwa tesis ini masih jauh dari sempurna karena

keterbatasan pengetahuan dan wawasan penulis dalam bidang ini. Oleh karena

itu, penulis mengharapkan saran, masukan, dan kritikan untuk perbaikan

penulisan selanjutnya. Bagaimanapun, penulis berharap semoga tesis ini

bermanfaat bagi kemajuan ilmu pengetahuan.

Bogor, Agustus 2014

Wawan Abdullah Setiawan

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR ISI ...................................................................................................... ix

DAFTAR GAMBAR ................................................................................ xi

DAFTAR TABEL ............................................................................................. xii

DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................... xiii

1 PENDAHULUAN ........................................................................................... 1

1.1 Latar Belakang ................................................................................... 1

1.2 Tujuan Penelitian ............................................................................... 2

2 TINJAUAN PUSTAKA ................................................................................... 3

2.1 Vibriosis pada Udang Putih ................................................................ 3

2.2 Nested PCR ........................................................................................ 5

2.3 Disain Primer ..................................................................................... 6

3 BAHAN DAN METODE 8

3.1 Bahan ................................................................................................. 8

3.2 Peremajaan Isolat Bakteri ................................................................... 8

3.3 Ekstraksi DNA Bakteri ....................................................................... 8

3.4 Analisa DNA Vibrio dengan Elektroforesis ........................................ 9

3.5 Uji Kemurnian dan Penghitungan Konsentrasi DNA ........................... 9

3.6 Desain Primer Awal Gen Hemolisin V. harveyi ................................ 10

3.7 PCR Menggunakan Primer Awal Gen Hemolisin V. harveyi ............ 10

3.8 Elusi Sekuen Gen Hemolisin V. harveyi dan Pengurutan Sekuen

Gen Hemolisin ................................................................................. 11

3.9 Disain Primer Nested PCR ............................................................... 11

3.10 Nested PCR ...................................................................................... 11

3.11 Uji Sensitivitas Primer Nested PCR .................................................. 12

3.12 Uji Spesifisitas Primer Nested PCR .................................................. 12

3.13 Surveillance Test .............................................................................. 12

4 HASIL DAN PEMBAHASAN 14

4.1 PCR Menggunakan Primer Awal Gen Hemolisin V. harveyi MR5339

dan Pengurutan Sekuen Gen Hemolisin .............................................. 14

4.2 Disain Primer Nested PCR ................................................................. 16

4.3 Uji Sensitivitas Primer Nested PCR .................................................... 16

4.4 Uji Spesifisitas Primer Nested PCR .................................................... 19

4.5 Surveillance Test ................................................................................ 22

5 SIMPULAN DAN SARAN 25

5.1 Simpulan ............................................................................................ 25

5.2 Saran .................................................................................................. 25

DAFTAR PUSTAKA 26

LAMPIRAN 29

RIWAYAT HIDUP 34

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1 Hasil uji aktivitas hemolisin isolat V. harveyi, V. parahaemolyticus,

Salmonella sp., Edwardsiella tarda, Aeromonas hydrophila, dan

Streptococcus iniae pada medium agar darah ................................................... 4

2 Visualisasi hasil PCR dengan primer awal ...................................................... 15

3 Uji sensitivitas primer nested PCR menggunakan DNA V. harveyi

MR5339 ......................................................................................................... 17

4 Uji sensitivitas primer nested PCR menggunakan DNA V. harveyi 275 .......... 18

5 Hasil uji spesifisitas pada kepadatan bakteri 105 cfu/ml s.d 10

0 cfu/ml ........... 19

6 Hasil uji spesifisitas pada ekstrak DNA konsentrasi 102 ng/l s.d 10

1 fg/l ..... 21

7 Visualisasi hasil PCR dengan nested PCR bagi surveillance test .................... 22

8 Visualisasi hasil PCR dengan nested PCR bagi surveillance test

sampel ke-7 ..................................................................................................... 23

DAFTAR TABEL

Halaman

1 Komposisi pereaksi PCR ................................................................................ 10

2 Program awal pada alat thermocycler ............................................................. 10

3 Hasil penghitungan uji kemurnian dan konsentrasi DNA isolat bakteri ........... 14

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1 Similaritas sekuen gen hemolisin V harveyi MR5339 ...................................... 29

2 Similaritas sekuen gen hemolisin V harveyi 275 .............................................. 31

3 Daerah amplifikasi primer nested PCR hasil disain ......................................... 33

1

1 PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Litopenaeus vannamei atau udang putih merupakan salah satu komoditas

unggulan dalam budidaya perikanan di Indonesia dimana produksinya pada tahun

2014 ditargetkan sebesar 511 ribu ton (KKP 2010). Spesies ini memiliki beberapa

keunggulan dibanding spesies udang lainnya, antara lain produktivitasnya yang

tinggi dapat mencapai lebih dari 13.600 kg/ha, masa panennya lebih cepat, serta

lebih resisten terhadap penyakit (Boyd dan Clay 2002). Meskipun lebih resisten,

penyakit bakterial Vibrio berpendar masih menjadi kendala dalam usaha

pembenihan udang putih di Indonesia (Felix et al. 2011). Spesies bakteri Vibrio

yang sering menyebabkan kematian massal terutama pada larva udang di

Indonesia adalah Vibrio harveyi (Teo et al. 2000). Serangan bakteri Vibrio yang

mengakibatkan kematian udang dalam waktu yang cepat dan dalam jumlah yang

besar. Bakteri ini merupakan jenis patogen yang menginfeksi dan menyebabkan

penyakit pada saat kondisi udang lemah dan faktor lingkungan yang ekstrim

(Austin dan Zhang 2006).

Lightner (1996) menyatakan bahwa pemeriksaan Vibriosis pada udang saat

ini masih dilakukan secara konvensional yaitu dengan melihat gejala klinis pada

tubuh udang, mengisolasi bakteri penyebab penyakit, melakukan uji fisiologi dan

biokimia, yang kesemuanya membutuhkan waktu hingga beberapa hari. Jika hasil

pemeriksaan tersebut sudah positif menunjukkan Vibriosis, inipun sudah

terlambat karena biasanya populasi Vibrio sudah dalam kepadatan yang tinggi,

lebih dari 109 cfu/ml sehingga lebih sukar dikendalikan.

Aplikasi teknik PCR (Polymerase Chain Reaction) memungkinkan untuk

melakukan deteksi dini suatu penyakit yang disebabkan oleh bakteri, termasuk

Vibriosis pada udang. PCR merupakan teknik yang digunakan untuk

mengamplifikasi sekuen asam nukleat menggunakan polimerisasi berulang dari

sekuen DNA (Kolmodin dan Birch. 2002). Nested PCR merupakan variasi dari

reaksi PCR biasa. Pada nested PCR, dilakukan 2 kali reaksi PCR dimana hasil

dari PCR pertama menjadi DNA cetakan bagi PCR kedua. Keuntungan dari

nested PCR adalah meminimalkan kesalahan amplifikasi gen dengan

menggunakan 2 pasang primer yang sekaligus juga dapat meningkatkan

sensitivitas PCR (Siebert et al. 1995).

Hemolisin merupakan eksotoksin yang diproduksi oleh bakteri Vibrio

berpendar yang menyerang membran sel darah inang dan menyebabkan sel darah

pecah (Zhang dan Austin 2005). Pada sebagian besar kasus, bukti epidemiologi

dan eksperimental menunjukkan bahwa hemolisin terlibat dalam patogenesis

penyakit Vibriosis (Shinoda 1999). Hemolisin disandikan oleh gen hemolisin

dimana urutan gennya telah banyak diketahui dan dapat diakses di GeneBank.

