43

BAB IV

METODE PENELITIAN

4.1 Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental untuk menguji aktivitas

antibakteri pada sediaan peel-off mask kombinasi tea tree oil dan niasinamida

terhadap pertumbuhan bakteri Propionibacterium acnes.

4.2 Skema Kerja Penelitian

Kombinasi tea tree oil dan

niasinamida pada sediaan peel-off

mask

Uji aktivitas antibakteri

Formulasi sediaan peel-off mask kombinasi tea tree oil dan niasinamida

Formulasi 1

PVA 5 %

Formulasi 2

PVA 10 %

Formulasi 3

PVA 15 %

Kontrol

positif

Kontrol

negatif

Uji sediaan masker wajah peel-off

Uji karakteristik dan

kimia sediaan :

Organoleptis

(Bau, warna, tekstur)

a. Tipe emulgel

b. pH sediaan

c. Daya sebar

d. Viskositas

e. Uji homogenitas

Uji waktu mengering

sediaan

Uji stabilitas

sediaan

Analisis data

Gambar 4.1 Skema Kerja Penelitian

Keterangan :

Kontrol positif : Clindamycin gel Kontrol negatif : Sediaan peel-off mask tanpa bahan aktif

44

4.3 Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan di laboratorium Mikrobiologi dan

Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Muhammadiyah Malang.

Penelitian yang dilakukan ialah uji efektivitas antibakteri sediaan peel-off

mask kombinasi tea tree oil dan niasinamida terhadap pertumbuhan

bakteri Propionibacterium acnes.

4.4 Variabel Penelitian

4.4.1 Variabel Bebas

Variabel bebas pada penelitian ini adalah penggunaan polivinil

alkohol (PVA) pada konsentrasi 5%, 10%, dan 15% dalam sediaan

emulgel.

4.4.2 Variabel Tergantung

Variabel tergantung dari penelitian ini yaitu tingkat kekeruhan atau

kejernihan yang dihasilkan dari masing-masing formula yang telah dibuat

dengan metode dilusi cair. Serta karakteristik fisik sediaan emulgel tea

tree oil.

4.5 Alat dan Bahan Penelitian

4.5.1 Bahan Penelitian

Bahan yang akan digunakan pada penelitian ini adalah Niasinamida

PT. Sumber Berlian Kimia, Polivinil Alkohol (PT. Bractaco), Propilen

Glikol (PT. Bractaco, Metil Paraben (PT. Bractaco), Sodium Lauryl Sulfat

(CV. Makmur Sejati), Carbopol 940 (PT. Sumber Berlian Kimia),TEA

(CV. Makmur Sejati), BHT (PT. Bractaco), Aquadest (CV. Makmur

Sejati).

4.5.2 Bakteri Uji

Bakteri uji yang digunakan pada penelitian ini adalah

Propionbacterium acnes. Bakteri ini diperoleh dari Laboratorium

Biomedik Universitas Muhammadiyah Malang.

45

4.5.3 Alat Penelitian

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi:

- Tabung reaksi - Mikro pipet

- Kaca objek - Beaker glass

- Bunsen - Tisu

- Mikroskop - Beaker glass

- Pipet - Batang pengaduk

- Kaca petri - Timbangan analitik

- Ose - Spatula besi

- Rak tabung - Pinset

4.5.4 Bahan Formulasi Peel-off Mask

- Tea tree oil - Niasinamida

- PVA - Caebomer 940

- TEA - Propilengikol

- Methyl paraben - Sodium lauryl sulfat

- BHT - Aquadest

4.5.5 Formulasi Peel-off Mask

Tabel IV.1 Formula Masker peel-off Mask

No Bahan Fungsi

Formula I

b/b

Formula

II

b/b

Formula III

b/b

1 Tea Tree Oil Bahan Aktif 5% 5% 5%

2 Niasinamida Bahan Aktif 5% 5% 5%

3 PVA Pembentuk

lapisan film/

Gelling agent

5% 10% 15%

4 Carbomer 940 Gelling agent 0,5% 0,5% 0,5%

5 TEA Pembasa 0,5% 0,5% 0,5%

6 Propilene glikol Humectan 10% 10% 10%

7 Methyl paraben Pengawet 0,2% 0,2% 0,2%

8 Sodium lauryl

sulfate

Lubrikan 2% 2% 2%

9 BHT Antioksidant 0,5% 0,5% 0,5%

10 Aquadest Pelarut Ad 100 Ad 100 Ad 100

46

4.5.6 Skema Cara Pembuatan Peel-off Mask

Cara peraciakan peel off mask kombinasi Tea Tree Oil dan Niasinamida dengan variasi

kadar PVA (Polivinil alkohol)

