33

BAB 4

METODE PENELITIAN

4.1 Rancangan Penelitian

Penelitian ini menggunakan metode true eksperimental laboratory with

randomized post test only controlled group design secara in vivo yang bertujuan

untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak etanolik kulit buah manggis

terhadap perubahan ketebalan Perivascular Adipose Tissue (PVAT) pada tikus

Rattus Novergicus Strain Wistar yang diberikan High Fat Diet (HFD). Dalam

penelitian ini, intervensi yang dilakukan berupa pemberian HFD dan pemberian

ekstrak kulit manggis (EKM) dengan dosis 200 mg/kgBB, 400 mg/kgBB dan 800

mg/kgBB. ( Wihastuti, 2015)

4.2 Variabel Penelitian

4.2.1 Variabel Bebas

Variabel bebas dalam penelitian ini adalah ekstrak etanolik kulit buah

manggis.

4.2.2 Variabel Terikat

Variabel terikat pada penelitian ini adalah ketebalan PVAT.

4.3 Sampel Penelitian

34

Sampel penelitian berupa Tikus Rattus Novergicus strain Wistar . Untuk

mendapatkan data yang valid, banyak pengulangan ditentukan dengan Rumus

Federer :

t : jumlah kelompok perlakuan

r : jumlah pengulangan

Pada penelitian ini, terdapat lima jumlah perlakuan. Berikut ini adalah

pembagian kelompok perlakuan:

1. Kontrol negatif (KN) : tikus sehat dengan diet normal selama 3 bulan.

2. Kontrol positif (KP) : tikus dengan pemberian HFD selama 3 bulan.

3. EKM 1 : tikus dengan pemberian HFD selama 1 bulan dan

dilanjutkan Ekstrak Etanolik Kulit Manggis 200

mg/kgBB selama 2 bulan.

4. EKM 2 : tikus dengan pemberian HFD selama 3 bulan dan

dilanjutkan Ekstrak Etanolik Kulit Manggis 400

mg/kgBB selama 2 bulan.

5. EKM 3 : tikus dengan pemberian HFD selama 3 bulan dan

dilanjutkan Ekstrak Etanolik Kulit Manggis 800

mg/kgBB selama 2 bulan.

Sehingga perhitungan jumlah pengulangan yang dilakukan adalah

Dari rumus diatas, didapatkan hasil pengulangan yang digunakan untuk

masing-masing kelompok sebanyak 5 atau lebih. Sehingga penelitian ini

menggunakan 25 ekor Tikus Rattus Novergicus strain Wistar.

(t-1) (r-1) ≥ 15

(t-1) (r-1) ≥ 15

(5-1) (r-1) > 15

r > 4,75 ≈ 5

35

4.4 Tempat dan Waktu Penelitian

Pemeliharaan dan perlakuan hewan coba dilakukan di Laboratorium

Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang. Pengamatan

serta pengukuran ketebalan PVAT dilakukan di Laboratorium Patologi Anatomi

Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang.

4.5 Alat dan Bahan Penelitian

4.5.1 Alat dan Bahan untuk Pemeliharaan Hewan Coba

Alat dan bahan yang digunakan adalah:

1. Kandang tikus untuk subjek penelitian

2. Neraca elektronik untuk menimbang sisa pakan

3. Sekam

4. Botol minum tikus

4.5.2 Alat dan Bahan untuk Pembuatan Diet Normal

Alat dan bahan yang digunakan adalah:

1. Neraca elektronik

2. Pakan standar tikus

4.5.3 Alat dan Bahan untuk Pembuatan HFD

Alat dan bahan yang digunakan adalah:

1. Neraca elektronik

2. Baskom

3. PARS 62%

36

4. Tepung terigu 20%

5. Kolesterol 1%

6. Asam kolat 0,2%

7. Kurvet 16,8%

4.5.4 Alat dan Bahan untuk Ekstraksi Kulit Manggis

Alat dan bahan yang digunakan adalah:

1. Kulit manggis kering

2. Metanol

3. Blender kering

4. Kertas saring

5. Beker glass

6. Oven timbangan analitik

7. Alat sekker

8. Erlemeyer

9. Alat evaporasi

4.5.5 Alat dan Bahan untuk Pembedahan Tikus

Alat dan bahan yang digunakan adalah:

1. Spuit untuk anastesi

2. Ketamin (anastesi)

3. Papan bedah

4. Jarum pentul untuk memfiksasi tikus dipapan bedah

5. Gunting bedah untuk membedah tikus

6. Pinset untuk membantu pembedahan

37

7. Kapas

8. Botol organ

9. Spidol marker

10. Wadah untuk mencuci organ tikus

11. Larutan PBS untuk mencuci organ tikus

12. Formalin 10%

4.5.6 Alat dan Bahan untuk Pembuatan Preparat Aorta

1. Mesin Tissue Tex Processor

2. Microtome

3. Slide

4. Cover glass

4.5.7 Alat dan Bahan untuk Pengukuran Ketebalan PVAT

Alat dan bahan yang digunakan adalah:

1. Preparat aorta

2. Pewarnaan HE (Hematoxilen Eosin)

3. Mikroskop

4. Komputer dengan software scan dotslide olyvia

4.6 Definisi Operasional

1. Pemberian High Fat Diet (HFD)

Perlakuan pemberian pakan dengan penambahan kolesterol 2%, asam kolat

0,2%, dan minyak babi 5% yang diberikan setiap hari 30 gram secara ad

libitum (Murwani, 2006).

38

2. Ekstrak etanolik kulit manggis

Ekstrak etanolik kulit manggis merupakan hasil dari proses ekstraksi kulit

manggis dengan pelarut etanol. Ekstrak kulit manggis diberikan bersamaan

dengan pemberian HFD. Dosis pemberian ekstrak kulit manggis adalah 200

mg/kg BB, 400 mg/kg BB dan 800 mg/kg BB dan diberikan selama 2 bulan

setelah pemberian HFD selama 1 bulan.

3. Perivascular Adipose Tissue (PVAT)

Perivascular adipocyte tissue (PVAT) adalah jaringan adiposit yang

mengelilingi pembuluh darah. Ketebalan dari PVAT berhubungan dengan

parameter sindroma metabolik seperti perbesaran lingkar pinggang,

hipertrigliseridemia, hiperglikemia dan pembentukan plak aterosklerotik.

Pengukuran rata-rata ketebalan PVAT dilakukan dengan cara mengukur

pada ketebalan terendah, sedang, dan tertinggi. Pengukuran dilakuakan

dengan menggunakan software scan dot slide olyvia di Laboratorim Patoloigi

Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya.

39

4.7 Prosedur Penelitian

Pengajuan Ethical Clearance ke Komisi Etik Penelitian Kesehatan (KEPK) FKUB, pembelian

alat dan bahan penelitian, serta pengurusan administrasi laboratorium.

Pembelian tikus Rattus Novergicus strain Wistar sebanyak 25 ekor

Pengecekan tikus dan aklimatisasi tikus selama 2 minggu

Pengelompokan tikus menjadi 5 kelompok berdasarkan simple random sampling

Kontrol

negatif

(dengan

diet

normal)

Kontrol

Positif

(dengan

HFD)

Kelompok

HFD + EKM

200 mg/kgBB

Kelompok

HFD + EKM

400 mg/kgBB

Kelompok

HFD + EKM

800 mg/kgBB

Pembedahan dan pengambilan profil lipid

Pembuatan preparat aorta, Pewarnaan dengan HE dan Pengukuran Ketebalan PVAT

Analisis Data

Perlakuan selama 3 bulan

Gambar 4.1 Alur penelitian

40

4.7.1 Pengurusan Administrasi

Langkah awal yang dilakukan dalam penelitian ini adalah mengurus

kelayakan etik (ethical clearance) yang meliputi proposal penelitian dan

pengajuan formulir layak etik. Bersamaan dengan itu, dilakukan juga

pendaftaran laboratorium serta pembelian alat dan bahan untuk perawatan tikus.