Kadriah et al. (2013) menjelaskan bahwa gen hemolisin mempunyai spesifisitas

dan sensitivitas yang lebih baik dibanding gen toxR dan gen gyrB sebagai penanda

molekuler dalam mendeteksi V. harveyi. Primer yang didisain dari penelitian

tersebut menunjukkan sensitivitas untuk mendeteksi V. harveyi pada kepadatan

100 cfu/ml dan konsentrasi DNA sebanyak 10

1 pg.

2

Sambrook dan Russel (2001) menerangkan bahwa teknik PCR

memungkinkan untuk mengamplifikasi 1 kopi cetakan DNA. Oleh karena itu,

dengan menggunakan teknik nested PCR diharapkan dapat ditemukan primer

nested PCR yang lebih spesifik dan sensitif bagi gen penyandi hemolisin V.

harveyi sehingga keberadaan bakteri Vibrio berpendar patogenik strain lokal pada

budidaya udang putih dapat dideteksi lebih dini.

1.2 Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk mendisain nested primer gen hemolisin untuk

mendeteksi bakteri V. harveyi patogenik pada udang penaeid melalui PCR.

3

2 TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Vibriosis pada Udang Putih

Udang putih dengan nama ilmiah Litopennaeus vannamei merupakan salah

satu komoditas unggulan dalam budidaya perikanan di Indonesia. Selama periode

tahun 2003 s.d 2007 ekspor udang cenderung meningkat, yaitu dari 137.636 ton

menjadi 160.797 ton (Poernomo 2008). Produksi udang nasional mengalami

kenaikan sebesar 2,6% dari 338.060 ton tahun 2009 menjadi 352.600 ton pada

tahun 2010. Pemerintah melalui Kementrian Kelautan dan Perikanan menargetkan

produksi udang putih pada tahun 2014 sebesar 511 ribu ton (KKP 2010).

Udang putih memiliki beberapa keunggulan dibanding beberapa spesies

udang lainnya, diantaranya masa panennya yang lebih cepat, produktifitasnya

yang tinggi yang dapat mencapai lebih dari 13.600 kg/ha, dan lebih resisten

terhadap penyakit (Boyd dan Clay 2002). Walaupun udang putih lebih resisten

terhadap penyakit, penyakit bakterial Vibrio berpendar masih menjadi kendala

dalam usaha pembenihan udang putih di Indonesia (Felix et al. 2011).

Penyakit berpendar pada larva udang merupakan penyakit yang berbahaya

karena dapat menyebabkan kematian massal. Bakteri Vibrio berpendar sering

dilaporkan sebagai penyebab kematian massal pada berbagai ikan laut dan udang

di berbagai belahan dunia (Austin dan Zhang 2006). Bakteri Vibrio berpendar

juga dilaporkan sebagai agen penyebab utama penyakit Vibriosis pada udang

budidaya di wilayah Asia Tenggara yang menyebabkan kerugian yang besar

(Lavilla-Pitogo et al. 1998; Liu et al. 1996). Vibriosis telah menyebabkan

mortalitas pada berbagai stadia larva, pasca larva, juvenil, dan dewasa (Lightner

1996). Spesies bakteri Vibrio yang sering menyebabkan kematian massal terutama

pada larva udang di Indonesia adalah Vibrio harveyi (Teo et al. 2000).

Pada sebagian besar kasus, bukti epidemiologi dan eksperimental

menunjukkan bahwa hemolisin terlibat dalam patogenesis penyakit Vibriosis

(Shinoda 1999). Hemolisin merupakan enzim yang bertanggung jawab terhadap

kerusakan membran sel darah (hemolisis) dan dilaporkan bahwa gen hemolisin

terdapat pada beberapa genus Vibrio termasuk V. harveyi (Zhang dan Austin

2005). Kadriah (2013) menerangkan bahwa selain V. harveyi, bakteri V.

parahaemolyticus, Salmonella sp., Edwardsiella tarda, Aeromonas hydrophila,

dan Streptococcus iniae diketahui mempunyai aktivitas hemolisin setelah

ditumbuhkan di medium agar darah. Hasil uji aktivitas hemolisin disajikan pada

gambar 1.

Lebih lanjut menurut Zhang dan Austin (2005), sekuen gen hemolisin

bervariasi pada spesies bakteri yang berbeda sehingga gen ini dapat digunakan

untuk mendeteksi keberadaan bakteri Vibrio sampai pada tingkat spesifik spesies,

antara lain spesies V. harveyi. Hemolisin merupakan jenis toksin yang terdistribusi

paling banyak pada bakteri Vibrio patogen. Berbagai jenis hemolisin yang

diproduksi oleh bakteri genus Vibrio mempunyai kemiripan satu sama lain, tetapi

tidak identik. Gen hemolisin yang dimiliki V. harveyi termasuk dalam kategori

hemolisin yang melisis sel darah secara tidak sempurna. Hemolisin V. harveyi

dinamai Vhh yang termasuk dalam famili thermolable haemolysin/TLH.

4

Gambar 1 Hasil uji aktivitas hemolisin isolat V. harveyi, V. parahaemolyticus,

Salmonella sp., Edwardsiella tarda, Aeromonas hydrophila, dan

Streptococcus iniae pada medium agar darah. (A) P-275 = V. harveyi,

AH: A. hydrophila, SM = Salmonella sp., Si = S. iniae. (B) P-275 = V.

harveyi, Si = S. iniae, ES = E. tarda, AH = A. hydrophila. (C) Vp =

V. parahaemolyticus, Vh = V. harveyi. (D) Vh = V. harveyi, Vp = V.

parahaemolyticus (Kadriah 2013).

Kadriah (2013) menjelaskan bahwa spesifisitas dan sensitivitas gen

hemolisin lebih baik dibanding gen toxR dan gen gyrB sebagai penanda molekuler

dalam mendeteksi V. harveyi. Ketiga gen tersebut merupakan gen-gen yang aktif

dalam mekanisme patogenitas bakteri genus Vibrio (Pang et al. 2005; Conejero

dan Hedreyda 2004; Thaithongnum et al. 2006). Gen-gen yang bertanggung

jawab dalam mekanisme patogenitas V. harveyi diekspresikan setelah kondisi

kuorum bakteri ini tercapai (Madigan et al. 2012). Dengan kata lain, gen-gen

tersebut termasuk dalam gen-gen yang sifat ekspresinya inducible yang

terekspresi melalui pengaturan tertentu (Weaver 2012). Primer gen hemolisin hasil disain Kadriah mampu mendeteksi V. harveyi sampai kepadatan 10

0 cfu/ml dan

konsentrasi DNA sebanyak 101 pg.

Conejero dan Hedreyda (2004) juga sudah pernah menggunakan gen

hemolisin V. harveyi sebagai penanda untuk deteksi vibrioisis. Primer tersebut

mempunyai spesifisitas yang tinggi karena hanya mendeteksi V. harveyi, namun

dalam penelitiannya tidak disajikan data yang menjelaskan sensitivitasnya.

Deteksi patogen V. harveyi melalui PCR juga dilakukan oleh Thaitongnum et al.

5

(2006) yang menghasilkan sensitivitas sebesar 1,5 x 101 cfu/ml. Primer hasil

disain Thongkao et al. (2013) hanya mampu mendeteksi V. harveyi sampai

kepadatan 1,1 x 102 cfu/ml.

Robertson et al. (1998a) pernah mendeteksi V. harveyi menggunakan

metode enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA), namun tingkat

sensitivitasnya hanya sebesar 105 cfu/ml. Buchatip et al. (2010) mendeteksi V.

harveyi menggunakan imunosensor berbasis quartz crystal microbalance (QCM)

dimana tingkat sensitivitasnya hanya sampai kepadatan 103 cfu/ml, walaupun

spesifisitasnya tinggi.

2.2 Nested PCR

PCR merupakan teknik yang digunakan untuk mengamplifikasi sekuen asam

nukleat menggunakan polimerisasi berulang dari sekuen DNA. Teknik ini disusun

dan dipraktikkan oleh Kary B. Mullis pada pertengahan tahun 1985.

