25

BAB IV

METODOLOGI PENELITIAN

4.1 Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental untuk mengetahui

konsentrasi penambahan ekstrak etanol Bunga Marigold (Tagetes erecta L.)

terhadap uji antioksidan pada sediaan krim. Adapun tahapan yang dilakukan pada

penelitian ini sebagai berikut:

Gambar 4. 1 Desain Penelitian Optimasi Formulasi sediaan krim mengandung

ekstrak etanol bunga Marigold (Tagetes erecta) dengan basis

vanishing cream.

Analisis Data

Uji

Viskositas

Uji Tipe

Emulsi

Uji pH Uji Daya

Sebar

Uji

Organoleptis

Uji pemisahan

fase (freeze thaw)

Evaluasi Sediaan

Formulasi sediaan krim ekstrak etanol bunga marigold dengan

basis vanishing cream

Formula 1

Ekstrak Etanol Bunga

Marigold 0,5%

Formula 2

Ekstrak Etanol

Bunga Marigold 1%

Formula 3

Ekstrak Etanol

Bunga Marigold 2%

Uji DPPH

26

4.2. Variabel Penelitian

4.2.1. Variabel Bebas

Variabel bebas dalam penelitian ini adalah konsentrasi ekstrak etanol

bunga Marigold (Tagetes erecta) dalam persen yang ditambahkan pada formula

krim.

4.2.2. Variabel Tergantung

Variabel tergantung pada penelitian ini adalah hasil uji organoleptis, uji

viskositas, penentuan tipe emulsi, uji daya sebar, uji pH, dan uji DPPH krim yang

mengandung Eksrak Etanol Bunga Marigold.

4.3. Tempat dan Waktu Penelitian

4.3.1 Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Teknologi Sediaan Farmasi dan

Laboratorium Kimia Terpadu Program Studi Farmasi Fakultas Ilmu Kesehatan

Universitas Muhammadiyah Malang.

4.3.2 Waktu Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Juni 2018 sampai dengan bulan

September 2018.

4.4. Alat dan Bahan Penelitian

4.4.1. Alat Penelitian

Alat yang digunakan pada penelitian ini terdiri dari beaker gelas, spatula,

sudip, penangas air, mortir dan stamper, cawan penguap, pipet tetes, wadah krim,

spektrofotometer uv-vis, timbangan analitik , alat uji daya sebar, alat uji daya, dan

Viskosimeter.

4.4.2. Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah ekstrak etanol bunga

marigold, aquadest dan bahan dasar krim dengan derajat farmasetis meliputi Setil

Alkohol, Asam stearat, Trietanolamin, Gliserin, Propilen glikol, Natrium

Metabisulfit, BHT, Metilparaben, Propilparaben, Aquadest, Methanol pro

Analisis, DPPH.

27

4.5. Metode Kerja

4.5.1 Pembuatan Ekstrak Etanol Bunga Marigold

Bunga Marigold kering di blender untuk meningkatkan luas permukaan

dari simplisia. Setelah itu dimasukkan satu bagian simplisia kering kedalam

maserator lalu ditambahkan 10 bagian pelarut etanol 90%. Selanjutnya direndam

selama 6 jam pertama sambil sekali-sekali diaduk, kemudian didiamkan selama

18 jam. Lalu dipisahkan maserat dengan cara filtrasi. Proses penyarian diulangi

sebanyak tiga kali dengan jenis dan jumLah pelarut yang sama. Setelah itu semua

maserat dikumpulkan kemuadian diuapkan dengan rotavapor hingga diperoleh

ekstrak kental (Farmakope Herbal Indonesia Edisi I, 2008).

4.5.2 Prosedur Pembuatan Krim

Tabel IV. 1 Formula Krim Ekstrak Etanol Bunga Marigold

No. Bahan Kegunaan Jumlah (%)

