10

BAB II

KAJIAN PUSTAKA

2.1 Tinjauan Botani Terong Belanda (Solanum betaceum Cav.)

2.1.1 Klasifikasi terong belanda

Terong belanda memiliki nama yang berbeda di setiap negara. Di

Indonesia terong belanda sering dikenal dengan sebutan tamarillo (Melayu), tiung

(Toba), dan tiung jepan (Karo). Untuk sebutan terong belanda di negara lain

seperti tree tomato (Inggris), tomate dulce (Ekuador), pepino de arbol (Kolombia),

Tamarillo (New Zealand), dan tomate frances (Venezuella) (Kumalaningsih dan

Suprayogi, 2006).

Nama ilmiah terong belanda adalah Solanum betaceum Cav yang memiliki

sinonim Cyphomandra betacea Cav. Identifikasi taksonomi tanaman terong

belanda menurut Kumalaningsih, (2006) sebagai berikut:

Kingdom : Plantae

Divisi : Spermatophyta

Sub divisi : Angiospermae

Klass : Dicotyledoneae

Ordo : Solanales

Bangsa : Solanaceae

Marga : Solanum

Jenis : Solanum betaceum Cav.

Terong belanda (Solanum betaceum Cav), ditinjau dari aspek

fungsionalnya, mempunyai khasiat yang sangat unggul sebagai sumber

11

antioksidan alami untuk meluruhkan zat radikal. Terong belanda merupakan buah

yang mempunyai kandungan gizi dan vitamin yang sangat penting bagi kesehatan

tubuh manusia seperti antosianin, karotenoid, vitamin A, B6, C, dan E, serta kaya

akan zat besi, kalium, serat, dan mineral (kumalaningsih, 2006).

Gambar 2.1

Terong belanda (Solanum betaceum Cav)

(Kumalaningsih dan Suprayogi, 2006)

2.1.2 Ekologi dan penyebaran tanaman

Terong belanda (Solanum betaceum Cav) merupakan tanaman jenis

terung-terungan dari famili Solanaceae yang sangat populer di New Zealand.

Tanaman ini berasal dari pegunungan Andes di Peru, juga tumbuh di Chile,

Equador dan Bolivia kemudian masuk ke negara Indonesia dan dikembangkan

antara lain di Bali, Bogor Jawa Barat, serta daerah Barastagi Kabupaten Karo

Sumatera Utara. Terong belanda termasuk tanaman subtropis yang dapat tumbuh

subur pada suatu daerah dengan ketinggian antara 1.525-3.050-meter diatas

permukaan laut dengan suhu berkisar antara 20-27 oC (Morton, 1997).

12

2.1.3 Morfologi terong belanda

Terong belanda merupakan jenis tanaman semak atau berupa pohon perdu

yang lapuk, tinggi batang sekitar 2-3 m dengan diameter 4 cm, bentuk batang

bulat dengan pangkal batang yang pendek, dan bercabang lebat. Bunga berada

dalam rangkaian kecil di ketiak daun, dekat ujung cabang, berwarna merah jambu

sampai biru muda, harum, berdiameter kira-kira 1 cm. Tanaman ini memiliki daun

yang berbulu berbentuk hati besar dan berwarna hijau (Kumalaningsih, 2006).

Terong belanda tergolong buah buni (buah berdaging basah, tidak

merekah, biji-bijinya terbenam dalam daging buah) yang berbentuk oval (bulat

lonjong) dengan ukuran panjang antara 4-10 cm dan berdiameter 3-5 cm. Kulit

buah yang masih mentah berwarna hijau keabuan dan akan menjadi merah

keunguan atau kuning pada saat buah tersebut masak. Di dalam buah terdapat

daging buah yang tebal berwarna kekuningan dan melindungi biji-bijinya serta

dibungkus oleh selaput tipis yang mudah dikelupas. Jumlah bijinya banyak dan

tersusun melingkar dengan ukuran yang kecil, berbentuk pipih, tipis, keras, dan

berwarna coklat muda sampai hitam (Kumalaningsih, 2006). Terong belanda

secara umum terdiri dari dua jenis yaitu terong belanda merah dan terong

belanda kuning (Mertz et al., 2009).

2.1.4 Kandungan kimia

Terong belanda termasuk ke dalam suku Solanaceae. Umumnya suku ini

menghasilkan alkaloid, steroid, antosianin, biasanya tidak bertanin. Komponen

antioksidan yang dimiliki oleh terong belanda merah dan kuning (bagian daging

dan biji) terdiri dari vitamin C, vitamin E, karotenoid, serta kandungan senyawa

13

fenolik seperti antosianin, asam fenolat dan sejumlah kecil flavonol (Lister et al.,

2005).

Buah terong belanda diketahui mengandung kalium. Kalium dalam tubuh

ditemukan di dalam darah yang diketahui baik untuk mencegah tekanan darah

tinggi. Selain mengandung magnesium dan kalium, terong belanda juga

mengandung kalsium, fosfor, natrium dan seng. Tabel 2.1 menunjukkan

komposisi zat kimia dalam 100-gram buah terong belanda segar.

Tabel 2.1

Kandungan kimia dalam 100 g buah terong belanda segar

(Kumalaningsih, 2006; Lister et al., 2005).

Komponen Komposisi

Vitamin A

Vitamin B1

Vitamin B2

Vitamin B6

Vitamin C

Vitamin E

Karoten

Karbohidrat

Protein

Lemak

Serat

Niasin

Kalium

Kalsium

Magnesium

Besi

Seng

Fosfor

Kadar air

Kadar abu

540-5600 μg

0,03-0,14 mg

0,01-0,05 mg

0,01-0,05 mg

15-42 mg

2 mg

0,371-0,653 mg

10,3 g

1,4-2 mg

0,1-0,6 mg

1,4-4,7 mg

0,3-1,4 mg

0,28-0,38 mg

6-18 mg

16-25 mg

0,3-0,9 mg

0,1-0,2 mg

22-65 mg

80-90 g

0,66-0,94 mg

14

2.1.5 Kegunaan

Secara tradisional buah terong belanda digunakan sebagai obat untuk

memperlancar air seni, menurunkan kadar kolesterol, dan reumatik (Syariah et al.,

2011). Apabila dikonsumsi sebanyak 3 buah setiap hari, buah terong belanda

berkhasiat sebagai obat tekanan darah tinggi (Departemen Kesehatan dan

Kesehatan Sosial, 2001). Kandungan antosianin, vitamin serta zat gizi lain dalam

buah terong belanda bekerja sinergis untuk mencegah kerusakan sel-sel jaringan

tubuh penyebab penyakit, melancarkan penyumbatan pembuluh darah,

meningkatkan stamina, daya tahan tubuh dan vitalitas, serta membantu proses

penyembuhan (Kumalaningsih, 2006). Menurut Ordonez et al., (2006), buah

terong belanda memiliki aktivitas antimikroba. Selain itu berdasarkan penelitian

yang dilakukan oleh Ordonez et al, (2010) diketahui bahwa jus buah terong

belanda menunjukkan aktivitas antioksidan.

2.2 Oksidan dan Radikal Bebas

Oksidan adalah molekul oksigen atau molekul lain yang mengandung 1 atau

lebih elektron yang tidak berpasangan (unpaired electrons) sehingga tidak stabil

Oksidan dapat mengganggu integritas sel karena dapat bereaksi dengan

komponen-komponen sel yang penting untuk mempertahankan kehidupan sel,

baik komponen struktural (misalnya molekul-molekul penyusun membran)

maupun komponen-komponen fungsional (misalnya enzim-enzim dan DNA).

Oksidan dalam pengertian ilmu kimia, adalah senyawa penerima elektron,

(electron acceptor), yaitu senyawa-senyawa yang dapat menarik elektron (Winarsi,

2007). Ion ferri (Fe+++), misalnya, adalah suatu oksidan :

15

Fe+++ + e- ⎯→ Fe++

Sebaliknya, dalam pengertian ilmu kimia, radikal bebas merupakan suatu atom,

gugus atau molekul yang memiliki satu elektron atau lebih yang tidak

berpasangan (unpaired electron) pada orbital terluarnya sehingga mampu

menyerang senyawa-senyawa lain seperti DNA, membran lipid dan protein.

Radikal bebas merebut elektron dari molekul lain yang berada di sekitarnya agar

stabil sehingga seringkali menjadi penyebab terjadinya kerusakan sel, kerusakan

jaringan dan proses penuaan (Kothari et al., 2010). Secara kimiawi, radikal bebas

bersifat sangat aktif karena adanya elektron tidak berpasangan. Radikal bebas

dapat berupa kation (bermuatan positif), anion (bermuatan negatif) atau tidak

bermuatan (Halliwell and Gutteridge, 2000).