Kesederhanaan dan tingginya tingkat kesuksesan amplifikasi sekuen DNA yang

diperoleh menyebabkan teknik ini semakin luas penggunaannya (Saiki et al.

1988). Dalam melakukan PCR, ekstrak DNA, enzim DNA polimerase, dan primer

direaksikan dalam larutan buffer yang sesuai. Reaksi PCR dilakukan dengan

bantuan alat thermocycle (Saiki et al. 1988).

Ekstrak DNA yang digunakan harus murni. Kemurnian ekstrak DNA

mempengaruhi hasil PCR dimana jika pada ekstrak DNA banyak pengotornya,

maka akan mengganggu proses PCR yang mengakibatkan kesalahan dalam

menganalisa. DNA dikatakan murni jika rasio OD260/OD280 berkisar antara 1,8

sampai 2,0 (Sambrook dan Russel 2001). Enzim DNA polimerase saat ini sudah

banyak diproduksi oleh perusahaan yang bergerak di bidang molekuler sehingga

lebih memudahkan pengguna dalam melakukan PCR (Apte dan Singh 2007).

Reaksi PCR merupakan sebuah siklus yang berlangsung dalam tiga tahapan.

Siklus diawali dengan tahap denaturasi pada suhu tinggi (90-95C) yang

mengakibatkan untai ganda DNA mengalami pemisahan menjadi untai tunggal.

Tahap selanjutnya adalah penempelan primer (annealing) yang biasanya terjadi

pada suhu 45-55C, primer akan melekat pada DNA cetakan sesuai dengan

komplementasi basa nukleotidanya. Tahap yang terakhir yaitu pemanjangan

nukleotida (elongation), pembentukan molekul DNA menggunakan molekul-

molekul dNTP yang merupakan komponen dari cetakan pada suhu 70-75C

(Kolmodin dan Birch. 2002).

Nested PCR adalah suatu teknik perbanyakan (replikasi) sampel DNA

menggunakan bantuan enzim DNA polymerase yang menggunakan 2 pasang

primer untuk mengamplifikasi fragmen. Pasangan primer yang pertama akan

mengamplifikasi sekuen yang cara kerjanya mirip dengan PCR pada umumnya.

Pasangan primer yang kedua biasanya disebut nested primer yang berikatan di

dalam sekuen produk PCR yang pertama untuk memungkinkan terjadinya

amplifikasi produk PCR yang kedua dimana hasilnya lebih pendek dari yang

pertama. Waktu yang diperlukan dalam reaksi nested PCR lebih lama daripada

PCR biasa karena pada nested PCR dilakukan 2 kali reaksi PCR sedangkan pada

PCR biasa hanya 1 kali reaksi PCR (Siebert et al. 1995).

6

Dengan menggunakan nested PCR, jika ada sekuen yang salah diamplifikasi

maka kemungkinan bagian tersebut diamplifikasi untuk kedua kalinya oleh primer

yang kedua sangat rendah. Dengan demikian, nested PCR sangat spesifik dalam

melakukan amplifikasi karena meminimalkan kesalahan amplifikasi gen dengan

menggunakan 2 pasang primer (Siebert et al. 1995). Lebih lanjut Nandagopal et

al. (2010) melaporkan bahwa nested PCR dengan target sekuen IS6110 pada

Mycobacterium tuberculosis mempunyai tingkat sensitivitas dan spesifisitas yang

lebih tinggi dibandingkan dengan PCR biasa untuk mendeteksi bakteri tersebut

dari fraksi leukosit sampel darah.

2.3 Disain Primer

Primer adalah oligonukleotida spesifik yang komplemen dengan daerah

yang ditentukan pada DNA target sebagai tempat dimulainya sintesis DNA baru

dengan PCR. Untuk mendapatkan daerah tertentu pada DNA target diperlukan

disain primer forward dan reverse dari daerah tersebut. Khusus untuk primer

reverse diperoleh dari sekuen antisensenya. Jadi nukleotida yang didapat dari

sekuen ujung 3 daerah DNA target tadi dicari komplemennya baru kemudian

dibalik (Glick dan Pasternak 2003).

Disain primer spesifik merupakan salah satu faktor yang mempengaruhi

keberhasilan amplifikasi DNA dengan PCR. Keakuratan sekuen yang dijadikan

acuan dalam pembuatan primer PCR mampu meminimalisir kesalahan amplifikasi

yang berupa positif palsu maupun negatif palsu yang akan mengurangi sensitivitas

dan atau spesifisitas primer (Apte dan Singh 2007). Ukuran, komposisi, dan homologi primer terhadap DNA target harus ditentukan dengan baik agar

diperoleh produk amplifikasi yang diinginkan saat melakukan PCR (Glick dan

Pasternak 2003).

Kolmodin dan Birch (2002) menyatakan bahwa primer yang digunakan bisa

berukuran antara 20 sampai 30 nukleotida. Sambrook dan Russel (2001)

menyatakan bahwa sebaiknya kandungan basa G+C adalah sekitar 50%. Apabila

basa G dan C terdapat dalam jumlah banyak pada ujung 3 akan memungkinkan

terjadinya kesalahan, misalnya terbentuk struktur jepit rambut (hair pin). Dalam

penentuan primer, diusahakan agar tidak terjadi perpasangan sendiri (self priming)

dan dimer-duplex. Primer yang rendah kandungan basa G dan C nya masih

memungkinkan untuk dipilih asalkan primernya berukuran lebih panjang untuk

menghindari temperatur melting (Tm) yang terlalu rendah.

Sambrook dan Russel (2001) lebih jauh menerangkan bahwa Tm

berhubungan dengan suhu annealing atau suhu dimana dimulainya

hibridisasi/penempelan primer dengan komplemennya pada template. Suhu

annealing biasanya lebih rendah 5oC dari Tm. Sesuai dengan peraturan Wallace,

temperatur melting (Tm) dapat ditentukan dengan rumus:

Tm = 4C (G+C) + 2C (A+T), dimana

G+C merupakan banyaknya basa G dan C dalam primer yang didisain, sedangkan

A+T merupakan banyaknya basa A dan T.

Penentuan homologi primer dapat dilakukan melalui penelusuran data

sekuen di Genebank seperti website NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), EBI

http://www.ebi.ac.uk, maupun DDBJ http://www.ddbj.nig.ac.jp (Claverie dan

http://www.ebi.ac.uk/http://www.ddbj.nig.ac.jp/

7

Notredame 2003). Sekuen gen dari organisme target dijadikan sebagai acuan

dalam mendisain primer untuk memperoleh akurasi yang maksimal (Apte dan

Singh 2007).

Setelah sekuen gen target didapatkan, selanjutnya sekuen tersebut

dibandingkan dengan sekuen lainnya yang telah tersedia di Genebank.

Pembandingan ini dapat dilakukan melalui website NCBI. Pada website NCBI

dapat diakses program BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) yang

merupakan program untuk menganalisa kesamaan yang didisain dalam

mengekplorasi semua database sekuen yang diminta, baik berupa DNA maupun

protein (Claverie dan Notredame 2003). Setelah sekuen-sekuen hasil BLAST

didapatkan, selanjutnya dapat dianalisis penjajaran dengan metode clustalW

menggunakan software BIOEDIT (Hall 1999). Berdasarkan hasil clustalW dapat

terlihat daerah sekuen yang conserved maupun yang tidak conserved. Menurut

Apte dan Singh (2007), area conserved merupakan daerah spesifik gen dan area

yang tidak conserved merupakan daerah spesifik spesies. Dalam mendisain

primer, terlebih bagi pendeteksian patogen, spesifisitas maupun sensitivitas primer

merupakan hal yang sangat penting untuk meminimalisir hasil positif palsu dan

negatif palsu.