Formula III dengan

PVA (15%)

Formula II dengan

PVA (10%)

Formula I dengan

PVA (5%)

Evaluasi Sediaan

Evaluasi tipe emulgel

Uji karakteristik fisik dan kimia sediaan :

Organoleptis (warna, bau, tekstur)

pH sediaan

Viskositas

Uji homogenitas

Uji waktu mengering sediaan

Uji daya sebar

Uji Stabilitas sediaan

Freeze Thaw

Uji Aseptabilitas

Analisi Data

Gambar 4.2 Skema Cara Peracikan Peel-off Mask

47

4.6. Tahap Persiapan

4.6.1 Pewarnaan Bakteri Uji

Perwarnaan bakteri uji dilakukan dengan metode pewarnaan Gram.

Perwarnaan bakteri dilakukan untuk identifikasi dan memastikan tidak ada

kontaminan pada kultur kerja nantinya (Hafsan et. al., 2015).

Digunakan objek kaca yang dibersihkan menggunakan alkohol 96%

dan dikeringkan. Kemudian tambahkan aquadest 1 tetes di atas objek kaca,

keudian ambil biakan bakteri yang akan dilakukan pewarnaan dengan ose

steril (biakan bakteri yang diambil hanya 1 koloni saja), kemudian ratakan

biakan bakteri di permukaan objek kaca yang telah berisi aquadest.

Kemudian fiksasi dengan api bunsen (lewatkan di atas api 2-3 kali).

Setelah kering, pertema tetesi dengan pewarna Crystal Violet kemudian

tunggu 1 menit, bilas dengan aquadest. Kedua, tetesi dengan Lugol dan

tunggu 1 menit, bilas dengan aquadest. Ketiga, bilas dengan alkohol 96%

biarkan selama 5 detik kemudian dibilas lagi dengan aquadest. Keempat,

tetesi dengan pewarna Safranin dan tunggu 1 menit, bilas dengan aquadest

kemudian keringkan dengan tisu (Hafsan et. al., 2015).

Periksa dengan mikroskop (perbesaran 100 x 10), bakteri yang tetap

berwarna ungu digolongkan kedalam bakteri Gram positif. Sedangkan

bakteri Gram negatif juga berwarna ungu tetapi penggunaan Safranin akan

mewarnai sel Gram negatif menjadi berwarna merah, sedangkan Gram

positif tidak terpengaruh karena memiliki jumlah peptidoglikan yang lebih

banyak, sehingga akan lebih mengikat warna pertama (crystal violet) yang

berwarna ungu dan ketika pewarnaan tidak mudah dihilangkan (Hafsan et.

al., 2015).

4.6.2 Preparasi Media

1. Nutrient Agar

Dalam penelitian ini digunakan satu media yakni Mueller Hinton

Agar (MHA). Pembuatan media Mueller Hinton Agar (MHA) dengan

melarutkan bahan sebanyak 38 gram (dengan komposisi : Meat infusion

solid form 300g/l, Casein acid hydrolysate 17,5 g/l, Starch 1.5 g/l dan Agar

15 g/l) kedalam 1 L aquadest pada erlenmeyer dengan kapasitas 1 L.

48

Erlenmeyer tersebut diletakkan diatas hot plate kemudian masukkan magnetic

stirer ke dalam erlenmeyer untuk mempercepat pelarutan sampai didapatkan

larutan media menjadi berwarna kuning jernih. Setelah itu erlenmeyer ditutup

dengan aluminium foil kemudian disterilisasi dengan autoklaf selama 15

menit pada suhu 121°C. Dituang media steril ke cawan petri steril secara

aseptis (Hafsan et. al., 2015).

2. Nutrient Broth

Media nutrient broth dibuat dengan melarutkan bahan nutrient broth

(Beef infusion form, starch, casein acid hydrolysate) sebanyak 21 gram

kedalam 1 L aquadest dan dipanaskan sambil dikocok dengan

menggunakan pengaduk magnetik hingga homogen. Larutan tersebut

dimasukkan kedalam labu erlenmeyer dan ditutup dengan kapas dan

aluminim foil kemudian di sterilkan dengan autoklaf selama 15 menit pada

suhu 121 °C.

4.6.3 Pembuatan Standart Mc Farland

Diambil aquadest kira-kira setengah dari tabung reaksi. Kemudian

tambahkan H2SO4 1% sebanyak 9950 μL dan BaCl2 1% sebanyak 50μl.