Berdasarkan sumbernya, radikal bebas dapat berasal dari proses

metabolisme dalam tubuh (internal) dan dapat berasal dari luar tubuh (eksternal)

yang disajikan pada Tabel 2.2.

Tabel 2.2

Sumber radikal bebas (Esti, 2012)

Sumber Internal Sumber Eksternal

Mitokondria Rokok

Fagosit Polutan lingkungan

Xantin oksidase Radiasi

Olah raga Obat-obatan tertentu

Peradangan Pestisida

Iskemia/reperfusi Larutan industri

Ozon

Radikal bebas yang berasal dari dalam tubuh diantaranya superoksida (O2•),

hidroksil (•OH), peroksil (ROO•), hidrogen peroksida (H2O2), singlet oksigen

16

(1O2), oksida nitrit (NO•) dan peroksinitrit (ONOO•). Radikal bebas yang berasal

dari luar tubuh antara lain berasal dari asap rokok, polusi, radiasi, sinar UV, obat,

pestisida, limbah industri dan ozon (Siswono, 2005).

Gambar 2.2

Sumber sumber radikal bebas yang menyerang DNA

(vasudevan, 2004)

Pada umumnya radikal bebas memiliki efek yang sangat menguntungkan

karena dapat membantu destruksi sel-sel mikroorganisme dan kanker. Akan

tetapi, produksi radikal bebas yang berlebihan yang tidak disertai dengan produksi

antioksidan yang memadai dapat menyebabkan kerusakan sel-sel jaringan dan

mengganggu kerja enzim. Kerusakan jaringan dapat terjadi akibat gangguan

oksidatif yang disebabkan oleh radikal bebas asam lemak yang dikenal dengan

sebutan peroksidasi lipid. Aktivitas radikal bebas dapat menjadi penyebab atau

mendasari berbagai keadaan patologis. Diantara senyawa-senyawa oksigen

reaktif, radikal bebas (•OH) merupakan senyawa yang paling berbahaya karena

17

memiliki tingkat reaktivitas yang sangat tinggi. Keberadaan radikal hidroksil

dalam tubuh dapat merusak tiga jenis senyawa penting yang berfungsi untuk

mempertahankan integritas sel yaitu:

• Asam lemak tak jenuh jamak (PUFA) yang merupakan senyawa penting

fosfolipid yang menyusun membran sel.

• DNA yang merupakan materi genetik dari sel.

• Protein yang berperan penting seperti enzim, reseptor, antibodi, pembentuk

matriks dan sitoskeleton (Halliwell and Gutteridge, 2000; Papas, 1999).

Regulasi jumlah radikal bebas secara normal dalam sistem biologis tubuh

dilakukan oleh enzim-enzim antioksidan endogenous seperti superoksida

dismutase (SOD), glutation peroksidase (GPx) dan katalase (Cat). Pengukuran

radikal bebas di dalam tubuh sangat sulit dilakukan karena radikal bebas mampu

bereaksi sangat cepat sehingga seringkali dilakukan pengukuran secara tidak

langsung melalui produk turunannya seperti MDA atau 4-hidroksinonenal. Kedua

senyawa tersebut seringkali digunakan sebagai pengukuran reaksi radikal bebas

lipid (Belleville-Nabet, 1996).

2.3 Produksi Radikal Bebas Akibat Aktivitas Fisik

Salah satu pemicu timbulnya radikal bebas adalah aktivitas fisik.

Pembentukan radikal bebas dapat terjadi selama dan setelah proses aktivitas fisik

oleh otot yang berkontraksi serta jaringan yang mengalami iskemik reperfusi

(Chevion, et al., 2003). Terbentuknya radikal bebas diakibatkan oleh otot rangka

yang berkontraksi (Powers and Jackson, 2008). Pada saat melakukan aktivitas

fisik maksimal, konsumsi oksigen tubuh meningkat dengan cepat. Selama

18

melakukan aktivitas fisik maksimal, penggunaan oksigen dapat meningkat hingga

100-200 kali dibandingkan pada saat istirahat (Chevion, et al., 2003). Pada saat

terjadi fosforilasi oksidatif di dalam mitokondria, oksigen direduksi oleh sistem

transport elektron mitokondria dengan tujuan membentuk adenosin trifosfat

(ATP) dan air. Sebanyak 2% molekul oksigen akan berikatan dengan elektron

tunggal yang bocor dari karier elektron pada rantai pernapasan selama proses

fosforilasi oksidatif sehingga membentuk radikal superoksida (O2-•). Kehadiran

radikal superoksida akan membentuk hidrogen peroksida (H2O2) dan hidroksil

reaktif (OH-) yaitu dengan cara berinteraksi dengan logam transisi reaktif seperti

tembaga dan besi.

Proses reduksi oksigen secara lengkap diuraikan oleh Clarkson and

Thompson (2000) sebagai berikut.

1. O2 + e- → O2-• (Radikal superoksida)

2. O2-• + H2O → H2O• + OH- (Radikal hidroperoksil)

3. H2O• + e- + H+ → H2O2 (Hidrogen peroksida)

4. H2O2 + e- → •OH + OH- (Radikal hidroksil)

2.4 Stres Oksidatif

Stres oksidatif merupakan suatu kondisi fisiologis yang terjadi akibat

jumlah radikal bebas yang terbentuk melebihi kapasitas pertahanan antioksidan

yang berpotensi menimbulkan kerusakan pada molekul sel. Kerusakan yang

diakibatkan oleh stres oksidatif seringkali dikenal dengan kerusakan oksidatif,

yaitu kerusakan biomolekul penyusun sel yang timbul akibat reaksi dengan

radikal bebas. Kelebihan radikal bebas ini mengakibatkan intensitas reaksi

19

oksidasi sel-sel normal semakin tinggi dan mengakibatkan kerusakan jaringan sel

akan semakin parah.

Kelebihan radikal bebas juga akibat aktivitas tubuh yang berlebih, puasa

yang berlebih, asap rokok, radiasi dan pencemaran udara. Adanya kejadian seperti

ini akan merangsang pengeluaran sitokin proinflamasi seperti Interleukin-6(IL6)

atau Tumor Nekrosis Faktor-alpha (TNFα) dan memicu pengeluaran PMN

(Polimorfonuklear). PMN inilah yang menghasilkan radikal bebas berupa

superoksida anion, radikal hidroksil, oksida nirat dan hidrogen peroksida yang

merusak jaringan sel seperti pada gingiva, ligamen periodontal dan tulang

alveolar. Hal inilah merupakan awal terjadinya kerusakan oksidatif yang dikenal

sebagai stres oksidatif ( Zheng dan Wang, 2009). Peningkatan stres oksidatif

berpotensi merusak membran lipid sehingga membentuk malondialdehida

(MDA), merusak protein, karbohidrat serta DNA (Kevin, et al., 2006). Kerusakan

oksidatif yang disebabkan oleh radikal bebas berdampak pada berbagai kondisi

patologis, antara lain terjadinya kerusakan sel, jaringan, organ (hati, ginjal, dan

jantung) bahkan dapat berakhir pada kematian sel sehingga memicu munculnya

penyakit degeneratif baik pada manusia maupun hewan. Stres oksidatif dapat

menyebabkan terjadinya penyakit neuro degeneratif, seperti Artherosclerosis,

Parkinson, Alzheimer, serta mempercepat proses penuaan, memicu risiko

terjadinya kanker dan kerusakan sel. Stres oksidatif yang terjadi secara berlebihan

akan menimbulkan efek patologis (Kevin, et al., 2006; Valko, et al., 2007).

Tingkat stres oksidatif dapat diukur dengan beberapa cara antara lain

pengukuran kadar MDA dan aktivitas enzim SOD. Terbentuknya MDA

20

merupakan tanda biologis untuk mengukur tingkat stres oksidatif pada organisme

karena MDA merupakan suatu senyawa toksik yang terbentuk dari hasil akhir

terputusnya rantai karbon asam lemak pada proses peroksidasi lipid (McBridge

and Kraemer,1999). Proses oksidasi lipid merupakan salah satu hasil kerja dari

radikal bebas yang diketahui paling awal dan paling mudah pengukurannya

(Winarsi, 2007). Selain MDA, tingkat stres oksidatif juga dapat diketahui dari

aktivitas SOD karena enzim ini berperan penting dalam sistem pertahanan tubuh,

terutama terhadap aktivitas senyawa oksigen reaktif penyebab stres oksidatif.

2.5 Antioksidan

Antioksidan adalah bahan yang membantu melindungi sel-sel tubuh dari

efek buruk radikal bebas. (Nimse and Pal, 2015). Secara kimia pengertian

senyawa antioksidan adalah senyawa pemberi elektron. Secara biologis pengertian

antioksidan adalah senyawa yang mampu menangkal atau meredam dampak

negatif oksidan dalam tubuh. Antioksidan bekerja dengan memberikan satu

elektronnya kepada senyawa yang bersifat oksidan (Gambar 2.3) sehingga

aktivitas oksidan dapat dihambat (Winarsi, 2007).