8

3 BAHAN DAN METODE

3.1 Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi isolat V. harveyi

MR5339 dari koleksi Laboratorium Kesehatan Ikan (LKI) Program Studi

Budidaya Perairan Fakultas Perikanan IPB dan isolat V. harveyi 275, V.

parahaemolyticus, V. campbelli, Salmonella sp., Edwardsiella tarda, Aeromonas

hydrophila, dan Streptococcus iniae dari Laboratorium Karantina Ikan Makassar.

Semua isolat bakteri yang digunakan telah diverifikasi (Kadriah 2013). Isolat-

isolat V. harveyi dan V. parahaemolyticus diremajakan menggunakan medium Sea

Water Complete. Isolat V. campbelli, Salmonella sp., Edwardsiella tarda,

Aeromonas hydrophila, dan Streptococcus iniae masing-masing ditumbuhkan

dalam medium Luria Bertani.

Sebelum dilakukan disain primer nested PCR, sekuen gen hemolisin V.

harveyi sampel dideteksi menggunakan primer awal yang didisain dari gen

lengkap hemolisin V. harveyi strain VIB 391 (nomor akses: DQ640264) mulai

dari urutan ke-133 sampai urutan ke-756. Primer nested PCR didisain dari sekuen

gen hemolisin isolat V. harveyi MR5339 yang berhasil teramplifikasi oleh primer

awal. Primer I nested PCR didisain untuk mengamplifikasi urutan ke-52 sampai

urutan ke-405 dan primer II nested PCR didisain untuk mengamplifikasi urutan

ke-204 sampai urutan ke-405.

3.2 Peremajaan Isolat Bakteri

Isolat-isolat Vibrio diremajakan menggunakan medium Sea Water

Complete/ SWC (bacto peptone 5 g, bacto-yeast extract 1 g, gliserol 3 ml, air laut

750 ml, dan akuades 250 ml). Isolat- isolat bakteri lain ditumbuhkan dalam

masing-masing 3 ml medium Luria Bertani/ LB (bacto tryptone 10g, bacto-yeast

extract 5g, NaCl 10 g, dan akuades 1 l). Isolat-isolat diinkubasikan pada suhu

ruang selama 24 jam.

3.3 Ekstraksi DNA Bakteri

Masing-masing koloni bakteri Vibrio ditumbuhkan dalam 3 ml media SWC

cair. Isolat-isolat bakteri lain ditumbuhkan dalam masing-masing 3 ml media LB

cair. Isolat-isolat tersebut diinkubasi di atas shaker dengan kecepatan 250 rpm

pada suhu ruang selama semalam.

Masing-masing kultur diambil sebanyak 1,5 ml dan dipindahkan ke dalam

tabung eppendorf 1,5 ml lalu diendapkan dengan sentrifugasi 10.000 rpm 4C

selama 10 menit, supernatan dibuang. Endapan bakteri lalu disuspensikan ke

dalam 600 l larutan CTAB (cationic detergent hexadecyltrimethyl ammonium

bromide) yang telah ditambahkan dengan 3% PVP (polyvinylpyrrolidone) untuk

kultur bakteri selain V. harveyi dan 5% PVP untuk kultur bakteri V. harveyi.

Selanjutnya larutan diresuspensi. Larutan diinkubasi pada suhu 65C

menggunakan heater block selama 30-60 menit, setiap 5 menit larutan dibolak-

9

balik perlahan. Larutan kemudian diletakkan di dalam es selama 5 menit. Ke

dalam larutan ditambahkan larutan CI (chloroform:isoamylalcohol, perbandingan

4:1) kemudian tabung dibolak-balik perlahan beberapa kali. Tabung selanjutnya

disentrifugasi selama 10 menit pada kecepatan 10.000 rpm suhu 4C.

Fase air yang berada di bagian atas selanjutnya diambil sebanyak 500 l lalu

dimasukkan ke dalam tabung baru. Selanjutnya ditambahkan 500 l PCI (phenol:

chloroform:isoamylalcohol, perbandingan 25:24:1). Tabung dibolak-balik

perlahan lalu disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit suhu

4C. Fase air yang berada di bagian atas diambil dan dimasukkan ke dalam tabung

baru lalu ditambahkan 0,1 kali volume sodium asetat 2M pH 5.2 dan 2 kali

volume etanol absolut, kemudian dicampurkan perlahan-lahan untuk kemudian

disimpan di dalam pendingin pada suhu -20C selama 30 menit. Larutan yang ada

di dalam tabung lalu disentrifugasi selama 30 menit pada kecepatan 10.000 rpm.

Semua supernatan dibuang.

Ke dalam tabung yang berisi pelet, ditambahkan 500 l etanol 70% lalu

disentrifugasi selama 5 menit pada kecepatan 10.000 rpm. Supernatan lalu

dibuang dan pelet dikeringkan dengan alat vakum pada suhu 40oC selama 15

menit. Pelet yang didapat merupakan DNA genom. Ke dalam tabung tersebut lalu

ditambahkan 20 l dH2O dan 4 l/0,2 kali volume RNAse (1 mg/ml) dan

diinkubasi pada suhu 37C selama 1 jam hingga semalaman. Setelah diinkubasi,

dilakukan inaktivasi RNAse dengan menyimpan tabung pada heater blok suhu

70oC selama 10 menit.

3.4 Analisa DNA Vibrio dengan Elektroforesis

Pertama-tama, dibuat suspensi 0,8 % agarose dalam TAE 1X dengan cara

melarutkan 0,8 gram agarose dalam 100 ml TAE 1X, kemudian dipanaskan

dengan microwave hingga larutan menjadi jernih. Setelah agak dingin dituang ke

dalam cetakan dan dibiarkan membeku. Sampel DNA sebanyak 10 l dicampur

dengan 1 l loading dye lalu dimasukkan ke dalam sumur gel. Marker lamda juga

dimasukkan sebagai penanda. Elektroforesis dilakukan pada tegangan 100 Volt

selama 28 menit. Gel lalu dipindahkan ke dalam larutan ethidium bromide (EtBr)

0,5 mg/l selama 5 menit dan selanjutnya diamati di atas UV setelah sebelumnya

dicuci dengan dH2O.

3.5 Uji Kemurnian dan Penghitungan Konsentrasi DNA

Sebanyak 1 L sampel DNA dilarutkan dengan 699 L ddH2O kemudian

dianalisis secara kuantitatif dengan spektrofotometer pada OD260 dan OD280.

Diukur 2 x nilai absorbansinya dengan spektrofotometer pada OD260 dan OD280

kemudian dihitung konsentrasi DNA sampel (g/ml) pada pengenceran 700x

tersebut. Dihitung rasio nilai absorbansinya pada OD260/OD280 . Setiap OD260 = 1

setara dengan 50 ng/ml DNA.Untuk mengukur kemurnian DNA terhadap

kontaminan, nilai absorbansi 260 nm dibandingkan dengan nilai absorbansi 280

nm. DNA dikatakan murni jika memiliki rasio OD260/OD280 antara 1,8 sampai 2,0.

10

Menurut Lee et al. (1995), 2,6 fg DNA sebanding dengan 1 sel bakteri V.

parahaemolyticus.

3.6 Disain Primer Awal Gen Hemolisin V. harveyi

Pertama-tama dicari sekuen gen hemolisin V. harveyi melalui website EBI

(http://www.ebi.ac.uk/). Setelah didapatkan, dicari gen lainnya yang mirip dengan

menggunakan program BLAST di website NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Sekuen hasil BLAST disimpan ke dalam 1 file fasta. File ini selanjutnya akan

dianalisis clustalW menggunakan program BIOEDIT untuk mendisain primer

awal.