4.7.2 Persiapan Hewan Coba

Proses aklimatisasi tikus dilakukan selama 2 minggu di laboratorium

farmakologi FKUB. Selama proses aklimatisasi ini, semua tikus diberikan normal

diet dengan pakan standard sekali selama 24 jam dan kemudian diganti pada

hari berikutnya. Berat pakan standard masing-masing 30 gram. Setelah masa

aklimatisasi selesai, dilakukan pengelompokan hewan coba sesuai dengan

kelompok perlakuan.

4.7.3 Pembagian Kelompok Perlakuan

Terdapat 5 kelompok perlakuan dalam penelitian ini. Kelompok kontrol

negatif yaitu tikus sehat dengan diet normal selama 3 bulan, lalu kelompok

kontrol positif yaitu tikus sehat dengan pemberian HFD (high fat diet) selama 3

bulan. Lalu tikus kelompok 1, 2, dan 3 diberikan HFD dan Ekstrak Kulit Manggis

dengan berbagai dosis, 200 mg/kgBB, 400 mg/kgBB, dan 800 mg/kgBB selama 3

bulan dengan sonde.

4.7.4 Pemberian Pakan dan Pembuatan Tikus Model Aterosklerosis

Pemberian pakan tikus sesuai dengan kelompok perlakuan. Kelompok

negatif tetap diberikan normal diet yang sama dengan pakan selama masa

aklimatisasi. Kelompok dengan HFD diberikan perlakuan pemberian pakan

41

dengan penambahan kolesterol 2%, asam kolat 0,2%, dan minyak babi 5% yang

diberikan setiap hari 30 gram secara ad libitum.

4.7.5 Prosedur Ekstraksi Kulit Manggis

Kulit manggis dicuci bersih sebelum dikeringkan, Potong kecil-kecil

kemudian dioven dengan suhu 80 derajat atau dengan panas matahari sampai

kering ( bebas kandungan air). Setelah kering dihaluskan dengan blender

sampai halus. Timbang sebanyak 100 gram sampel kering (kulit manggis) ke

dalam gelas erlenmeyer ukuran 1 liter, Kemudian rendam dengan etanol sampai

volume 1000 ml, Kocok sampai benar-benar tercampur (± 30 menit), Didiamkan

1 malam sampai mengendap. Ambil lapisan atas campuran etanol dengan zat

aktif yang sudah terambil, Masukan dalam labu evaporasi 1 liter. Pasang labu

evaporasi pada evaporator, Isi water bath dengan air sampai penuh, Pasang

semua rangkaian alat termasuk rotary evaporator, pemanas water bath ( atur

sampai 90 derajat), sambungkan dengan aliran listrik, Biarkan larutan etanol

memisah dengan zat aktif yang sudah ada dalam labu, Tunggu sampai aliran

etanol berhenti menetes pada labu penampung (± 1,5 sampai 2 jam untuk 1

labu), Hasil yang diperoleh kira-kira 1/3 dari bahan alam kering, Masukan hasil

ekstraksi dalam botol plastik, Simpan dalam freezer.

4.7.6 Pembedahan Hewan Coba

Pembedahan tikus dilakukan setelah 2 bulan pemberian EKM.

Pembedahan dilakukan setelah hewan coba diberikan anastesi ketamin. Setelah

itu, tikus ditaruh di tempat pembedahan dan difiksasi keempat kaki tikus dengan

menggunakan jarum. Kemudian dilakukan pembedahan tikus dan diambil aorta

42

nya. Aorta lalu ditaruh dalam botol organ dan diawetkan dengan menggunakan

formalin 10%.

4.7.7 Pembuatan Parafin Blok

Setiap jaringan harus menjadi smear atau section terlebih dahulu sebelum

dilihat di bawah mikroskop karena identifikasi hubungan suatu penyakit dan

perubahan terhadap histopatologi dilakukan dengan melihat sediaan jaringan

dibawah mikroskop. Section merupakan pemotongan jaringan menjadi berukuran

mikro kemudian diwarnai untuk bisa di lihat di bawah mikroskop. Parafin blok

merupakan proses awal pembuatan sediaan. Untuk membersihkan dari

kontaminan, jaringan dicuci dengan PBS 3-5x. Lalu difiksasi pada formalin 10%.

