III. Teori DasarPemurnian protein adalah suatu rangkaian proses isolasi jenis tunggal dari dari satu campuran kompleks. Biasanya pemurnian ini bertujuan untuk mengetahui lebih jauh mengenai struktur, sifat-sifat kimia maupun fisika suatu senyawa yang terdapat di bahan alam. Sehingga diperlukan suatu proses guna memperoleh senyawa dalam keadaan murni. Mendapatkan suatu jenis protein dari bahan alam dalam keadaan murni bukanlah pekerjaan mudah, sebab molekul protein tidak stabil terhadap pemanasan serta pelarut organik.Untuk mempelajari suatu protein tertentu, perlu dilakukan isolasi perotein tersebut dengan protein yang lain yang mungkin terkandung dalam jaringan. Purifikasi protein merupakan teknin biokimia yang banyak digunakan. Banyak metode yang digunakan untuk fraksinasi protein terutama berdasarkan ukuran molekul dari protein. Sebagai contoh, protein yang diangkat dari larutan dengan menambahkan garam, proses dari ukuran molekul protein yang lebih besar ke ukuran yang lebih kecil. Peristiwa pemisahan atau pengendapan protein oleh garam berkonsentrasi tinggi disebut "salting out". Metode "salting out" ini mungkin bergantung pada fenomena fisik, dua fenomena tersebut yang penting di antaranya adalah penghentian dari daya tarik dari permukaan protein oleh ion garam dan perpindahan air dari sekitar molekul protein oleh kompetisi dari ion dari garam dengan air (Cantarow and Schepartz, 1963).Salting out merupakan metode yang digunakan untuk memisahkan protein yang didasarkan pada prinsip bahwa protein kurang terlarut ketika berada pada daerah yang konsentrasi kadar garamnya tinggi. Konsentrasi garam diibutuhkan oleh protein untuk mempercepat keluarnya larutan yang berbeda dari protein satu ke protein yang lainnya (Mayes et al, 1990).Pengaruh penambahan garam terhadap kelarutan protein berbeda-beda, tergantung pada konsentrasi dan jumlah muatan ionnya dalam larutan. Semakin tinggi konsentrasi dan jumlah muatan ionnya, semakin efektif garam dalam mengendapkan protein (Yazid dan Nursanti, 2006).Kelarutan protein akan berkurang bila kedalam larutan protein ditambahkan garam- garam anorganik. Pengendapan terus terjadi karena kemampuan ion garam untuk menghidrasi, sehingga terjadi kompetisi antara garam anorganik dengan molekul protein untuk mengikat air. Karena garam anorganik lebih menarik air maka jumlah air yang tersedia untuk molekul protein akan berkurang (Mayes et al, 1990).