3.7 PCR Menggunakan Primer Awal Gen Hemolisin V. harveyi

Terlebih dahulu dibuat campuran pereaksi PCR. Komposisi pereaksi PCR

dijelaskan pada tabel 1 berikut:

Tabel 1. Komposisi pereaksi PCR

Komponen Volume (l)

ddH2O steril 12,8

Buffer reaksi 10 X 2

dNTP (2 mM) 2

Primer Forward (10 pM) 0,5

Primer Reverse (10 pM) 0,5

Taq DNA Polimerase (5 U/l) 0,2

Masing-masing 2 l ekstrak DNA konsentrasi 100 ng/l dari beberapa isolat

V. harveyi akan dicampurkan dengan pereaksi PCR. Pada setiap campuran

pereaksi PCR hanya akan dicampurkan dengan 1 strain ekstrak DNA V. harveyi.

Campuran-campuran ini lalu dihomogenkan untuk kemudian dilakukan PCR

menggunakan alat thermocycler.

Pada alat thermocycler diatur program yang pradenaturasi, denaturasi,

extensi, extensi akhir, dan pendinginannya disamakan untuk tiap-tiap primer.

Suhu dan waktu annelingnya disesuaikan dengan masing-masing primer. Program

ini dilakukan sebanyak 35 siklus. Hasil PCR kemudian dielektroforesis dengan

1% agarose. Program awal ini dipaparkan pada tabel 2.

Tabel 2. Program awal pada alat thermocycler

Tahapan PCR Suhu (oC) Waktu (menit)

Pradenaturasi (pra PCR) 95 5

Denaturasi 94 1

Extensi 72 1

Extensi akhir 72 5

Pendinginan 15 10

http://www.ebi.ac.uk/http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

11

3.8 Elusi Sekuen Gen Hemolisin V. harveyi dan Pengurutan Sekuen Gen

Hemolisin

Sekuen DNA V. harveyi hasil PCR di atas selanjutnya diisolasi mengikuti

metode Suharsono dan Widyastuti (2010). Gel yang mengandung pita DNA yang

diinginkan dipotong diatas UV. Hasil pemotongan dipindahkan ke cawan petri

dan dicacah menggunakan scalpel. Gel disaring menggunakan membran hybon N

netral dalam tabung mikro. Membran dibasahi dengan 50l buffer elusi (0,1 %

SDS; 50 mM Tris pH 7,5) sebelum dimasukkan gel. Potongan gel lalu

dimasukkan lalu ditambahkan lagi buffer elusi sebanyak 150 l. Campuran

disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit pada suhu 20. Ke

dalam campuran ditambahkan lagi 150 l larutan buffer elusi diatas gel dan

disentrifugasi kembali dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit.

Penambahan larutan buffer elusi dilakukan hingga volume total menjadi 500 l.

Larutan DNA hasil penyaringan diendapkan dengan penambahan dengan 0,1

kali volume (50 l) NaOAc 3 M pH 5 dan ditambah dengan 2 kali volume larutan

dengan etanol absolut (1 ml). Hasil penyaringan disimpan dalam freezer bersuhu -

20C selama 30 menit lalu disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu

4 selama 20 menit. Endapan yang diperoleh dibilas dengan 500 l etanol 70%

dan disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4 selama 10 menit.

Supernatan dibuang dan endapan dikeringkan dengan mesin vakum. Endapan

kemudian disuspensikan dengan 10 l TE (10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA pH 8).

Sekuen DNA yang didapatkan dari isolat V. harveyi ini akan dijadikan

sebagai kontrol positif gen hemolisin V. harveyi pada nested PCR selanjutnya.

Sekuen ini juga diurutkan basa-basanya dengan alat sequencer menggunakan jasa

analisis dari 1st Base.

3.9 Disain Primer Nested PCR

Sekuen yang didapat dari hasil pengurutan akan digunakan untuk mendisain

pasangan primer nested PCR. Dalam mendisain pasangan primer dari nested PCR,

hasil sekuen yang didapat kemudian dianalisis culstalW menggunakan program

BIOEDIT bersama sekuen-sekuen gen hemolisin sebelumnya.

Masing-masing ekstrak DNA murni dari beberapa isolat bakteri Vibrio akan

dilakukan uji penempelan pasangan primer pertama nested PCR hasil disain. Jika

primer yang ada masih belum spesifik menempel hanya pada isolat V. harveyi

maka akan dilakukan disain primer baru sampai primer hanya spesifik bagi V.

harveyi.

3.10 Nested PCR

Setelah diperoleh pasangan primer bagi nested PCR, dilakukan PCR

menggunakan primer PCR I nested PCR menggunakan ekstrak DNA V. harveyi

masing-masing sebanyak 20 ng/l. Sekuen hasil PCR yang didapat kemudian

dilakukan PCR kembali dengan primer PCR II nested PCR. Masing-masing

12

ekstrak DNA murni isolat-isolat bakteri V. harveyi akan dilakukan uji penempelan

primer bagi nested PCR hasil disain.

3.11 Uji Sensitivitas Primer Nested PCR

Untuk mengetahui sensitivitas primer nested PCR hasil disain, dilakukan

pengenceran berseri terhadap genom isolat-isolat bakteri V. harveyi mulai dari

pengenceran105, 10

4, 10

3, 10

2, 10

1, dan 10

0 cfu/ml. Pengenceran berseri juga

dilakukan terhadap ekstrak DNA genom yaitu 102 ng/l sampai 10

1 fg/l.

Masing-masing hasil pengenceran diamplifikasi dengan PCR menggunakan

primer nested PCR hasil disain. Hasil PCR kemudian dielektroforesis untuk

melihat ada-tidaknya pita hasil amplifikasi. Sebagai kontrol positif digunakan

sekuen DNA isolat V. harveyi hasil PCR menggunakan primer awal sebanyak 102

ng/l dan sebagai kontrol negatif digunakan ddH2O steril.

3.12 Uji Spesifisitas Primer Nested PCR

Untuk mengetahui spesifisitas primer nested PCR tersebut terhadap isolat V.

harveyi, dilakukan juga amplifikasi dengan PCR terhadap ekstrak DNA bakteri

Vibrio non harveyi yaitu V. parahaemolyticus dan V. campbelli serta bakteri non

Vibrio yaitu Salmonella sp., E. tarda, A. hydrophila, dan S.s iniae yang telah

disiapkan sebelumnya. Sekuen DNA isolat V. harveyi hasil PCR menggunakan

primer awal digunakan sebagai kontrol positif dan ddH2O steril digunakan sebagai

kontrol negatif.

3.13 Surveillance Test

Setelah dilakukan uji sensitivitas dan spesifisitas secara in vitro, dilakukan

uji lapang melalui pengecekan langsung terhadap udang putih fase post larvae

yang diinfeksikan dengan V. harveyi. Bakteri V. harveyi sebelumnya ditumbuhkan

di media SWC padat yang mengandung antibiotik rifampisin 50 mg/l untuk

memudahkan verifikasi.

Mula-mula post larvae diaklimatisasi selama 24 jam. Selanjutnya post

larvae diinfeksikan selama 2 jam dalam suspensi V. harveyi dalam air laut mulai

dari konsentrasi 105, 10

4, 10

3, 10

2, 10

1, dan 10

0cfu/ml. Air lalu diganti dengan air

laut steril. Selama diuji, post larvae diberi pakan Artemia (Wickins dan Lee

2002).

Infeksi V. harveyi pada post larvae udang putih tersebut dicek setiap hari

hingga hari ke-6. Pengecekan dilakukan terhadap post larvae yang hidup maupun

yang mengalami kematian. Setiap hari larva digerus untuk selanjutnya dilakukan

ekstraksi DNA (Robertson et al. 1998b). Ekstraksi dilakukan dengan modifikasi

metode CTAB + PVP dari Suryati (2013) dimana 3% PVP diganti menjadi 5%.

Ekstrak kemudian dilakukan PCR dengan primer nested PCR. Hasil PCR

kemudian dielektroforesis untuk melihat ada-tidaknya pita hasil amplifikasi.