Gambar 2.3

Mekanisme kerja aktioksidan menangkal radikal bebas (Winarsi,2007)

21

Antioksidan sebenarnya didefinisikan sebagai inhibitor yang bekerja

menghambat oksidasi dengan cara bereaksi dengan radikal bebas reaktif

membentuk radikal bebas tak reaktif yang relatif stabil. Dalam pengertian kimia,

senyawa-senyawa antioksidan adalah senyawa-senyawa pemberi elektron

(electron donors). Namun dalam arti biologis, pengertian antioksidan lebih luas,

yaitu merupakan senyawa-senyawa yang dapat meredam dampak negatif oksidan,

termasuk enzim-enzim dan protein-protein pengikat logam. Dalam meredam

dampak negatif oksidan diterapkan strategi dua lapis, yaitu:

1. mencegah terhimpunnya senyawa-senyawa oksidan secara berlebihan.

2. Mencegah reaksi rantai berlanjut.

Jika ditinjau dari keterkaitannya dengan penyakit, antioksidan didefinisikan

sebagai senyawa-senyawa yang melindungi sel dari efek berbahaya radikal bebas

atau oksigen reaktif. Antioksidan terbagi menjadi antioksidan enzim dan vitamin.

Antioksidan enzim meliputi superoksida dismutase (SOD), katalase dan glutation

peroksidase (GSH.Prx). Antioksidan vitamin lebih populer sebagai antioksidan

dibandingkan enzim. Antioksidan vitamin mencakup α tokoferol (vitamin E), beta

karoten dan asam askorbat (vitamin C) (Murray, 2009).

Tembaga seng superoksida dismutase (Cu,Zn-SOD) merupakan salah satu

antioksidan endogen yang amat berperan dalam mengkatalisasi radikal bebas

anion superoksida menjadi hidrogen peroksida dan molekul oksigen. Dengan

kemajuan teknik imunositokimia, sel-sel penghasil SOD telah dapat dideteksi

pada jaringan tikus. Profil SOD juga telah dilaporkan secara imunohistokimia

22

pada kondisi patofisiologis seperti stres, diabetes mellitus dan hiperkoleste-

rolemia, serta pada jaringan neoplastik (Wresdiyati et al., 2007).

Apabila tubuh mengalami stres maka kadar radikal bebas dalam tubuh

akan meningkat. Peningkatan kadar radikal bebas dalam kondisi stres tersebut

ditunjukkan dengan menurunnya kandungan antioksidan intrasel seperti

superoksida dismutase (SOD) dan tembaga seng superoksida dismutase (Cu,Zn-

SOD), serta dapat meningkatkan kadar malondialdehid (MDA) pada jaringan hati

tikus di bawah kondisi stres. Pemberian α tokoferol yang merupakan antioksidan

eksogen dapat meningkatkan kandungan SOD dan Cu,Zn-SOD, serta menurunkan

kadar MDA (Wresdiyati et al, 2013).

Berdasarkan mekanisme kerjanya, antioksidan digolongkan menjadi tiga

kelompok, yaitu antioksidan primer, sekunder, dan tersier (Hery, 2007).

a. Antioksidan primer (antioksidan endogenus).

Antioksidan primer atau sering disebut antioksidan enzimatis ini berfungsi

sebagai sistem pertahanan. Antioksidan primer bekerja dengan cara mencegah

pembentukan senyawa radikal bebas baru pada reaksi radikal berantai (reaksi

polimerisasi) melalui mekanisme transfer/pemberian elektron (atom hidrogen)

atau dengan mengubah radikal bebas yang telah terbentuk menjadi molekul yang

kurang reaktif. Contoh antioksidan primer adalah superoksida dismutase (SOD),

glutation peroksidase (GPx) dan katalase. Mekanisme kerja antioksidan primer

dapat dilihat pada Gambar 2.4

23

Gambar 2.4

Mekanisme kerja antioksidan primer (Hery, 2007)

b. Antioksidan sekunder (antioksidan eksogenus).

Antioksidan sekunder disebut juga dengan antioksidan non-enzimatis yang

berfungsi sebagai sistem pertahanan preventif (mencegah). Jenis antioksidan ini

bekerja dengan cara memotong reaksi oksidasi berantai dari radikal bebas atau

dengan cara menangkapnya sehingga radikal bebas tidak akan bereaksi dengan

komponen seluler. Contoh antioksidan sekunder adalah β-karoten, vitamin E dan

vitamin C.

c. Antioksidan Tersier

Kelompok antioksidan ini meliputi sistem enzim DNA-repair dan

metionin sulfoksida reduktase yang berfungsi dalam perbaikan biomolekuler yang

rusak akibat reaktivitas radikal bebas. Berdasarkan sumbernya, antioksidan dapat

digolongkan menjadi dua kelompok yaitu (Trilaksani, 2003):

1. Antioksidan sintetik

Antioksidan sintetik merupakan antioksidan yang diperoleh dari hasil

sintesis reaksi kimia.

24

2. Antioksidan alami

Antioksidan alami merupakan antioksidan yang berasal dari hasil ekstraksi

bahan alami. Peranan antioksidan tidak terlepas dari kandungan nutrien serta

sistem pertahanan antioksidan tersebut dalam tubuh.

2.6 Superoksida Dismutase (SOD)

Superoksida dismutase (SOD) merupakan metaloenzim yang mengandung

atom tembaga, seng atau besi yang dibentuk dalam sitosol atau yang mengandung

mangan yang dibentuk di dalam matriks mitokondria. Superoksida dismutase

berperan sebagai antioksidan intraselular utama dalam sel aerobik. Superoksida

dismutase adalah salah satu antioksidan enzim yang terdapat dalam tiga isoform

di dalam tubuh yang mana masing masing merupakan produk gen yang berbeda

tetapi mengkatalisis reaksi yang sama, yaitu mengubah anion superoksida (O2-)

menjadi hidrogen peroksida dan oksigen seperti ditunjukkan pada reaksi sebagai

berikut:

2H+ + 2O2- H2O2 + O2

Anion superoksida

Keberadaan SOD dapat ditemukan di otak, hati, sel darah merah, ginjal, tiroid,

testis, otot jantung, mukosa lambung, kelenjar pituitari, pankreas dan paru-paru.

(Combs, 1992; Evans, 1991). Ketiga isoform SOD tersebut adalah sitosolik atau

Copper zinc superoxide dismutase (Cu-Zn SOD), mangan SOD (Mn SOD) yang

terletak dalam mitokondria, dan suatu bentuk ekstraseluler dari Cu-Zn SOD (EC-

SOD). Isoform tersebut mempunyai fungsi sangat penting pada pembuluh darah

25

normal maupun penyakit vaskular. Semakin tua usia seseorang, kekuatan SOD

dalam tubuhnya semakin menurun. Selain itu, SOD juga dikendalikan oleh faktor

genetik (Niwa, 1997). Gambaran letak subseluler ketiga isoform SOD ditunjukkan

pada Gambar 2.6 sebagai berikut:

Gambar 2.5

Letak subseluler isoform SOD

(Faraci and Didion, 2004)

2.7 Imunohistokimia dan Cu-Zn-SOD

Imunohistokimia adalah suatu teknik untuk mendeteksi keberadaan

berbagai macam komponen yang terdapat di dalam sel atau jaringan dengan

menggunakan prinsip reaksi ikatan antigen (Ag) dan antibodi (Ab). Teknik

imunohistokimia dapat digunakan untuk mempelajari distribusi enzim spesifik

serta mendeteksi keberadaan berbagai komponen aktif yang terdapat di dalam sel

atau jaringan seperti protein dan karbohidrat (Furuya et al., 2004). Terdapat dua

metode pewarnaan imunohistokimia, yaitu metode langsung (direct) dan metode

tidak langsung (indirect). Metode langsung hanya menggunakan satu antibodi,

yaitu antibodi primer yang telah dilabel. Metode tidak langsung menggunakan dua

antibodi, yaitu antibodi primer tanpa dilabel dan antibodi sekunder yang telah

dilabel (Polak and Van Noorden 2003). Metode tidak langsung pun ada beberapa

26

jenis, diantaranya avidin-biotin methode, peroxidase methode, dan tyramin

amplification methode. Namun metode yang sering digunakan di laboratorium

adalah peroxidase methode, karena 100-1000 kali lebih sensitif dibandingkan

metode lainnya (Ramos and Vara 2005).