Kegunaan dari ammonium sulfat untuk pemisahan protein adalah untuk mempercepat dalam menghubungkan klasifikasi dari albumin dan globulin. Sodium sulfat lebih sesuai untuk pemisahan analitik dari plasma protein (Cantarow and Schepartz, 1963).Fraksi yang diperoleh dari pengen dapan amonium sulfat perlu dimurnikan lagi dengan metode kromatografi. Kromatografi adalah teknik pemisahan zat untuk analisis dan preparative dengan melarutkan campuran dalam fase gerak (cairan atau gas), yang mengalir melalui fase diam atau stasioner, zat zat yang hendak dipisahkan harus berinteraksi dengan fase stasioner dengan kuat yang berbeda beda , interaksi ini dapat bersifat adsorbs, partisi, pertukaran ion, dan interaksi lainnya.Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada larutan.Molekul yang terlarut dalam fase gerak, akan melewati kolom yang merupakan fase diam.Molekul yang memiliki ikatan yang kuat dengan kolom akan cenderung bergerak lebih lambat dibanding molekul yang berikatan lemah.Dengan ini, berbagai macam tipe molekul dapat dipisahkan berdasarkan pergerakan pada kolom.Setelah komponen terelusi dari kolom, komponen tersebut dapat dianalisa dengan menggunakan detektor atau dapat dikumpulkan untuk analisa lebih lanjut.Beberapa alat-alat analitik dapat digabungkan dengan metode pemisahan untuk analisis secara on-line (on-line analysis) seperti: penggabungan kromatografi gas (gas chromatography) dan kromatografi cair (liquid chromatography) dengan mass spectrometry (GC-MS dan LC-MS), Fourier-transform infrared spectroscopy (GC-FTIR), dan diode-array UV-VIS (HPLC-UV-VIS). (Tissue BM. 2000) Kromatografi yang digunakan diantaranya :a. Kromatografi filtrasi gelKromatografi filtrasi gel merupakan teknik pemisahan protein dan makro molekul biologi lain berdasarkan ukuran molekul, jadi bekerja sebagai suatu penyaring molekul seperti terlihat pada gambar 10. Proses pemisahan ini menggunakan gel yaitu dekstran (polimer gula yang larut dalam air) dan mengalami reaksi ikatan silang (cross linkage) sehingga dekstran menjadi tidak larut dalam air, tetapi masih dapat menyerap molekul air dalam molekulnya (Scopes, 1987).Daya serap matriks bergantung pada jumlah ikatan silang yang terjadi di dalamnya. Matriks atau gel dekstran disebut juga sebagai sefadeks, misalnya sefadeks G-50. Huruf dan nomor menunjukkan bahwa safadeks tersebut dapat dikembangkan (Swelling) dengan air atau larutan penyangga dengan besar pengembangnya 50 kali (Scopes, 1987). Gel atau matriks ini berpori yang dikemas di dalam kolom dan dielusi dengan fase cair mobil. Molekul yang lebih kecil akan masuk ke dalam pori matriks dan bergerak lebih lambat, sedangkan molekul yang lebih besar akan bergerak lebih cepat karena tidak tertahan di dalam pori matriks.b. Kromatografi Afinitas Afinitas kromatografi adalah teknik yang sangat berguna untuk "memoles" atau menyelesaikan proses pemurnian protein. Manik-manik dalam kolom kromatografi adalah cross-linked untuk ligan yang mengikat khusus untuk protein target. Protein ini kemudian dihapus dari kolom dengan berkumur dengan larutan yang mengandung ligan bebas. Metode ini umumnya memberikan hasil paling murni dan tertinggi aktivitas spesifik dibandingkan dengan teknik lain.Praktikum kali ini dilakukan purifikasi laktat dehidrogenase (LDH) dari daging ayam. LDH Merupakan enzim yang mengkatalisis perubahan piruvat menjadi laktat yang tergantung pada kofaktor nikotinamida.LDH ditemukan hampir pada semua organisme karena mempunyai peran penting pada metabolisme karbohidrat. Selama kondisi dimana produksi piruvat dari glikolisis dapat meningkatkan kemampuan sel untuk memetabolisme piruvat. LDH dapat mengubah piruvat menjadi laktat, dengan demikian akan menghasilkan NAD teroksigenasi yang diperlukan untuk proses glikolisis selanjutnya. LDH juga dapat mengkonversi reaksi sebaliknya yaitu pembentukan piruvat dari laktat yang juga akan menghasilkan NADH, baik NADH ataupun piruvat dapat digunkan untuk proses metabolisme lainnya.Laktat dehidrogenase (LD, LDH) adalah enzim intraseluler yang terdapat pada hampir semua sel yang bermetabolisme, dengan konsentrasi tertinggi dijumpai di jantung, otot rangka, hati, ginjal, otak, dan sel darah merah. LDH merupakan suatu molekul tetramerik yang mengandung empat subunit dari dua bentuk; H (jantung) dan M (otot), yang berkombinasi sehingga menghasilkan lima isoenzim yang diberi nama LDH1 (H4) sampai LDH5 (M4). Isoenzim-isoenzim tersebut memiliki spesifisitas jaringan yang sangat berguna dalam menentukan organ asal, yaitu : LDH1 (HHHH) terdapat di jantung, eritrosit, otak LDH2 (HHHM) terdapat di jantung, eritrosit, otak LDH3 (HHMM) terdapat di paru, otak, ginjal, limpa, pankreas, adrenal, tiroid LDH4 (HMMM) terdapat di hati, otot rangka, ginjal LDH5 (MMMM) terdapat di hati, otot rangka, ileum

Enzim laktat dehidrogenase (LDH) merupakan enzim yang berperan penting dalam metabolisme laktat.Enzim LDH mengkatalisis reaksi irreversibel piruvat menjadi laktat yang tergantung pada kofaktor nikotinamida.

Dalam reaksi ini, hidrogen dari molekul NADH ditransfer ke molekul piruvat. Hal ini menghasilkan karbon-oksigen ikatan rangkap yang dikurangi menjadi ikatan karbon-oksigen tunggal dengan penambahan atom hidrogen. Hasilnya adalah molekul laktat. Dari produk laktat, asam laktat dapat dibentuk,

Kolom desalting