F1 F2 F3

1. Ekstrak Etanol

Bunga Marigold Bahan aktif 0,5% 1% 2%

2. Setil Alkohol Stiffening agent 2% 2% 2%

3. Paraffin Cair Basis 7% 7% 7%

4. Asam Stearat Emulsifying agent 3% 3% 3%

5. Trietanolamin Emulsifying agent 1% 1% 1%

6. Gliserin Humektan 5% 5% 5%

7. Propilen glikol Humektan 3% 3% 3%

8. Metil Paraben Pengawet 0,1% 0,1% 0,1%

9. Propil Paraben Pengawet 0,1% 0,1% 0,1%

10. BHT Antioksidan 0,1% 0,1% 0,1%

11. Natrium

Metabisulfit Antioksidan 0,1% 0,1% 0,1%

12. Aquadest Ad 200g Ad 100% Ad 100% Ad 100%

Disiapkan alat dan bahan-bahan yang akan digunakan terlebih dahulu, di

timbang masing-masing bahan yang dibutuhkan pada setiap formula, Krim dibuat

dengan mencampurkan Asam Stearat, Setil Alkohol, Paraffin cair, Propil

paraben, BHT yang kemudian dipanaskan di atas waterbath hingga suhu 70-750C

(fase minyak). Trietanolamin, Gliserin, Propilen glikol, Natrium Metabisulfit, dan

28

aquadest dipanaskan di atas waterbath pada suhu 70-750C (fase air). Siapkan

mortir panas. Setelah itu masukkan fase minyak ke dalam mortir panas. Masukkan

fase air ke dalam fase minyak di mortir panas sedikit demi sedikit sambil

dilakukan pengadukan yang konstan sampai homogen dan terakhir dimasukkan

ekstrak etanol bunga marigold aduk sampai homogen. Pada masing-masing

formula tersebut dibedakan konsentrasi ekstrak etanol bunga marigold sebesar

0,5% (FI), 1% (FII) dan 2% (FIII).

Gambar 4. 2 Skema Cara Pembuatan

Disiapkan Alat dan Bahan

Ditimbang masing-masing bahan yang dibutuhkan pada setiap formula

Asam Stearat, Setil Alkohol,

Paraffin liquidum, BHT, Propil

paraben dipanaskan di atas

waterbath hingga suhu70-750C

(fase minyak)

Trietanolamin, Metil paraben,

Gliserin, Natrium Metabisulfit dan

aquadest dipanaskan di atas

waterbath pada suhu 70-750C (fase

air)

Disiapkan mortir panas

Dimasukkan fase air ke dalam fase minyak di mortir panas sambil dilakukan

pengadukan yang konstan sampai homogen

Setelah terbentuk emulsi tambahkan ekstrak etanol bunga marigold, aduk ad

homogen

Masukkan wadah dan lakukan uji evaluasi

29

4.6 Prosedur Evaluasi Karakteristik Fisik dan Kimia

Evaluasi yang dilakukan untuk menguji karakteristik fisik dan kimia pada

sediaan krim.

4.6.1 Uji Organoleptik

Pemeriksaan terhadap warna, bau dan konsistensi krim. Ini dilakukan

untuk mengetahui krim yang dibuat sesuai dengan warna dan bau ekstrak sediaan

krim yang dikehendaki.

4.6.2 Uji Viskositas

Viskositas krim ditentukan dengan Viskosimeter Brookfield dengan

mencacat hubungan antara beban dan rpm (Sinko, 2011). Sebanyak 50g krim

diletakkan di gelas beker ditempatkan rotor ditengah-tengah gelas beker.

Kemudian alat dihidupkan dan jarum viskositas secara otomatis akan bergerak ke

kanan, kemudian setelah konstan dicatat (dilakukan replikasi tiga kali) (Aghel et

al, 2007).

4.6.3 Penentuan tipe emulsi

Dilakukan dengan metode pewarnaan menggunakan metilena biru dan

sudan merah. Pewarnaan dilakukan dengan cara sediaan krim yang akan diuji

diletakkan diatas gelas arloji, kemudian ditambahkan metilena biru, kemudian

diaduk hingga homogen. Jika setelah diaduk warna sediaan menjadi berwarna biru

yang merata maka sediaan tersebut merupakan krim tipe M/A. (dilakukan

replikasi tiga kali).

4.6.4 Uji Daya Sebar

Penentuan daya sebar dilakukan dengan alat sepasang lempeng kaca

dengan tebal masing- masing 3mm. Metode penentuan daya sebar dengan cara

menimbang krim sebanyak 0,5 gram, diletakkan diatas lempeng kaca yang bagian

bawahnya ditempeli kertas milimeter dengan diameter 20cm. selanjutnya sediaan

ditutup dengan kaca, bagian atas penutup diberi beban mulai dari terkecil sampai

dengan beban terbesar (1g, 2g, 3g, 4g, 5g, dan seterusnya) dengan diameter

konstan. Setelah itu amati penyebaran krim dan ukur diameternya (replikasi tiga

kali) (Shoviyana dan Zulkarnain, 2013).