Prinsip pewarnaan imunohistokimia metode peroksidase, yaitu antigen yang

ada pada jaringan diikatkan dengan antibodi primer yang spesifik. Lalu antibodi

primer yang terikat antigen kemudian diikatkan pula dengan antibodi sekunder

(antiantibodi primer) yang telah dilabel enzim peroksidase. Penambahan substrat

yang berisi kromogen dan H2O2 akan memunculkan endapan berwarna coklat dan

H2O. Endapan coklat merupakan hasil penguraian substrat (kromogen dan H2O2)

oleh enzim peroksidase (Gambar 2.6). Warna coklat yang muncul menandakan reaksi

positif (+), yang artinya di dalam jaringan terdapat antigen. Apabila di jaringan

tersebut tidak terdapat antigen, maka tidak akan muncul warna coklat (Ramos and

Vara ,2005).

Gambar 2.6

Prinsip pewarnaan imunohistokimia metode peroksidase.(Ramos and Vara, 2005)

Teknik imunohistokimia yang digunakan pada penelitian ini bertujuan untuk

mendeteksi kandungan enzim antioksidan tembaga seng superoksida dismutase

27

(Cu-ZnSOD) yang terdapat di dalam jaringan hati. Enzim SOD merupakan enzim

antioksidan endogen yang mempunyai peranan penting secara langsung melindungi

sel dari gangguan radikal bebas, dan secara tidak langsung memelihara keseimbangan

oksigen yang bersifat toksik (Wresdiyati et al., 2003). Pengukuran kandungan enzim

antioksidan SOD merupakan cara untuk mengetahui kondisi pertahanan sel terhadap

radikal bebas. Aktivitas SOD bervariasi pada beberapa organ. Aktivitas SOD tertinggi

terdapat pada hati, diikuti kelenjar adrenal, ginjal, darah, limpa, pankreas, otak, paru-

paru, usus, ovarium, dan timus (Halliwell and Gutteridge, 1999). Enzim SOD

mengkatalis dismutase oksigen menjadi hidrogen peroksida dan mengubahnya

menjadi air dan oksigen yang stabil (Gurer and Ercal, 2000). Enzim SOD berperan

dalam proses degradasi senyawa ROS. Reacive Oxygen Species (ROS) ialah senyawa

yang mempunyai gugus oksigen reaktif dan memiliki bentuk serta aktivitas sebagai

radikal bebas. Senyawa ini cenderung menyumbangkan atom oksigen atau elektron

pada senyawa lainya (Taniyama and Griendling, 2003).

2.8 Malondialdehida (MDA)

Malondialdehida (MDA) merupakan produk enzimatis dan nonenzimatis

yang berasal dari proses pemecahan prostaglandin endoperoksida dan merupakan

produk akhir dari peroksidasi lipid (Carini et al., 2004). Malondialdehida adalah

molekul reaktif yang mempunyai rumus molekul C3H4O2 dan dikenal sebagai

penanda (marker) peroksidasi lipid (Murray et al., 2003). Reaksi peroksidasi

lemak pada asam lemak tak jenuh rantai panjang dapat dilihat pada Gambar 2.7.

Para peneliti telah banyak melakukan pengukuran MDA sebagai tolak

ukur secara tidak langsung dari kerusakan oksidatif yang disebabkan oleh

28

peroksidasi lipid. Tokur, et al (2006) menyatakan bahwa prinsip pengukuran

MDA adalah reaksi satu molekul MDA dengan dua molekul asam tiobarbiturat

(TBA) membentuk kompleks senyawa MDA-TBA yang berwarna hitam dan

kuantitasnya dapat dibaca dengan spektrofotometer.

XHX

H H

Asam Lemak Tak Jenuh

C

O

HOH

C

O

HOAsam lemak radikal

OH OO2

Radikal Peroksil

C

O

HO

H

C

O

HO

RH

OOHH

+ R

Hidroperoksida

C

O

HO

O O

Endoperoksida

H H

O O

Malondialdehid (MDA)

C

O

HO

Gambar 2.7

Peroksidasi lemak pada asam lemak tak jenuh rantai panjang

(Murray et al., 2003).

Beberapa penelitian mengenai MDA telah dilakukan oleh para ahli seperti

yang dilakukan oleh Prangdimurti, et al. (2006), yang menyatakan bahwa telah

terjadi penurunan kadar MDA pada hati tikus Sprague Dawley yang telah diberi

asupan ekstrak daun suji. Hasil penelitian Jawi, et al. (2008) juga menyatakan

terjadi penurunan kadar MDA pada darah dan hati mencit jantan galur Swiss

setelah diberi asupan ekstrak ubi jalar ungu. Penelitian yang dilakukan oleh Kutlu,

29

et al. (2009) pada tikus hiperkolesterolemia yang disuplementasi dengan ‘apricot

cemel oil’, memberikan hasil yang signifikan terhadap penurunan MDA pada hati

tikus. Hal ini juga didukung oleh penelitian serupa yang dilakukan oleh Dewi

(2014) yang menyatakan bahwa ekstrak etil asetat biji terong belanda memiliki

kemampuan dalam menurunkan kadar MDA plasma darah tikus Wistar. Hasil

penelitian Suarsana, et al. (2013) juga menyatakan terjadi penurunan kadar MDA

jaringan hati tikus pada kondisi stres oksidatif setelah diberi asupan isoflavon

yang terdapat pada tempe.

2.9 Hati

Hati adalah organ tubuh terbesar dan merupakan kelenjar terbesar. Hati

terletak di rongga perut di bawah diaphragma (Junqueira et al., 1998). Hati

mempunyai empat lobus utama dan berhubungan satu sama lain di sebelah

dorsalnya, yaitu: lobus medius (menjadi bagian kiri dan kanan oleh sebuah

bifurcatio), lobus lateral kiri (tidak terbagi), lobus lateral kanan (terbagi horizontal

menjadi bagian anterior dan posterior), dan lobus kaudal (mempunyai dua lobus

berbentuk daun di dorsal dan ventral esofagus pada bagian curvatura minor

lambung) (Harada et al., 1996). Hati mendapat suplai darah dari arteri hepatica

dan vena porta (Maronpot, 1999). Sebagian besar darah berasal dari vena porta,

dan sebagian kecil dipasok oleh arteri hepatika (Junqueira et al., 1998). Arteri

hepatica berfungsi untuk suplai nutrisi, sedangkan vena porta membawa darah

yang berisi oksigen dari saluran pencernaan, limpa, dan pankreas ke hati

(Maronpot, 1999). Seluruh materi yang diserap melalui usus tiba di hati melalui

30

vena porta, kecuali lipid kompleks (kilomikron), yang diangkut melalui pembuluh

limfe. Posisi hati dalam sistem empedu adalah optimal untuk menampung,

mengubah dan mengumpulkan metabolit dan untuk menetralisasi serta

mengeluarkan substansia toksik. Pengeluaran ini terjadi melalui empedu, suatu

sekret eksokrin dari hati, yang penting untuk pencernaan lipid (Junqueira et al.,

1998). Hati mempunyai beberapa komponen sel, yaitu hepatosit (sel parenkim),

sel sinusoidal (endotel, sel kupfer dan sel lemak), sel haematopoesis, sel saraf, sel

pembuluh darah dan limfatik (endotel, adventisial, dan sel otot polos) (Maronpot,

1999). Komponen struktural utama dari hati adalah sel hati atau hepatosit

(Junqueira et al., 1998). Hepatosit bertanggung jawab terhadap peran utama hati

dan metabolisme yang terletak di antara sinusoid yang terisi darah dan saluran

empedu (Lu, 1995). Sel epitelial ini berkelompok dan membentuk lempeng-

lempeng yang saling berhubungan. Lobulus hati dibentuk oleh massa jaringan

berbentuk poligonal. Lobulus ini dibatasi oleh jaringan ikat yang mengandung

duktus biliaris, pembuluh limfe, saraf dan pembuluh darah. Hepatosit berderet

secara radier dalam lobulus hati. Mereka membentuk lapisan setebal 1 atau 2 sel,

lempeng ini mengarah dari tepian lobulus ke pusatnya dan beranastomosis secara

bebas. Celah diantara kapiler ini mengandung kapiler, yaitu sinusoid hati

(Junqueira et al., 1998). Fungsi dasar hati dapat dibagi menjadi: (1) fungsi

vaskular untuk menyimpan darah, (2) fungsi metabolisme yang berhubungan

dengan sebagaian besar sistem metabolisme tubuh dan (3) fungsi sekresi dan

ekskresi yang berperan membentuk empedu dan mengalirkan saluran empedu ke

saluran pencernaan (Guyton, 1994). Fungsi ekskresi hati berhubungan dengan

31

fungsinya sebagai organ detoksifikasi (Chandrasoma,2006). Peran hati sebagai

fungsi ekskresi dan sekresi yaitu ekskresi dan sekresi garam-garam empedu,

mensintesis glukosa, low density lipoprotein (LDL), urea dan protein plasma yang

larut (Chandrasoma,2006). Hati dipilih sebagai organ tempat diamatinya

perubahan kandungan Cu-Zn-SOD karena kandungan enzim ini di hati 10 kali

lipat per gram berat basah dibandingkan keberadaannya pada organ lain di dalam

tubuh tikus (Sloan,2003). Kandungan enzim Cu-Zn-SOD terbesar ditemukan di

hati dibandingkan organ lain seperti ginjal, paru-paru dan saluran pencernaan

(Makita, 1999).