Kemudian dehidrasi masing-masing selama 60 menit menggunakan alkohol

bertingkat (30%, 50%, 70%, 80%, 96%, dan absolut). Clearing menggunakan

xilol 2x masing-masing selama 60 menit. Setelah itu dilakukan infiltrasi selama 60

menit dengan parafin lunak pada suhu 48 derajat celcius. Lakukan block dalam

parafin keras, pada cetakan, didiamkan selama 1 hari. Lalu keesokan hari

ditempelkan pada holder dan dipotong setebal 4-6 µm dengan rotary microtome.

Dilakukan mounting dengan gelatin 5% pada gelas objek. Selanjutnya dilakukan

proses deparafinasi. Gelas obyek dari Parafin Block direndam di dalam Xilol 2x

masing-masing selama 5 menit. Kemudian dilakukan rehidrasi masing-masing

selama 5 menit menggunakan alkohol berseri (Absolut, 96%, 80%, 70%, 50%dan

30%). Pada tahap terakhir slide dicuci dengan PBS pH 7,4 selama 5 menit. Lalu

diwarnai dengan Hematoxilen selama 10 menit. Kemudian selama 10 menit

direndam di dalam tap water lalu dibilas dengan H2O. Dilakukan dehidrasi

dengan alkohol berseri (30% dan 50%) masing-masing selama 5 menit.

43

Selanjutnya selama 3 menit diwarnai dengan larutan eosin. Selanjutnya dibilas

dengan alkohol 30%. Dicuci dengan H20 selama 5 menit dan dikering anginkan.

Setelah itu dilakukan mounting dan tutup dengan cover glass (Chandra et al.

2014).

4.7.8 Pembuatan Preparat Aorta

Sampel yang diambil adalah potongan arkus aorta tikus. Aorta yang telah

diambil dari tikus kemudian dipotong dengan ketebalan ± 2-3 mm dan kemudian

dimasukkan kedalam formalin 10% untuk difiksasi. Jaringan yang telah difiksasi

kemudian diproses dengan menggunakan alat tissue tex processor, kemudian di

blok dengan paraffin untuk selanjutnya dipotong dengan mesin microtome

dengan ketebalan 3-5 mikron. Kemudian ditaruh dalam oven selama 1-2 jam

dengan suhu 600C, lalu dimasukkan ke dalam larutan xylol selama 15 menit,

alkohol 96% selama 3 menit, dan kemudian dicuci bersih denganair mengalir

selama 10 menit. Jaringan kemudian siap untuk diberi cat utama yaitu

Hematioxilin Eosin selama 10-15 menit. Lalu dicuci kembali dengan air mengalir

selama 15 menit. Masukkan ke dalam alkohol asam 1% sebanyak 2-5 celup ,

lalu ke dalam amoniak air 3-5 celup. Setelah itu diberi cat pembanding yaitu

eosin 1% selama 15 menit. Selanjutnya dilakukan proses dehidrasi dengan

memasukkan ke dalam alkohol 80% selama 3 menit, alkohol 96% selama 3

menit, dan alkohol 96% selama 3 menit, kemudian dilakukan penjernihan dengan

larutan xylol selama 15 menit sebanyak 2 kali, lalu mounting dengan entelan dan

deck glass. Preparat siap digunakan.

44

4.7.9 Pengukuran Ketebalan PVAT

Ketebalan PVAT diukur dengan melakukan pengamatan pada preparat

aorta. Preparat aorta discan terlebih dahulu dengan menggunakan mikroskop

dengan pembesaran 400x, kemudian dilihat dan diukur dengan menggunakan

software Scan Dot Slide Olyvia pada komputer. Ketebalan PVAT pada setiap

sampel diukur sebanyak tiga kali dengan mengukur pada ketebalan terendah,

sedang, dan tertinggi. Ketiga pengukuran tersebut kemudian dibagi tiga,

sehingga didapatkan rata-rata ketebalan PVAT. Kemudian, pengukuran

ketebalan PVAT harus tegak lurus dengan tunika media pembuluh darah.