Khusus bagi post larvae yang mati, sebelum dilakukan ekstraksi DNA, gerusan

13

ditumbuhkan di media SWC padat yang mengandung antibiotik rifampisin untuk

verifikasi infeksi V. Harveyi sampel. Sebagai kontrol positif digunakan sekuen

DNA isolat V. harveyi hasil PCR menggunakan primer awal hasil elusi. Ekstrak

DNA V. harveyi MR5339 konsentrasi 102 ng/l juga digunakan sebagai kontrol

positif untuk memperkuat data. Sebagai kontrol negatif digunakan ddH2O steril,

air laut steril, dan ekstrak DNA udang yang tidak terinfeksi V. harveyi.

14

4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 PCR Menggunakan Primer Awal Gen Hemolisin V. harveyi MR5339 dan

Pengurutan Sekuen Gen Hemolisin

PCR menggunakan primer awal dilakukan pada ekstrak DNA V. harveyi

MR5339 dan V. harveyi 275. Ekstraksi DNA juga dilakukan pada isolat-isolat

bakteri lain. Semua ekstrak DNA diuji kemurnian dan konsentrasinya yang

hasilnya dipaparkan pada tabel 3. Hasil penghitungan uji kemurnian melalui

spektrofotometri menunjukkan bahwa ekstrak DNA yang diperoleh telah murni.

Kemurnian terendah adalah pada ekstrak DNA V. harveyi yaitu 1,8 dan

kemurnian tertinggi adalah pada ekstrak DNA E. tarda yaitu 1,92. Sesuai dengan

pernyataan Sambrook dan Russel (2001), DNA dikatakan murni jika rasio

OD260/OD280 berkisar antara 1,8 sampai 2,0. Selanjutnya Sambrook dan Russel

(2001) menerangkan bahwa kemurnian DNA mempengaruhi hasil PCR dimana

jika pada ekstrak DNA banyak kontaminannya, maka akan mengganggu proses

PCR.

Melalui analisa spektrofotometri juga diketahui bahwa konsentrasi DNA

terendah adalah pada ekstrak DNA E. tarda yaitu 8,75 x 102 ng/l dan tertinggi

pada ekstrak DNA V. parahaemolyticus yaitu 3,395 x 103 ng/l. Konsentrasi ini

telah memenuhi syarat untuk dilakukan pengujian selanjutnya karena konsentrasi

DNA tertinggi yang dibutuhkan dalam penelitian ini adalah 1 x 102 ng/l.

Tabel 3. Hasil penghitungan uji kemurnian dan konsentrasi DNA isolat bakteri.

Nama Sampel Bakteri OD260 OD280 Kemurnian

DNA

Konsentrasi DNA

(ng/l)

V. harveyi MR5339 0,052 0,029 1,79 1820

V.harveyi 275 0,042 0,022 1,91 1470

V.campbelli 0,038 0,021 1,81 1330

V. parahaemolyticus 0,097 0,052 1,87 3395

Streptococcus iniae 0,039 0,021 1,86 1365

Salmonella sp. 0,044 0,024 1,83 1540

Aeromonas hydrophila 0,061 0,033 1,85 2135

Edwardsiella tarda 0,025 0,013 1,92 875

Ekstrak DNA V. harveyi yang telah diuji kemurnian dan konsentrasinya

dilakukan sebagai templat PCR dengan primer awal. Berdasarkan hasil PCRnya

diketahui bahwa ukuran DNA yang didapatkan sesuai dengan yang diperkirakan

yaitu 624 pb. Berdasarkan hasil PCR menggunakan primer awal, divisualisasikan

pada gambar 2. Dari gambar 2 diketahui bahwa primer awal mengamplifikasi

seluruh bakteri genus Vibrio sedangkan bakteri genus lain tidak terlihat

amplifikasi. Menurut Zhang dan Austin (2005), berbagai jenis hemolisin yang

diproduksi oleh bakteri genus Vibrio mempunyai kemiripan satu sama lain, tetapi

tidak identik. Kemunculan pita amplifikasi pada semua bakteri genus Vibrio dapat

15

terjadi karena primer awal yang didisain berasal dari daerah yang conserved

dimana menurut Apte dan Singh (2007) daerah yang conserved merupakan daerah

spesifik gen, bukan spesies. Primer awal ini didesain dari gen hemolisin V.

harveyi strain VIB 391 (nomor akses: DQ640264). Tidak munculnya pita

amplifikasi pada bakteri non Vibrio dimungkinkan karena tidak identiknya

hemolisin yang dimiliki oleh bakteri non Vibrio tersebut (gambar 2). Hal ini

diperkuat dengan penelusuran kemungkinan menempelnya primer awal melalui

NCBI dimana tidak ditemukan adanya penempelan pada spesies non Vibrio.

Dengan kata lain, primer awal hasil disain ini adalah primer spesifik gen

hemolisin bakteri genus Vibrio.

Gambar 2 Visualisasi hasil PCR dengan primer awal. Visualisasi hasil PCR

dengan primer awal bagi ekstrak DNA V. parahaemolyticus (A),

Salmonella sp. (B), E. tarda (C), V. harveyi 275 (D), V. harveyi

MR5339 (E), V. campbelli (F), A. hydrophila (G), dan S. iniae (H)

dengan marker 1kb dari Invitrogen.

Sekuen gen hemolisin V. harveyi MR5339 yang teramplifikasi diketahui

berukuran 624 pb dan sekuen gen hemolisin V. harveyi 275 juga berukuran 624

pb. Setelah dibandingkan dengan sekuen gen hemolisin yang ada di Genebank

melalui website NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), kedua sekuen tersebut

mempunyai kemiripan sebesar 99% dengan sekuen gen hemolisin V. harveyi

strain VH34, nomor akses EU827170 (lampiran 1 dan 2).

Primer awal ini didisain dari sekuen gen lengkap V. harveyi strain VIB 391

(nomor akses: DQ640264) mulai dari urutan ke-133 sampai urutan ke-756.

Tujuan primer awal ini didisain adalah untuk mendapatkan urutan nukleotida

sekuen gen hemolisin V. harveyi langsung dari bakterinya dan bukan dari sekuen

yang telah terdeposit di Genebank dimana diharapkan dari urutan tersebut dapat

didisain primer nested PCR untuk meminimalisir kesalahan amplifikasi yang

berupa positif palsu maupun negatif palsu yang akan mengurangi spesifisitas dan

sensitivitas dari nested primer yang didisain. Sesuai dengan pernyataan Apte dan

Singh (2007), keakuratan sekuen yang dijadikan acuan dalam pembuatan primer

PCR mampu meminimalisir kesalahan amplifikasi yang berupa positif palsu

maupun negatif palsu yang akan mengurangi spesifisitas dan sensitivitas primer.

Komposisi, ukuran, dan homologi primer terhadap DNA target harus ditentukan

dengan baik agar diperoleh produk amplifikasi yang diinginkan saat melakukan

PCR (Glick dan Pasternak 2003).

Gen hemolisin dipilih karena berdasarkan hasil penelitian Kadriah (2013),

gen ini mempunyai sensitivitas dan spesifisitas yang lebih baik sebagai penanda

molekuler dibandingkan dengan gen toxR maupun gen gyrB. Ketiga gen tersebut

merupakan gen-gen yang aktif dalam mekanisme patogenitas bakteri genus Vibrio

(Pang et al. 2005; Conejero dan Hedreyda 2004; Thaithongnum et al. 2006). Gen-

gen yang bertanggung jawab dalam mekanisme patogenitas V. harveyi

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

16

diekspresikan setelah kondisi kuorum bakteri ini tercapai (Madigan et al. 2012).

Dengan kata lain, gen-gen tersebut termasuk dalam gen-gen yang sifat

ekspresinya inducible yang terekspresi melalui pengaturan tertentu (Weaver

2012). Dengan mendisain primer dari gen yang bersifat inducible, spesifisitas dan

sensitivitas primer memungkinkan untuk menjadi lebih tinggi lagi.