4.6.5 Uji pH

Pengukuran dilakukan dengan alat pH meter Basic 20+. Elektroda dicuci

dengan aquadest dan dikeringkan dengan tisu, dilakukan kalibrasi dengan larutan

buffer standar pH 7,0, kemudian elektroda dicuci dan dikeringkan kembali.

30

Ditimbang sebanyak 5 gram sediaan krim, kemudian diencerkan dengan aquadest

bebas CO2 sampai 50 mL. selanjutnya dilakukan pengukuran pH sediaan dengan

cara yang sama seperti saat melakukan kalibrasi (dilakukan replikasi 3 kali)

(Aswal et al, 2013).

4.6.6 Uji Stabilitas Krim Antioksidan

Freeze Thaw

Sediaan krim antioksidan ekstrak etanol bunga marigold ditimbang

sebanayk 5 g dari masing-masing formula, setelah itu sediaan tersebut

dimasukkan kedalam vial diletakkan pada kulkas pada suhu 4°C selama 24 jam,

kemudian dipindahkan ke oven dengan suhu 40°C ± 2°C perlakuan yang sama

dilakukn sebanyak 6 kali kemudian diamati mengenai organoleptis dan pH

sediaan krim ekstrak etanol bunga marigold (Silalahi,2015).

4.7 Uji Antioksidan

4.7.1 Uji Antioksidan Ekstrak Etanol Bunga Marigold

4.7.1.1 Pembuatan Larutan DPPH 200 ppm

Ditimbang sebanyak 10 mg DPPH, BM (394,32 g/mol). Dilarutkan dengan

methanol P.A ad 50,0 mL, kemudian ditempatkan pada botol gelap. Cara

pembuatan larutan DPPH 200 ppm dapat dilihat pada gambar skema alir dibawah

ini.

Gambar 4. 3 Skema Cara Pembuatan Larutan DPPH 200 ppm

4.7.1.2 Pembuatan Larutan Blanko

Dipipet 2 mL larutan DPPH 200 ppm, dimasukkan kedalam labu ukur 10,0

mL, ditambahkan methanol ad 10,0 mL. kemudian dikocok ad homogen. Cara

pembuatan larutan blanko dapat dilihat pada gambar skema alir dibawah ini

Timbang DPPH 10 mg + 50,0 mL methanol

p.a

Larutkan ad homogen

Botol gelap

31

Gambar 4. 4 Skema Cara Pembuatan Larutan Blanko

4.7.1.3 Pembuatan Larutan Uji

1. Pembuatan Baku Induk (BI)

Dibuat larutan baku induk dengan konsentrasi 100 ppm dengan cara

ditimbang ekstrak etanol bunga marigold sebanyak 10 mg dan dilarutkan dalam

methanol 100,0 mL pada labu ukur, kocok ad homogen.

2. Pembuatan Baku Kerja

Pembuatan larutan baku kerja dilakukan sebagai berikut:

BK 1 : 0,5 mL BI + 2,0 mL DPPH ad 10,0 mL methanol P.A (5 ppm)

BK 2 : 1,0 mL BI + 2,0 mL DPPH ad 10,0 mL methanol P.A (10 ppm)

BK 3 : 2,0 mL BI + 2,0 mL DPPH ad 10,0 mL methanol P.A (20 ppm)

BK 4 : 4,0 mL BI + 2 mL DPPH ad 10,0 mL methanol P.A (40 ppm)

BK 5 : 8,0 mL BI + 2 mL DPPH ad 10,0 mL methanol P.A (80 ppm)

2,0 mL larutan DPPH (200 ppm) + methanol p.a ad 10,0 mL

Masukkan dalam labu ukur 10,0 mL

Kocok ad homogen

32

Gambar 4. 5 Skema Cara Pembuatan Larutan Uji Ekstrak Etanol Bunga

Marigold

4.7.1.4 Pembuatan Larutan Kontrol Positif (Vitamin C)

1. Pembuatan Baku Induk (BI) Kontrol Positif

BI 1: Timbang vitamin C 5mg+ methanol p.a ad 10,0 mL (500ppm)