2.10 Glikosida

Glikosida merupakan salah satu kandungan aktif tanaman yang termasuk

dalam kelompok metabolit sekunder. Di dalam tanaman, glikosida tidak lagi

diubah menjadi senyawa lain, kecuali bila memang mengalami peruraian akibat

pengaruh lingkungan luar (misalnya terkena panas dan teroksidasi udara)

2.10.1 Pengertian glikosida dan glikosida flavonoid

Glikosida adalah senyawa yang terdiri atas gabungan dua bagian senyawa,

yaitu gula dan bukan gula. Keduanya dihubungkan oleh suatu bentuk ikatan

berupa jembatan oksigen (O–glikosida, dioscin), jembatan nitrogen (N-glikosida,

adenosine), jembatan sulfur (S-glikosida, sinigrin), maupun jembatan karbon (C-

glikosida, barbaloin). Bagian gula biasa disebut glikon sedangkan bagian bukan

gula disebut sebagai aglikon atau genin. Apabila glikon dan aglikon saling terikat

maka senyawa ini disebut sebagai glikosida.

32

Glikosida flavonoid merupakan flavonoid yang mengikat gugus gula.

Flavonoid O-glikosida merupakan senyawa flavonoid yang mengikat satu gugus

hidroksil pada satu gugus gula. Selain itu, terdapat pula flavonoid C-glikosida

yang merupakan flavonoid yang gulanya terikat langsung pada inti benzena

dengan ikatan C-C seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2.8. Adanya pengaruh

glikosida menyebabkan senyawa flavonoid bersifat mudah larut dalam air

(Markham, 1988).

Gambar 2.8

struktur glikosida flavonoid dengan orientasi ikatan C glikosida

dan O-glikosida (Folador et al.,2010)

Apabila bagian aglikon dari suatu glikosida juga merupakan gula, maka

glikosida ini disebut hollosida, sedang kalau bukan gula disebut heterosida.

Biosintesa dari heterosida umumnya terdiri dari dua bagian yang penting

diantaranya reaksi umum bagaimana bagian gula terikat dengan bagian aglikon,

dan reaksi transfer ini sama pada semua sistem biologik.

Salah satu kelompok senyawa yang telah terbukti sebagai antioksidan

adalah polifenol yang diperoleh dari sayuran, buah, dan minuman tertentu

(Mehmet et al., 2007; Makris et al., 2007; M.A. Soobrattee et al., 2005).

Flavonoid adalah senyawa polifenol yang berdasarkan strukturnya dibagi menjadi

flavonol, flavon, flavanonon, isoflavon, katekin, antosianin, antosianidin, dan

33

kalkon (Gambar 2.9). Flavonoid mempunyai aktivitas sebagai antiviral, antialergi,

antiplatelet, antiinflamasi, antitumor, dan antioksidan (Harbone and Mabry, 1992;

Buhler, Donald , 2007).

Gambar 2.9

Struktur dasar beberapa golongan senyawa flavonoid

(Harbone and Mabry, 1992)

Antosianin merupakan zat warna merah yang banyak terdapat pada bunga, buah,

dan daun. Senyawa ini telah terbukti sebagai antioksidan dan pelindung terhadap

kerusakan sel-sel hati (Su, 2007). Jika antosianin ini bebas dari ikatannya dengan

gula disebut antosianidin yang merupakan senyawa golongan flavonoid.

Sementara beberapa flavonoid lain seperti kuersetin (flavonol dalam sayuran, kulit

buah dan bawang merah), santohumol (kalkon terprenilasi dalam buah hop dan

bir), isosantohumol (flavanon terprenilasi dalam buah hop dan bir), dan genistein

O

8

76'

5'

4'

3'

2'

6

5 43

2O

OH

O

O

O

8

76'

5'

4'

3'

2'

6

5 43

2O

O

Khalkon

2

345

6

2'

3'

4'

5'

6'7

8

6'

5'

4'

3'

2'

6 5

4

32 2 3

4

56

2'

3'

4'

5'

6'

O

Dihidrokalkon

FlavonFlavonol

Flavanon

Dihidroflavonol

O

OH

O

2

345

6

2'

3'

4'

5'

6'7

8

(flavanonol)

Isoflavon

O

O

2

345

62'

3'

4'

5'6'

7

8O

O

CH

Auron

8

76'

5'

4'

3'

2'

6

5 43

2O

OH

Katekin

O

OH

2

345

6

2'

3'

4'

5'

6'7

8

O

OH

OH

2

345

6

2'

3'

4'

5'

6'7

8

Antosianidin

+

Leukoantosianidin

34

(isoflavon dalam kedelai) juga sebagai antioksidan (Ramadan, 2008; Buhler,

2007).

2.10.2 Metabolisme dan bioavailabilitas flavonoid

Flavonoid pada tanaman dan makanan berada dalam bentuk glikosida.

Bahkan setelah di dalam tubuh, flavonoid glikosida terserap secara utuh di usus

halus. Hanya aglikon flavonoid dan glukosida flavonoid (terikat dengan glukosa)

diserap di usus halus, dan dengan cepat dimetabolisme untuk membentuk alkohol,

terglukuronidasi, atau metabolit tersulfatasi.

Bakteri usus biasanya berperan penting dalam metabolisme flavonoid dan

penyerapanya. Flavonoid atau metabolit flavonoid yang mencapai usus besar

mungkin akan lebih dimetabolisme oleh bakteri dan enzim kemudian akan

diserap. Kemampuan seseorang untuk menghasilkan metabolit flavonoid tertentu

dapat bervariasi dan tergantung pada lingkungan dari mikroflora kolon.

Secara umum, bioavailabilitas flavonoid relatif rendah karena penyerapan

terbatas dan eliminasi cepat. Bioavailabilitas berbeda untuk berbagai flavonoid.

Isoflavon adalah kelompok flavonoid yang paling bioavailable, sedangkan

flavanols (proanthocyanidins dan katekin teh) dan antosianin sangat susah diserap.

Karena flavonoid dengan cepat dan ekstensif dimetabolisme, aktivitas biologis

metabolit flavonoid tidak selalu sama dengan senyawa induk. Ketika

mengevaluasi data dari penelitian flavonoid dalam kultur sel, penting untuk

mempertimbangkan apakah konsentrasi flavonoid dan metabolit digunakan secara

fisiologis relevan. Pada manusia, puncak plasma konsentrasi isoflavon kedelai

dan flavanon jeruk belum ditemukan melebihi 10 micromoles/liter setelah

35

konsumsi oral. Puncak konsentrasi plasma diukur setelah konsumsi anthocyanin,

flavanol dan flavonol (termasuk yang dari teh) umumnya kurang dari 1 micromole

/ liter.

Glikosida yang diserap ke enterosit, konjugatnya bisa dihidrolisis dengan

mudah oleh glukosidase sitosol spesifik spektrum luas (BSG) (Day et al., 1998).

Sebagai tambahan, laktase phloridzine hidrolase (LPH), glikosidase yang ada

dalam brush border membran usus halus, dapat mengkatalisis hidrolisis

ekstraseluler beberapa glikosida, yang diikuti oleh difusi aglikon di brush border

(Day et al.,1998). Peran relatif kedua enzim pada hidrolisis glikosida tidak dikenal

dengan baik. Oleh karena itu, dengan pengecualian dari anthocyanin, sebagian

besar glikosida flavonoid dihidrolisis sebelum absorpsi, baik dalam lumen atau

dalam sel-sel usus (Gambar.2.10).

Gambar 2.10

Rute metabolik flavonoid setelah komsumsi oral (Ana et al., 2008)

Setelah hidrolisis, dan sebelum mencapai hati, aglikon mungkin mengalami

reaksi konjugasi dalam usus halus, yaitu glukuronidasi, sulfatasi, dan O-metilasi

36

(Kuhnle et al., 2000). Bentuk konyugat yang terglukoronidasi, tersulfatasi, dan

termetilasi (sederhana atau campuran) memasuki sirkulasi sistemik. Studi perfusi

dilakukan terhadap usus tikus menunjukkan bahwa flavon dan aglikon flavonol

menjadi terglukoronidasi pada penyerapan melalui jejunum dan ileum (Spencer et

al.,1999) dengan aksi uridin difosfat (UDP) -glucuronosyltransferase (UDP-GT).