Hemolisin merupakan eksotoksin yang mampu melisis membran sel darah

yang menyebabkan terlepasnya ikatan besi pada beberapa protein seperti pada

haemoglobin. Hemolisin merupakan jenis toksin yang terdistribusi paling banyak

pada bakteri Vibrio patogen (Zhang dan Austin 2005). Pada sebagian besar kasus,

bukti epidemiologi dan eksperimental menunjukkan bahwa hemolisin terlibat

dalam patogenesis penyakit Vibriosis (Shinoda 1999). Berbagai jenis hemolisin

yang diproduksi oleh bakteri genus Vibrio mempunyai kemiripan satu sama lain,

tetapi tidak identik. Gen hemolisin yang dimiliki V. harveyi termasuk dalam

kategori hemolisin yang melisis sel darah secara tidak sempurna. Hemolisin V.

harveyi dinamai Vhh yang termasuk dalam famili thermolable haemolysin/TLH

(Zhang dan Austin 2005). Tidak identiknya gen hemolisin memungkinkan lebih

tingginya spesifisitas dan sensitivitasnya sebagai marka molekuler dibanding

dengan gen toxR maupun gen gyrB, sebagaimana yang telah dilakukan oleh

Kadriah (2013).

4.2 Disain Primer Nested PCR

Primer nested PCR didisain dari informasi gen hemolisin V. harveyi

MR5339 yang telah disekuen menggunakan jasa 1st Base dari PT. Genetika.

Disain primer ini dimulai dengan melakukan alignment terhadap hasil sekuen gen

hemolisin yang didapatkan dengan data sekuen yang terdeposit di website NCBI

(Claverie dan Notredame 2003). Sekuen-sekuen hasil penjajaran tersebut

selanjutnya disimpan di dalam 1 file untuk dianalisis penjajaran dengan metode

clustalW pada program BIOEDIT (Hall 1999). Berdasarkan hasil analisis tersebut,

dipilih daerah yang paling tidak conserved untuk dijadikan primer. Sesuai dengan

pernyataan Apte dan Singh (2007), daerah yang paling tidak conserved

merupakan daerah spesifik spesies tersebut sehingga pemilihan daerah tersebut

meningkatkan sensitivitas dan spesifisitas dalam mengamplifikasi sekuen gen

hemolisin V. harveyi.

Daerah yang paling tidak conserved dan yang paling memungkinkan dari

gen hemolisin V. harveyi MR5339 diketahui berada pada urutan ke-52 sampai

urutan ke-405. Daerah amplifikasi primer nested PCR hasil disain ditunjukkan

pada lampiran 3. Primer I nested PCR didisain untuk mengamplifikasi urutan ke-

52 sampai urutan ke-405 dan primer II nested PCR didisain untuk

mengamplifikasi urutan ke-204 sampai urutan ke-405.

4.3 Uji Sensitivitas Primer Nested PCR

Hasil elektroforesis uji sensitivitas primer nested PCR terhadap V. harveyi

MR5339 menggunakan pengenceran sel 105 cfu/ml s.d 10

0 cfu/ml dan ekstrak

DNA 101 fg/l s.d. 10

2 ng/l divisualisasikan pada gambar 3. Primer nested yang

17

digunakan mempunyai sensitivitas hingga s.d 100 cfu/ml mendeteksi V. harveyi

MR5339 (gambar 3a dan 3b). Hasil PCR dengan primer I nested PCR

menghasilkan pita yang berukuran 354 pb. Adanya 2 pita yang muncul pada hasil

PCR II dimungkinkan karena suhu penempelan primer yang berdekatan, yaitu

63oC untuk PCR I dan 64

oC untuk PCR II sehingga primer dari PCR I yang

kemungkinan terikut dari pengambilan produk PCR I ikut mengamplifikasi pada

reaksi PCR II. Sesuai dengan Sambrook dan Russel (2001), pada optimasi PCR,

suhu penempelan primer yang berdekatan masih memungkinkan untuk

penempelan primer. Mengacu kepada kontrol positif, kemunculan 2 pita tersebut

tidak mempengaruhi kesimpulan akhir penelitian ini.

Nested PCR I Nested PCR II

Gambar 3 Uji sensitivitas primer nested PCR menggunakan DNA V. harveyi

MR5339. a) Hasil PCR dengan primer I nested PCR (A5 s.d. A0 =

ekstrak DNA bakteri V. harveyi MR5339 pengenceran berturut-turut

dari 105 cfu/ml s.d 10

0 cfu/ml). b) Hasil PCR dengan primer II nested

PCR dan DNA produk PCR I masing-masing sebanyak 1 l (A5 s.d.

A0 = Produk PCR I bakteri V. harveyi MR5339 pengenceran berturut-

turut dari 105 cfu/ml s.d 10

0 cfu/ml). c) Hasil PCR dengan primer I

nested PCR (A2n s.d A1f = ekstrak DNA V. harveyi MR5339 102

ng/l s.d 101fg/l). d) Hasil PCR dengan primer II nested PCR dan

DNA produk PCR I masing-masing sebanyak 1 l (A2n s.d A1f =

Produk PCR I ekstrak DNA V. harveyi MR5339 102 ng/l s.d

101fg/l). (+)1 = Kontrol positif hasil elusi V. harveyi MR5339

konsentrasi 102 ng/l produk PCR I, (-)1 = Kontrol negatif ddH2O, M

= marker 100 pb dari Jena Bioscience konsentrasi 60 ng.

Sensitivitas primer nested juga memungkinkan untuk mendeteksi ekstrak

DNA V. harveyi MR5339 hingga 101 fg/l (gambar 3c dan 3d), lebih sensitif

dibandingkan dengan metode deteksi yang dilakukan oleh Kadriah et al. (2013).

Sensitivitas hingga 101 fg/l ini sesuai dengan Lee et al. (1995) yang menyatakan

bahwa 2,6 fg DNA sebanding dengan 1 sel bakteri V. parahaemolyticus, dimana

bakteri ini satu genus dengan V. harveyi sehingga bisa dikatakan bahwa

konsentrasi DNA 1 sel bakteri V. parahaemolyticus dengan bakteri V. harveyi

tidak jauh berbeda karena kekerabatan secara filogenetisnya juga sangat dekat. Uji

sensitivitas juga memberikan hasil yang sama pada V. harveyi 275 dimana primer

nested PCR hasil disain mampu mendeteksi hingga kepadatan sel 100 cfu/ml dan

ekstrak DNA hingga 101 fg/l (gambar 4).

18

Uji sensitivitas sangat diperlukan dalam disain primer untuk mendeteksi

patogen karena melalui uji ini dapat diketahui adanya kemungkinan munculnya

hasil negatif palsu. Tingginya sensitivitas primer PCR mampu meminimalisir

hasil negatif palsu (Apte dan Singh 2007). Berdasarkan hasil penelitian ini maka

dapat dikatakan bahwa primer nested hasil disain mempunyai sensitivitas yang

tinggi. Primer nested PCR yang digunakan dalam penelitian ini diketahui mampu

mendeteksi V. harveyi hingga kepadatan 100 cfu/ml dan ekstrak DNA hingga 10

1

fg/l sehingga selanjutnya dapat digunakan sebagai penanda molekuler bagi

proses yang berhubungan dengan budidaya maupun pengolahan udang L.

vannamei untuk mengantisipasi kontaminasi patogen V. harveyi.

Sebagai perbandingan, Robertson et al. (1998a) hanya mencapai sensitivitas

sebesar 105 cfu/ml mendeteksi V. harveyi menggunakan metode enzyme-linked

immunosorbent assays (ELISA). Deteksi V. harveyi menggunakan imunosensor

berbasis quartz crystal microbalance (QCM) hanya mendeteksi sampai kepadatan

103cfu/ml, walaupun spesifisitasnya tinggi (Buchatip et al. 2010).