Campur kedua larutan dalam tabung tersebut, dikocok sampai homogen

dan terbentuk larutan keruh. Kekeruhan ini dipakai sebagai suspensi

bakteri dengan tingkat kekeruhan 1,5 108CFU/ml (Anonim, 2015).

4.6.4 Preparasi Bakteri

Proses peremajaan bakteri yang berasal dari biakan murni diambil 3-

4 ose kemudian dioleskan pada media Mueller Hinton Broth (MHB).

Kemudian diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 37°C. Sebelum

membuat suspensi bakteri, siapkan terlebih dahulu standar McFarland 0,5

yang setara dengan jumlah perkiraan suspensi bakteri yaitu 1,5 x 108

CFU/ml (Ningsih et. al., 2013).

Kemudian dilakukan pembuatan suspensi bakteri dengan teknik

dilusi (pengenceran). Bakteri uji diambil dari hasil peremajaan

menggunakan mikro pipet kemudian dimasukkan ke dalam 5 ml aquades

steril (tabung A), dikocok menggunakan vortex dan dibandingkan dengan

standar McFarland 1,5 x 108

CFU/ml (Ningsih et. al., 2013).

Pembuatan bahan uji ekstak n-Heksan biji Cerbera manghas

Persiapan konsentrasi biji Cerbera manghas

Preparasi Bakteri Propionibacterium acnes di LAF

Preparasi Media

Pengujian Difusi Cakram

Kelompok Uji :

Ekstrak n-Heksana biji Cerbera manghas

(20 mg/ml ; 40 mg/ml; 80 mg/ml)

Kelompok kontrol :

- Kontrol Positif (Clindamycin)

- Kontrol Negatif (DMSO)

Analisis Data

49

Untuk pengujian dilakukan proses pencampuran biakan pada media

MHA di cawan petri yang diambil sebanyak 1 ml menggunakan mikro pipet

kemudian diaduk secara merata. Lanjutkan prncampran sampai habis. Setelah

selesai bakteri diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam (Hafsan et. al.,

2015).

4.7 Uji Aktivitas Antibakteri

4.7.1 Uji Daya Hambat Bakteri dengan Metode Sumuran

Pertama-tama dibuat 3 kelompok pengujian antara lain :

Kontrol negatif basis peel-off mask tanpa bahan aktif

Kontrol positif Clindamycin Gel 100 µL

Kelompok 1 : Perlakuan dengan formula 1 = konsentrasi PVA 5%

Kelompok 2 : Perlakuan dengan formula 2 = konsentrasi PVA 10%

Kelompok 3 : Perlakuan dengan formula 3 = konsentrasi PVA 15%

Uji daya hambat bakteri menggunakan metode sumuran agar

dengan prosedur sebagai berikut: Bakteri aktif sebanyak 100 μl diambil

dari suspensi bakteri dengan menggunakan mikropipet, kemudian

dimasukkan kedalam cawan petri. Suspensi bakteri dihomogenkan dan

diratakan dengan menggunakan spreader hingga memadat. Selanjutnya

media yang telah bercampur dengan bakteri dilubangi menggunakan cork

borer dengan diameter lubang 5 mm. Masukkan sampel uji ke dalam

lubang sumuran, diinkubasi suhu 37˚ C selama 24 jam.

Zona bening yang terbentuk disekitar lubang sumuran diamati dan

diukur menggunakan jangka sorong (Darsono dan Artemisia, 2003). Zona

bening yang terlihat di sekeliling lubang sumuran menandakan adanya

aktivitas antibakteri. Diameter zona bening yang dihasilkan dari sampel uji

kemudian dibandingkan dengan kelompok kontrol positif dan kontrol

negatif. Kontrol positif yang digunakan dalam penelitian ini adalah

Clindamycin Gel 100 µL sedangkan kontrol negatif yang digunakan adalah

basis peel-off mask tanpa bahan aktif.

50

4.8 Metode Analisis

Analisis data dilakukan secara deskriptif dengan melakukan

pengukuran terhadap diameter zona hambat dari daerah berwarna bening

dari masing-masing komponen senyawa pada sediaan peel-off mask tea

tree oil dan niasinamida terhadap bakteri Propionibacterium acnes dengan

menggunakan alat jangka sorong. Daerah berwarna bening di sekitar

cekungan diukur menggunakan jangka sorong dengan menghitung

diameter daerah yang berwarna bening. Hasil pengukuran tersebut

merupakan diameter zona hambat dari sediaan peel-off mask tea tree oil

dan niasinamida terhadap bakteri Propionibacterium acnes. Kemudian

dilakukan uji statistik dengan metode one way anova menggunakan

software Statistical Product and Service Solution (SPSS), dengan derajat

kepercayaan 95% (α = 0,05).