Transferase adalah enzim yang ditemukan terikat pada membran di retikulum

endoplasma di beberapa jaringan yang mengkatalisis transferensi asam glukuronat

dari asam UDP-glukuronat untuk beberapa glikosida ke enterosit, yang bisa

dihidrolisis oleh glukosidase sitosol spesifik spektrum luas (BSG) (Day et al.,

1998). Laktase phloridzine hidrolase (LPH), glikosidase yang ada dalam brush

border membran usus halus, dapat mengkatalisis hidrolisis ekstraseluler beberapa

glikosida, yang diikuti oleh difusi aglikon di brush border (Spencer et al.,1999).

Peran kedua enzim pada hidrolisis glikosida tidak dikenal baik. Oleh karena itu,

dengan pengecualian dari anthocyanin.

Gambar 2.11

Penyerapan flavonoid pada usus manusia (Xiao et al.,2013)

Dalam kebanyakan kasus, flavonoid O-glikosida yang terhidrolisis oleh

enzim atau terdegradasi oleh bakteri aglikonnya di usus, berkurang dan

37

terkonjugasi untuk membentuk flavonoid O-glukoronida dan O-sulfat dalam hati

(Xiao et al., 2013). Namun, flavonoid C-glikosida menunjukkan perilaku

farmakokinetik yang berbeda dibandingkan dengan flavonoid O-glikosida (Xiao

et al., 2014). Flavonoid C-monoglikosida tampaknya memiliki jalur penyerapan

dan metabolisme yang berbeda dari C-multiglikosida (Gambar 2.12). Molekul

gula yang terikat melalui glikosilasi memegang peran biologi penting dalam

banyak produk alami, dan hidrolisis dapat mengakibatkan hilangnya bioaktivitas

(Stobiecki, 2000). Mengubah struktur gula untuk aglikon dapat meningkatkan

sifat fisiologisnya (Simkhadam et al., 2010). Orientin dan vitexin dari Trollius

chinesis dapat meningkatkan aktivitas antioksidan dalam serum dan jaringan tikus

dan mengurangi jumlah MDA (Wang et al., 2012). Di literatur, studi tentang sifat

antioksidan flavonoid glikosida umumnya difokuskan pada O-glikosida

(Lemmens et al., 2014). Ada informasi terbatas tentang aktivitas antioksidan

flavonoid C-glikosida meskipun beberapa penelitian menunjukkan bahwa

flavonoid C-glikosida memiliki berbagai aktivitas biologis, termasuk antioksidan,

antimikroba, sitotoksik, dan aktivitas hepatoprotektif (Pacifico et al., 2010).

Flavonoid terglikosilasi secara umum menurun kapasitas antioksidanya

dibandingkan dengan aglikon yang sesuai, tapi glikosilasi juga mempengaruhi

parameter termasuk kelarutan dan stabilitas (Plaza et al., 2014). Namun, karena

mekanisme dan efek glikosilasi belum sepenuhnya dijelaskan, masih ada

kecendrungan yang signifikan untuk menyelidiki aktivitas antioksidan flavonoid

glikosida.

38

Gambar 2.12

Penyerapan dan metabolisme flavonoid C Glikosida (Jianbo et al., 2016)

es

2.10.3 Mekanisme kerja glikosida flavonoid

Kapasitas flavonoid sebagai antioksidan tergantung dari struktur

molekulnya. Posisi gugus hidroksil dan adanya gugus tertentu dipercaya

merupakan faktor yang penting terhadap aktivitas antioksidan dan antiradikal

bebas. Senyawa-senyawa dengan suatu gugus –OH (hidroksil) yang terikat pada

karbon cincin aromatik merupakan antiradikal bebas yang efektif, produk radikal

bebas senyawa-senyawa ini terstabilkan secara resonansi sehingga tidak reaktif

dibandingkan dengan kebanyakan radikal bebas lain (Djatmiko, et al 1998;

Cooper, 2001).

Kuersetin berpotensi sebagai antioksidan karena gugus hidroksilnya dapat

berfungsi dalam meredam radikal bebas. Kalkon dan flavanon dengan gugus

prenil atau geranil seperti santohumol (kalkon), isosantohumol dan 6-

prenilnaringenin (flavanon) terbukti dapat meredam radikal bebas lebih potensial

daripada vitamin E. Gugus prenil tersebut dipercaya mempunyai peranan yang

sangat penting dalam aktivitasnya sebagai antioksidan untuk flavonoid tertentu

39

(Buhler, 2007). Struktur glikosida flavonoid yang efektif sebagai penangkap

radikal bebas adalah struktur dengan substituen dihidroksi pada atom C 3’, 4’

pada cincin B yang bersifat menyumbangkan elektron dan menjadi target radikal.

Adanya gugus O-dihidroksi pada cincin B menyebabkan stabilitas radikal fenoksil

lebih tinggi karena delokalisasi elektron dan berpotensi sebagai antiradikal

(Mohamed, 2008). Mohamed et al., (2015) menyatakan bahwa gugus 3-OH dan

5-OH yang berkombinasi dengan gugus fungsi karbonil dan ikatan rangkap pada

C2-C3 meningkatkan aktivitas penangkap radikal. Ikatan ganda pada C2-C3

terkonyugasi dengan gugus keto juga meningkatkan kapasitas penangkap radikal

(Cao,1997). Mohamed et al., (2015) melaporkan adanya gugus OH bebas pada C

3’ dan 4’ pada cincin B seperti pada kuersetin meningkatkan aktivitas antioksidan

dibandingkan mono hidroksi bebas pada kamferol. Substitusi salah satu gugus

dihidroksi pada cincin B oleh gugus metoksi atau gugus 3 OH oleh gula

menurunkan aktivitas antioksidan (Mohamed et al., 2014). Struktur beberapa

glikosida flavonoid yang aktif sebagai antioksidan disajikan pada Gambar 2.13.

Mekanisme aksi antioksidan dapat mencakup (1) penekanan pembentukan

ROS baik dengan menghambat enzim atau dengan chelating elemen yang terlibat

dalam generasi radikal bebas; (2) penangkapan ROS; dan (3) peningkatan regulasi

atau perlindungan pertahanan antioksidan.

40

Gambar 2.13

Struktur beberapa senyawa glikosida flavonoid yang aktif sebagai

antioksidan (Mohamed et al., 2015)

Aktivitas Flavonoid melibatkan sebagian besar mekanisme yang

disebutkan di atas. Beberapa efeknya dimediasi oleh hasil gabungan dari aktivitas

antioksidan dan interaksi dengan enzim. Flavonoid dapat memberikan efek

antioksidan dengan cara mencegah terbentuknya ROS, menangkap ROS,

melindungi antioksidan lipofilik dan merangsang terjadinya peningkatan

antioksidan enzimatik seperti yang disajikan dalam Gambar 2.14 (Akhlaghi et.al.,

2009

41

Gambar 2.14

Mekanisme pengaruh flavonoid terhadap ROS (Akhaghi., et al 2009)

Flavonoid dapat menangkap secara langsung superoksida dan peroksinitrit

melalui penangkapan superoksida, flavonoid dapat meningkatkan bioavailabilitas

NO dan menghambat pembentukan peroksinitrit atau flavonoid secara langsung

dapat menangkap peroksinitrit yang merusak vacorelaxation endotelium dan

menganggu endotelium, sehingga pada akhirnya menyebabkan sirkulasi darah

yang lebih baik dalam arteri koroner seperti yang disajikan pada Gambar.2.15.

Gambar 2.15

Pengaruh flavonoid terhadap radikal NO• (Akhaghi et al., 2009)

Menangkap

ROS

Induksi enzim

Antioksidan

Menghambat xanthine

oxidase

Menghambat NADPH

oxidase

Melindungi

Antioksidan

lipofilik

Mengkelat logam

Mencegah reaksi

oksidasi

FLAVONOID

42

Flavonoid dapat menghambat terjadinya kerusakan DNA akibat reaksi HO•

dengan basa nitrogen dari DNA dan merangsang terbentuknya antioksidan

enzimatik seperti SOD, Katalase dan GPx. Adapun mekanisme reaksinya dapat

dilihat pada Gambar 2.16.