BI 2: pipet BI 0,5 mL + methanol p.a ad 25,0 mL (10 ppm)

2. Pembuatan Larutan Baku Kerja Kontrol Positif

Pembuatan larutan baku kerja dilakukan sebagai berikut:

BK 1: pipet 1,0mL BI 2+2,0mL DPPH+methanol P.A ad 10,0 mL (1ppm)

BK 2: pipet 2,0mL BI 2+2,0mL DPPH+ methanol P.A ad 10,0 mL (2ppm)

BK 3: pipet 3,0mL BI 2+ 2,0mL DPPH+ methanol P.A ad 10,0mL (3ppm)

BK 4: pipet 4,0mL BI 2+ 2,0mL DPPH+ methanol P.A ad 10,0mL (4ppm)

BK 5: pipet 5,0 ml BI + 2,0mL DPPH+ methanol P.A ad 10,0mL(5ppm)

10 mg ekstrak etanol bunga marigold + methanol p.a ad 100,0 mL

Labu ukur 100,0 mL → kocok ad homogen

Larutan baku induk 100 ppm

(LBI)

LBI 0,5

mL + 2,0

mL DPPH

+

methanol

p.a ad

10,0 mL

LBI 1,0

mL + 2,0

mL DPPH

+

methanol

p.a ad

10,0 mL

LBI 2,0

mL + 2,0

mL DPPH

+

methanol

p.a ad

10,0 mL

LBI 4,0

mL + 2,0

mL DPPH

+

methanol

p.a ad

10,0 mL

LBI 8,0

mL + 2,0

mL DPPH

+

methanol

p.a ad

10,0 mL

BK 1

(5 ppm)

BK 2

(10 ppm)

BK 3

(20 ppm)

BK 4

(40 ppm)

BK 5

(80 ppm)

33

3. Skema Pembuatan Larutan Kontrol Positif

Gambar 4. 6 Skema Cara Pembuatan Larutan Uji Kontrol positif (Vitamin C)

4.7.1.5 Proses Inkubasi

Setelah selesai pembuatan larutan blanko, lakutan uji, larutan baku kerja,

dan larutan kontrol positif, maka semua larutan tersebut di inkubasi pada suhu

ruang selama 30 menit (Chivde et al., 2011).

4.7.1.6 Proses Pengukuran Absorbansi

Larutan di ukur serapannya menggunakan spektrofotometer Uv- Vis

dengan panjang gelombang 515- 520nm atau sesuai dengan panajang gelombang

yang didapatkan. Lalu aktivitas penangkal radikal bebas dihitung sebagai

presentase berkurangnya DPPH dengan menggunakan rumus: IC50

% Inhibisi

Dari harga persen penangkal radikal bebas yang diperoleh, dibuat kurva

antara persen penangkal radikal bebas terhadap konsentrasi larutan uji. Dari

persamaan regresi linier tersebut dapat ditentukan nilai IC50 yaitu konsentrasi

inhibisi larutan uji yang mampu menangkal 50% radikal bebas, dalam penelitian

ini dilakukan uji analisa menggunakan probit log (Anugrawati, 2016).

Larutan BI 1: 5 mg Vit. C+ methanol p.a ad 10,0 mL (500ppm)

Larutan B1 2: pipet 0,5 mL (BI 1) + methanol p.a 25,0 mL (10ppm)

1,0 mL (BI

2)+ 2 mL

DPPH+

methanol

p.a ad 10,0

mL

2,0 mL (BI

2)+ 2 mL

DPPH+

methanol p.a

ad 10,0 mL

3,0 mL (BI

2)+ 2 mL

DPPH+

methanol p.a

ad 10,0 mL

4,0 mL (BI

2) + 2 mL

DPPH+

methanol p.a

ad 10,0 mL

5,0 mL (BI

2) + 2 mL

DPPH+

methanol

p.a ad 10,0

mL

34

4.7.2 Uji Antioksidan Krim Ekstrak Etanol Bunga Marigold

4.7.2.1 Pembuatan Larutan DPPH 200 ppm

Ditimbang sebanyak 20 mg DPPH, BM (394,32 g/mol). Dilarutkan dengan

methanol P.A ad 100,0 mL, kemudian ditempatkan pada botol gelap. Cara

pembuatan larutan DPPH 200 ppm dapat dilihat pada gambar skema alir dibawah

ini.