Pengukuran PVAT pada penelitian ini dilakukan dengan cara double blind, yaitu

dengan dihitung lebih dari dua pemeriksa, sehingga dapat dipastikan hasilnya

adalah objektif.

Keterangan:

P (min) : Ketebalan PVAT terendah (µm)

P (med) : Ketebalan PVAT sedang (µm)

P (max) : Ketebalan PVAT tertinggi (µm)

𝑅𝑎𝑡𝑎 − 𝑟𝑎𝑡𝑎 𝐾𝑒𝑡𝑒𝑏𝑎𝑙𝑎𝑛 𝑃𝑉𝐴𝑇 =𝑃 𝑚𝑖𝑛 + 𝑃 𝑚𝑒𝑑 + 𝑃 𝑚𝑎𝑥

3

T. Media Pembuluh Darah

PVA

x

Gambar 4.2

Skema cara Pengukuran Ketebalan PVAT

Pengukuran menggunakan garis tarik (x) yang

tegak lurus dengan penampang tunika media

pembuluh darah aorta (Heriansyah et al. 2015)

45

4.8 Pengolahan Data

Data dari hasil penelitian ini disajikan dalam bentuk ±SD. Lalu data

dianalisis dengan statistik parametric menggunakan SPSS (Software Statistical

Product and Service Solution) versi 16 dengan tingkat signifikansi 0.05 (p =0.05)

dan taraf kepercayaan 95% (α = 0.05). Berikut langkah-langkah uji hipotesis

komparatif dan korelatif:

4.8.1 Uji Normalitas (dengan menggunakan Shapiro-Wilk)

Uji normalitas digunakan untuk menginterpretasikan apakah suatu data

memilki persebaran data yang normal atau tidak. Hal ini dikarenakan

pemilihan penyajian data dan uji hipotesis tergantung dari normal tidaknya

distribusi data. Untuk penyajian data yang terdistribusi normal, ukuran

pemusatan dan penyebaran menggunakan mean dan standar deviasi.

Sedangkan untuk penyajian data yang tidak terdistribusi normal, ukuran

pemusatan dan penyebaran menggunakan median dan minimum-

maksimum. Lalu untuk melakukan uji hipotesis, jika persebaran data normal,

maka digunakan uji parametrik. Sedangkan jika persebaran data tidak

normal, maka digunakan uji non parametrik.

Penelitian ini menggunakan uji normalitas Shapiro-Wilk. Hal ini karena

jumlah sampel yang digunakan dalam penelitian ini kurang dari 50 (n ≤ 50)

dan uji Shapiro-Wilk akan lebih akurat jika jumlah sampel kurang dari 50.

4.8.2 Uji Homogenitas (mengguakan Levene)

Uji homogenitas digunakan untuk menguji berlaku atau tidaknya asumsi

ANOVA, yaitu apakah data yang diperoleh dari setiap perlakuan memiliki

46

varian yang homogen atau tidak. Suatu data dikatakan memiliki varian yang

homogen bila memiliki nilai signifikansi lebih dari 0.05 (p ≥ 0.05).

Penelitian ini menggunakan uji homogenitas Levene. Dan apabila

penelitian ini memiliki varian yang homogen maka analisa dapat dilanjutkan

dengan uji ANOVA.

4.8.3 Uji One Way ANOVA

Uji One Way ANOVA merupakan uji hipotesis komperatif numerik lebih

dari dua kelompok perlakuan tidak berpasangan berdistribusi normal. Uji ini

bertujuan untuk mengetahui pengaruh perlakuan yang berbeda terhadap

rata-rata ketebalan PVAT. Perbedaan rata-rata ketebalan PVAT dinyatakan

bermakna apabila nilai signifikansi kurang dari 0.05 ( p < 0.05)