Gambar 2.16

Mekanisme kerja flavonoid dalam menangkap ROS (Zainuri, 2012)

Flavonoid dapat melindungi membran phospholipid FUPA dengan

menyumbangkan atau memberikan salah satu ion hidrogennya kepada peroksil

lipid radikal untuk menghentikan reaksi reaksi radikal selanjutnya. Flavonoid

dapat melindungi tubuh kita dari reaksi lanjutan dari ROS dan RNS dengan

menangkap ROS, memblokir reaksi propagasi dan merangsang terbentuknya

antioksidan endogen seperti GPX, SOD dan Katalase serta menurunkan MDA

karena tidak terjadinya peroksidasi lemak (PUFA) dan menurunkan kadar 8

OHdG karena HO• yang biasanya masuk bereaksi ke dalam DNA sudah

ditangkap oleh flavonoid seperti yang ditunjukkan oleh Gambar 2.17.

OHO

OOH

O

OH

O*

O

+ H*

43

Gambar 2.17

Mekanisme Flavonoid dalam menangkap HO•

(Cooke and Mark, 2007)

Flavonoid dapat berfungsi sebagai pengkelat dari logam logam Cu dan Fe

yang berfungsi sebagai katalis dalam reaksi Fenton. Reaksi ini termasuk reaksi

perubahan hidrogen peroksida menjadi •OH. Proses ini akan menurunkan aktivitas

katalitik dari logam Cu dan Fe sehingga akan mengurangi terbentuknya radikal

•OH dan secara otomatis akan menurunkan proses kerusakan DNA dan proses

peroksidasi lemak seperti reaksi berikut : (Valko et al., 2004: Akhlaghi et al.,

2009)

OHO

OOH

O

OH

O*

O

+ H*

44

2.11 Metode DPPH

Untuk mengetahui suatu zat memiliki kemampuan sebagai antioksidan

maka dilakukan uji aktivitas antioksidan, salah satunya menggunakan metode

penangkapan radikal DPPH (2,2-difenil-1-pikril-hidrazil) sebagai senyawa radikal

bebas stabil yang ditetapkan secara spektrofotometri. Radikal DPPH merupakan

radikal bebas dengan pusat nitrogen organik yang stabil berwarna ungu tua yang

ketika tereduksi menjadi bentuk non radikal oleh antioksidan menjadi tidak

berwarna.

Gambar 2.18

Struktur kimia DPPH (Kumar et al.,2014)

Uji peredaman radikal DPPH merupakan uji dekolorisasi untuk mengukur

kemampuan antioksidan yang secara langsung bereaksi dengan meredam radikal

DPPH dengan memantau absorbansinya pada 517 nm dengan

spektrofotometer (Kumar et al., 2014).

45

Gambar 2.19

Reaksi penangkapan radikal oleh DPPH (Molyneux, 2004).

Senyawa antioksidan akan bereaksi dengan radikal DPPH melalui

mekanisme penyumbangan atom hidrogen. DPPH yang menerima elektron atau

radikal hidrogen akan membentuk molekul diamagnetik yang stabil yaitu menjadi

DPPH-H (bentuk tereduksi DPPH) yang disebut difenilpikril hidrazin Gambar

2.19. Reaksi pembentukan difenilpikril hidrazin ini akan menyebabkan peredaman

absorbansi DPPH (Djatmiko, et al., 1998).

Jika semua elektron pada radikal DPPH menjadi berpasangan maka

menyebabkan terjadinya peluruhan warna larutan DPPH dari ungu tua menjadi

kuning terang. Perubahan ini dapat diukur secara stoikiometri menggunakan

spektrofotometer UV-Vis sesuai dengan jumlah elektron atau atom hidrogen yang

ditangkap oleh molekul DPPH akibat adanya antioksidan. Kemampuan

antioksidan diukur sebagai penurunan serapan larutan DPPH akibat adanya

penambahan sampel. Aktivitas antioksidan untuk menghambat radikal bebas

dinyatakan dalam % inhibisi, yang dihitung menggunakan rumus:

46

%100% xblangkoabsorbansi

sampelabsorbansiblangkoabsorbansiinhibisi

−=

Berdasarkan harga % inhibisi (penangkal radikal bebas) yang diperoleh

kemudian dibuatlah kurva terhadap konsentrasi larutan uji atau pembanding.

Konsentrasi sampel (ppm) sebagai sumbu x dan % inhibisi sebagai sumbu y, lalu

persamaan regresi liniernya ditentukan. Dari persamaan regresi linier y = a + bx

tersebut dapat dihitung nilai IC50 nya dengan memasukkan nilai y sebesar 50

sehingga diperoleh nilai x sebagai IC50 (Nurjanah, et al., 2011).

Nilai IC50 menyatakan besarnya konsentrasi inhibisi larutan uji yang mampu

menangkal atau menurunkan 50% absorbansi radikal bebas DPPH dibandingkan

dengan larutan blangko (Stevi, et al., 2012). Bahan uji dikatakan aktif bila nilai

IC50 kurang dari 200 ppm untuk bahan uji berupa ekstrak dan kurang dari 100

ppm untuk bahan uji yang berupa isolat (Suryanto, 2012). Metode DPPH banyak

dipilih karena memiliki beberapa kelebihan diantaranya sederhana, mudah, cepat,

peka atau sensitif serta hanya memerlukan sedikit sampel.

2.12 Isolasi dan Identifikasi Senyawa Glikosida Flavonoid

2.12.1 Ekstraksi

Ekstraksi merupakan suatu metode penarikan komponen kimia yang dapat

larut sehingga terpisah dari bahan yang tidak larut dengan pelarut cair. Proses

ekstraksi sangat ditentukan oleh jenis senyawa, tekstur dan kandungan air dari

bahan yang akan diekstraksi. Ekstraksi dapat dilakukan dengan menggunakan

47

jaringan tumbuhan yang masih segar maupun yang kering (Harborne, 1996).

Jenis-jenis metode ekstraksi dapat digolongkan sebagai berikut.

1. Cara dingin

a) Maserasi

Maserasi merupakan proses ekstraksi yang dilakukan dengan merendam

sampel untuk menarik komponen yang diinginkan pada kondisi dingin

diskontinyu. Prinsip teknik maserasi adalah pengikatan atau pelarutan zat aktif

berdasarkan sifat kelarutannya dalam suatu pelarut (like dissolved like). Pada

proses ini, cairan pengekstrak akan menembus dinding sel kemudian masuk ke

dalam rongga sel yang mengandung zat aktif yang akan larut yang disebabkan

oleh adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel dan di luar

sel. Keunggulan dari teknik maserasi adalah lebih praktis, penggunaan pelarut

yang lebih sedikit dibandingkan dengan perkolasi serta tidak memerlukan proses

pemanasan. Kelemahan dari teknik ini adalah prosesnya membutuhkan waktu

yang lebih lama. Filtrat yang diperoleh dari proses maserasi biasanya diuapkan

dengan alat penguap putar vakum (rotary vacuum evaporator) sehingga

menghasilkan ekstrak pekat (Harborne, 1996; Kristanti et al., 2008).

b) Perkolasi

Perkolasi merupakan teknik ekstraksi dengan mengalirkan pengekstrak

melalui bahan yang telah dibasahi sehingga pelarut yang digunakan selalu baru.

Perkolasi banyak digunakan untuk ekstraksi metabolit sekunder, terutama untuk

senyawa yang tidak tahan panas (Harborne, 1996). Perkolasi terdiri atas beberapa

tahapan yaitu tahap pengembangan, tahap maserasi antara, tahap perkolasi

48

sebenarnya secara terus-menerus sampai diperoleh ekstraknya. Jika dibandingkan

dengan maserasi, metode perkolasi memiliki kelebihan yaitu:

• Aliran cairan pengekstrak menyebabkan adanya pergantian larutan yang

terjadi dengan larutan yang konsentrasinya lebih rendah sehingga

meningkatkan derajat perbedaan konsentrasi.

• Ruangan di antara butir-butir serbuk simplisia membentuk saluran tempat

mengalir cairan pengekstrak. Kecepatan pelarut cukup untuk mengurangi

lapisan batas karena kecilnya saluran kapiler sehingga dapat meningkatkan

perbedaan konsentrasi.

2. Cara Panas

a) Refluks

Refluks merupakan metode ekstraksi dengan pelarut pada temperatur yang

sesuai dengan titik didihnya. Prinsip dari teknik refluks adalah proses ekstraksi

yang berkesinambungan. Bahan yang akan dieksraksi direndam dengan cairan

pengekstrak dalam labu alas bulat yang dilengkapi dengan alat pendingin tegak,

kemudian dipanaskan sampai mendidih. Teknik ini biasanya dilakukan 3 kali dan

setiap kali diekstraksi selama 4 jam (Harborne, 1996).

b) Sokletasi

Sokletasi merupakan metode ekstraksi yang menggunakan ekstraksi

berulang disertai pemanasan. Metode sokletasi dilakukan dengan cara

memanaskan pelarut hingga membentuk uap dan membasahi sampel. Pelarut yang

sudah membasahi sampel selanjutnya akan turun ke labu pemanasan serta kembali

menjadi uap untuk membasahi sampel. Hal tersebut dapat menghemat

49

penggunaan pelarut karena terjadi sirkulasi pelarut yang selalu membasahi

sampel. Metode ini sangat baik digunakan untuk senyawa yang tidak mudah

terurai oleh proses pemanasan.