Thaitongnum et al. (2006) yang juga mendisain primer untuk mendeteksi V.

harveyi menghasilkan sensitivitas sebesar 1,5 x 101 cfu/ml. Primer hasil disain

Thongkao et al. (2013) hanya mendeteksi V. harveyi sampai kepadatan 1,1 x 102

cfu/ml. Semua hasil tersebut lebih besar dibandingkan dengan hasil uji sensitivitas

dalam penelitian ini.

Nested PCR I Nested PCR II

Gambar 4 Uji sensitivitas primer nested PCR menggunakan DNA V. harveyi

275. a) Hasil PCR dengan primer I nested PCR (B5 s.d B0 = ekstrak

DNA bakteri V. harveyi 275 pengenceran berturut-turut dari 105

cfu/ml s.d 100 cfu/ml). b) Hasil PCR dengan primer II nested PCR dan

DNA produk PCR I masing-masing sebanyak 1 l (B5 s.d B0 =

Produk PCR I bakteri V. harveyi 275 pengenceran berturut-turut dari

105 cfu/ml s.d 10

0 cfu/ml). c) Hasil PCR dengan primer I nested PCR

(B2n s.d B1f = ekstrak DNA V. harveyi 275 102 ng/l s.d , 10

1fg/l).

d) Hasil PCR dengan primer II nested PCR dan DNA produk PCR I

masing-masing sebanyak 1 l (B2n s.d B1f = ekstrak DNA V. harveyi

275 102 ng/l s.d 10

1fg/l). (+)1 = Kontrol positif hasil elusi V.

harveyi MR5339 konsentrasi 102 ng/l, (-)1 = Kontrol negatif ddH2O,

M = marker 100 pb dari Jena Bioscience konsentrasi 60 ng.

19

4.4 Uji Spesifisitas Primer Nested PCR

Uji spesifisitas primer nested PCR dilakukan pada kepadatan bakteri 105 cfu

/ml s.d 100 cfu/ml dan ekstrak DNA 10

1 fg/l s.d. 10

2 ng/l. Dari hasil PCR

ekstrak DNA bakteri V. campbelli, V. parahaemolyticus, S. iniae, Salmonella sp.,

A. hydrophila, dan E. tarda yang yang digunakan sebagai pembanding dalam uji

spesifisitas ini, tidak ada satupun dihasilkan amplikon (gambar 5 dan 6), merujuk

pada kontrol positif ((+)1) hasil elusi V. harveyi 275 konsentrasi 102 ng/l, kontrol

negatif ((-)1) ddH2O.

Nested PCR I Nested PCR II

Gambar 5 Hasil uji spesifisitas pada kepadatan bakteri 10

5 cfu/ml s.d 10

0 cfu/ml.

a) Hasil uji spesifisitas isolat V. campbelli (PCR I: C5 s.d. C0 =

ekstrak DNA pengenceran berturut-turut dari 105 cfu/ml s.d 10

0

cfu/ml. PCR II: C5 s.d. C0 = Produk PCR I pengenceran berturut-

turut dari 105 cfu/ml s.d 10

0 cfu/ml). b) Hasil uji spesifisitas bagi

isolat V. parahaemolyticus (PCR I: D5 s.d. D0 = ekstrak DNA

pengenceran berturut-turut dari 105 cfu/ml s.d 10

0 cfu/ml. PCR II: D5

s.d. D0 = Produk PCR I pengenceran berturut-turut dari 105 cfu/ml s.d

100 cfu/ml). c) Hasil uji spesifisitas bagi isolat S. iniae (PCR I: E5

20

s.d. E0 = ekstrak DNA pengenceran berturut-turut dari 105 cfu/ml s.d

100 cfu/ml. PCR II: E5 s.d. E0 = Produk PCR I pengenceran berturut-

turut dari 105 cfu/ml s.d 10

0 cfu/ml). d) Hasil uji spesifisitas bagi

isolat Salmonella sp. (PCR I: F5 s.d. F0 = ekstrak DNA pengenceran

berturut-turut dari 105 cfu/ml s.d 10

0 cfu/ml. PCR II: F5 s.d. F0 =

Produk PCR I pengenceran berturut-turut dari 105 cfu/ml s.d 10

0

cfu/ml). e) Hasil uji spesifisitas bagi isolat A. hydrophila (PCR I: G5

s.d. G0 = ekstrak DNA pengenceran berturut-turut dari 105 cfu/ml s.d

100 cfu/ml. PCR II: G5 s.d. G0 = Produk PCR I pengenceran

berturut-turut dari 105 cfu/ml s.d 10

0 cfu/ml). f) Hasil uji spesifisitas

bagi isolat E. tarda (PCR I: H5 s.d. H0 = ekstrak DNA pengenceran

berturut-turut dari 105 cfu/ml s.d 10

0 cfu /ml. PCR II: H5 s.d. H0 =

Produk PCR I pengenceran berturut-turut dari 105 cfu/ml s.d 10

0

cfu/ml). (+)1 = Kontrol positif hasil elusi V. harveyi MR5339

konsentrasi 102 ng/l, (-)1 = Kontrol negatif ddH2O, M = marker 100

pb dari Jena Bioscience konsentrasi 60 ng.

Isolat-isolat V. parahaemolyticus, Salmonella sp., Edwardsiella tarda,

Aeromonas hydrophila, dan Streptococcus iniae yang digunakan sebagai

pembanding dalam penelitian ini diketahui mempunyai kemampuan melisis sel

darah. Melalui uji aktivitas hemolisin di medium agar darah, isolat-isolat tersebut

mempunyai aktivitas hemolisin (Kadriah 2013). Tidak munculnya amplikon

pada isolat V. parahaemolyticus dan V. campbelli dimungkinkan karena menurut

Zhang dan Austin (2005) hemolisin yang diproduksi bakteri genus Vibrio

meskipun mirip, namun tidak identik. Dengan semakin jauhnya hubungan

taksonomi isolat Salmonella sp., Edwardsiella tarda, Aeromonas hydrophila, dan

Streptococcus iniae, maka semakin banyak ketidakmiripan gen hemolisin yang

diproduksinya. Dengan kata lain, terdapat perbedaan pada urutan basa nukleotida

masing-masing gen hemolisin.

Spesifisitas primer nested hasil disain ini juga tidak terlepas dari tahapan-

tahapan yang dilakukan sebelumnya. Primer nested diambil dari sekuen gen V.

harveyi MR5339, bukan dari Genebank dan dipilih sekuen yang paling tidak

conserved. Apte dan Singh (2007) menjelaskan bahwa keakuratan sekuen yang

dijadikan acuan dalam pembuatan primer PCR mampu meminimalisir kesalahan

amplifikasi yang berupa positif palsu maupun negatif palsu yang akan mengurangi

sensitivitas dan atau spesifisitas primer.

Berdasarkan hasil uji spesifisitas dapat diketahui bahwa primer nested hasil

disain mempunyai spesifisitas yang tinggi yang mampu mengamplifikasi hanya

pada V. harveyi. Tingginya spesifisitas primer mampu meminimalisir kesalahan

amplifikasi yang berupa positif palsu (Apte dan Singh 2007). Conojero dan

Hedreyda (2004) juga menggunakan primer gen hemolisin untuk mendeteksi V.

harveyi. Primer tersebut mempunyai spesifisitas yang tinggi untuk mendeteksi V.

harveyi, namun tidak disajikan data yang menjelaskan sensitivitasnya sedangkan

primer hasil disain dalam penelitian ini diketahui mempunyai spesifisitas dan

sensitivitas yang sangat tinggi. Menurut Apte dan Singh (2007), spesifisitas dan

sensitivitas merupakan hal yang penting dalam disain primer PCR untuk

mendeteksi patogen.

21

Nested PCR I Nested PCR II

Gambar 6 Hasil uji spesifisitas pada ekstrak DNA konsentrasi 10

2