Gambar 4. 7 Skema Cara Pembuatan Larutan DPPH 200 ppm

4.7.2.2 Pembuatan Larutan Blanko

Dipipet 2 mL larutan DPPH 200 ppm, dimasukkan kedalam labu ukur 10,0

mL, ditambahkan methanol ad 10,0 mL. kemudian dikocok ad homogen. Cara

pembuatan larutan blanko dapat dilihat pada gambar skema alir dibawah ini

Gambar 4. 8 Skema Cara Pembuatan Larutan Blanko

Timbang DPPH 20 mg + methanol p.a 100,0 mL

Larutkan ad homogen

Botol gelap

2,0 mL larutan DPPH (200 ppm) + methanol p.a ad 10mL

Masukkan dalam labu ukur 10,0mL

Kocok ad homogen

35

2 gram (F1), 1 gram (F2), 0,5 gram (F3) krim etanol ekstrak bunga marigold +

methanol p.a ad 100,0 ml

Dihomogenkan dengan ultrasonik selama 30 menit

BI2 1,0 ml

+ 2,0 ml

DPPH +

methanol

p.a ad 10,0

ml

BI2 2,0 ml

+ 2,0 ml

DPPH +

methanol

p.a ad

10,0 ml

BI2 4,0 ml

+ 2,0 ml

DPPH +

methanol

p.a ad

10,0 ml

BI2 8,0 ml

+ 2,0 ml

DPPH

4.7.2.3 Pembuatan Larutan Uji Krim Ekstrak Etanol Bunga Marigold

Sampel sediaan krim ditimbang sebanyak 2 gram untuk formula 1, 1 gram

untuk formula 2, 0,5 gram untuk formula 3 dimasukkan ke dalam masing-masing

lab ukur 100,0 mL, kemudian ditabahkan methanol p.a ad 100,0 mL. Setelah itu

dihomogenkan dengan ultrasonik selama 30 menit. Kemudian hasil dari ultrasonik

disaring dengan kertas saring dan ditampung filtratnya. Selanjutnya disiapkan 5

buah labu ukur 10,0 mL, Larutan Baku Induk dipipet sejumlah volume tertentu

yaitu 0,5 mL, 1,0 mL, 2,0 mL, 4,0 mL, dan 8,0 mL lalu ditambahkan dpph (200

ppm) sebanyak 2,0 mL, selanjutnya ditambahkan methanol p.a sampai dengan

tanda.

Gambar 4. 9 Skema Cara Pembuatan Larutan Uji Ekstrak Etanol Bunga

Marigold

4.7.2.5 Proses Inkubasi

Setelah selesai pembuatan larutan blanko, lakutan uji, larutan baku kerja,

dan larutan kontrol positif, maka semua larutan tersebut di inkubasi pada suhu

ruang selama 30 menit (Chivde et al., 2011).

4.7.2.6 Proses Pengukuran Absorbansi

Larutan di ukur serapannya menggunakan spektrofotometer Uv- Vis

dengan panjang gelombang 515- 520nm atau sesuai dengan panajang gelombang

BI2 1,0 ml

+ 2,0 ml

DPPH +

methanol

p.a ad 10,0

ml

36

yang didapatkan. Lalu aktivitas penangkal radikal bebas dihitung sebagai

presentase berkurangnya DPPH dengan menggunakan rumus: IC50

% Inhibisi

Dari harga persen penangkal radikal bebas yang diperoleh, dibuat kurva

antara persen penangkal radikal bebas terhadap konsentrasi larutan uji. Dari

persamaan regresi linier tersebut dapat ditentukan nilai IC50 yaitu konsentrasi

inhibisi larutan uji yang mampu menangkal 50% radikal bebas, dalam penelitian

ini dilakukan uji analisa menggunakan probit log (Anugrawati, 2016).

4.8 Analisis Data

Analisis Data sediaan krim eksrak etanol bunga Marigold dilakukan dengan

program SPSS menggunakan One-way Anova. Dari data yang didapatkan

dilakukan analisa statistika dengan derajat kepercayaan α = 0,05. Untuk

mengatahui formula mana yang menunjukkan perbedaan bermakna.