Flavonoid yang tersebar pada tumbuhan pada umumnya bersifat polar.

Oleh karena itu, senyawa flavonoid dapat diekstrak menggunakan pelarut polar.

Ekstrak yang diperoleh dari proses ekstraksi kemudian diuapkan dengan rotary

vacum evaporator sehingga dihasilkan ekstrak yang pekat. Ekstrak inilah yang

dikenal dengan sebutan ekstrak kasar (crude extract). Metode yang paling umum

digunakan pada saat ekstraksi adalah maserasi karena mudah serta memberikan

hasil yang memuaskan (Markham, 1988).

2.12.2 Pemisahan dan pemurnian

Sebelum dilakukan proses pemurnian dengan teknik kromatografi, terlebih

dahulu dilakukan proses pemisahan dengan cara ekstraksi cair-cair yang dikenal

dengan tahap partisi (Harborne, 1996). Ekstraksi cair-cair merupakan proses

pemisahan zat terlarut di dalam dua jenis pelarut yang bersifat tidak saling

campur. Pada umumnya ekstraksi cair-cair dimulai dengan penggunaan pelarut

non polar seperti n-heksan atau petroleum eter untuk menarik senyawa yang

bersifat non polar. Kemudian dilanjutkan dengan penggunaan pelarut semipolar

seperti kloroform, etil asetat atau aseton untuk menarik senyawa yang bersifat

semipolar. Setelah itu, proses partisi dilanjutkan dengan pelarut polar seperti

metanol atau n-butanol untuk menarik senyawa yang bersifat polar. Proses

ekstraksi cair-cair ini biasanya menggunakan corong pisah dalam proses

pemisahannya (Sudjadi, 1992; Harborne, 1996).

50

2.13 Spektrofotometri UV-Vis

Analisis kualitatif dan kuantitatif sampel yang mengandung flavonoid

dapat dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis.

Spektrofotometri UV-Vis merupakan suatu teknik analisis spektroskopi yang

menggunakan sumber REM (radiasi elektromagnetik) ultraviolet dekat (190-380

nm) dan sinar tampak (380-780 nm). Pada proses analisis molekulnya,

spektrofotometri UV-Vis melibatkan energi elektronik yang cukup besar (Mulja

and Suharman, 1995).

Absorbsi cahaya UV-Vis mengakibatkan terjadinya transisi elektronik,

yaitu perpindahan elektron-elektron dari orbital keadaan dasar yang berenergi

rendah ke orbital keadaan tereksitasi berenergi tinggi. Keuntungan dari serapan

ultraviolet yaitu lebih selektif dimana gugus-gugus yang khas dapat diketahui

dalam molekul-molekul yang sangat kompleks (Noerdin, 1995). Eksitasi elektron

yang memberikan serapan maksimum pada panjang gelombang tertentu disebut

dengan panjang gelombang maksimum (λmaks). Penentuan panjang gelombang

maksimum dapat digunakan untuk mengidentifikasi molekul yang memiliki

karakteristik tertentu sebagai data sekunder.

Spektrofotometri ultraviolet merupakan teknik yang paling tepat untuk

menganalisis struktur flavonoid, umumnya ditentukan dalam larutan dengan

pelarut metanol atau etanol. Spektrum senyawa flavonoid terdiri atas dua pita

absorbsi maksimum yaitu pita I pada rentang 300-550 nm dan pita II pada rentang

240-285 nm. Pita I menunjukkan absorbsi sistem sinamoil pada cincin B dan pita

II menunjukkan absorbsi sistem benzoil pada cincin A (Markham, 1988).

51

Kedudukan gugus hidroksi fenol bebas pada inti flavonoid dapat

ditentukan dengan cara menambahkan pereaksi geser ke dalam larutan cuplikan

dan mengamati puncak serapan yang terjadi (Markham, 1988). Terdapat dua

langkah yang dilakukan dalam menafsirkan spektrum. Langkah pertama yaitu

menentukan jenis flavonoid dengan memperhatikan bentuk umum spektrum

dalam metanol, panjang gelombang pita serapan dan data kromatografi. Langkah

kedua yaitu memperhatikan arti perubahan spektrum yang disebabkan oleh

adanya penambahan berbagai pereaksi geser. Pereaksi geser yang umum

digunakan adalah NaOMe untuk mengetahui keberadaan gugus hidroksil pada

atom C3’ dan C4, NaOAc untuk mengetahui keberadaan gugus 7-hidroksil bebas,

CH3COONa menyebabkan pengionan (pada gugus hidroksil flavonoid yang

paling asam) dan AlCl3 untuk mengetahui letak gugus hidroksil pada atom C3 dan

C5 (Markham, 1988).

2.14 Spektrofotometri Inframerah

Spektrofotometri inframerah (IR) merupakan suatu teknik yang digunakan

untuk mengukur penyerapan radiasi inframerah pada berbagai panjang

gelombang. Energi inframerah tidak mampu mentransisikan elektron melainkan

hanya menyebabkan molekul mengalami vibrasi pada tingkat vibrasi tertentu.

Spektra inframerah suatu senyawa mampu memberikan gambaran dan struktur

molekul dari senyawa tersebut. Spektra IR dapat dihasilkan dengan mengukur

absorbansi radiasi, refleksi atau emisi di daerah IR.

52

Suatu ikatan kimia dapat bervibrasi sesuai dengan tingkat energinya

sehingga memberikan frekuensi yang spesifik. Hal inilah yang menjadi dasar

pengukuran spektroskopi IR. Pada umumnya terdapat dua jenis vibrasi molekul

yaitu vibrasi ulur (stretching) dan tekuk (bending). Vibrasi ulur merupakan

pergerakan atom yang teratur sepanjang sumbu ikatan antara dua atom sehingga

jarak antara atom dapat bertambah atau berkurang. Contoh vibrasi ulur adalah

symmetrical stretching dan assymmetrical stretching. Vibrasi tekuk merupakan

pergerakan atom yang menyebabkan perubahan sudut ikatan antara dua ikatan

atau pergerakan dari satu atom ke atom lainnya. Contoh vibrasi tekuk adalah

scissoring, rocking, wagging dan twisting. Daerah inframerah pada spektrum

gelombang elektromagnetik mencakup bilangan gelombang 14.000 cm-1 hingga

10 cm-1. Daerah inframerah sedang (4000-400 cm-1) berkaitan dengan transisi

energi vibrasi dari molekul yang memberikan informasi mengenai gugus-gugus

fungsi dalam molekul tersebut. Daerah inframerah jauh (400-10 cm-1) bermanfaat

untuk menganalisis molekul yang mengandung atom-atom berat seperti senyawa

organik, namun membutuhkan teknik khusus yang lebih baik. Daerah inframerah

dekat (12.500-4000 cm-1) yang peka terhadap vibrasi overtone (Sastrohamidjojo,

1992).

2.15 Liguid Chromatography Mass Spectrometry (LC-MS/MS)

Liguid Chromatography Mass Spectrometry (LC-MS/MS) adalah

kombinasi dari kromatografi cair (LC) dengan spektrometri massa (MS). MS

berarti hanya menganalisis ion prekursor (seperti yang dihasilkan di sumbernya)

53

misalnya dalam sebuah iontrap, sebuah quadrupole atau time-of-flight Massspec.

MS / MS adalah kombinasi dari dua penganalisis massa dalam satu instrumen

spektro massa. Filter MS pertama untuk ion prekursor diikuti oleh fragmentasi ion

prekursor dengan energi tinggi. Alat analisa massa kedua kemudian disaring

untuk ion produk, yang dihasilkan oleh fragmentasi. Ini biasanya dilakukan di

triple quadrupole MS (QQQ) atau QTOF. Kelebihan MS/MS adalah

meningkatnya sensitivitas (di QQQ, karena pengurangan kebisingan) dan bisa

mendapatkan lebih banyak informasi struktural pada analit (QTOF) berdasarkan

pola fragmentasi.(Sumbono,2010).

Uji pendahuluan adanya senyawa flavonoid dalam buah terong telah

dilakukan melalui skrining fitokimia menggunakan pereaksi Willstatter, Bate

Smith-Metcalfe, dan NaOH 10%. Hasil uji tersebut menunjukkan bahwa buah

terong belanda mengandung flavonoid, sementara banyak penelitian menunjukkan

bahwa beberapa flavonoid bersifat antioksidan, maka perlu dilakukan isolasi dan

uji antioksidan glikosida flavonoid dalam buah terong belanda tersebut baik

secara in vitro maupun in vivo.