1

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Efek genotoksik merupakan efek kerusakan deoxyribonucleic acid (DNA)

yang dipengaruhi oleh agen kimia maupun fisika yang mampu memodifikasi basa

nukelotida maupun sugar-phosphate backbone dari DNA (Kastan et al., 2004).

Kerusakan pada DNA tersebut diantaranya dapat diakibatkan oleh terjadinya

ikatan kovalen suatu agen toksik pada DNA. Jenis kerusakan DNA dapat

berdampak pada kematian atau mutagenisitas sel, yang dapat menjurus pada

kanker. Terdapat enam jenis kerusakan DNA, yaitu depurinasi basa, oksidasi basa,

deaminasi basa, metilasi basa, DNA-DNA crosslink, dan DNA-protein crosslink

(Swift et al., 2014).

Salah satu penyebab efek genotoksik tersebut adalah adverse drug

reaction (ADR). ADR merupakan efek yang disebabkan oleh obat yang

menghasilkan respon tidak diinginkan dan terjadi pada dosis normal (Rohilla and

Yadav, 2013). Kasus ADR ini telah menjadi permasalahan besar dalam dunia

pengobatan dunia. Diperkirakan bahwa kasus ADR di Amerika Serikat telah

menelan biaya sebesar 100 milyar US$ dan menyebabkan kematian sebanyak

100.000 tiap tahunnya (Ingelman-Sundberg et al., 2001). Menurut Phillips et al.

(2001), 59% obat yang menyebabkan ADR dimetabolisme oleh enzim polimorfik

fase 1, di mana sebanyak 86% dari itu merupakan enzim oksidase CYP450.

Famili CYP450 yang paling penting dalam metabolisme obat adalah CYP3A4

1

2

(Ingelman-Sundberg et al., 2004). Mekanisme ADR dapat terjadi melalui reaksi

toksisitas langsung yang dapat mengakibatkan disfungsi fisiologis, kerusakan

DNA (efek genotoksik), dan kerusakan struktur sel serta jaringan (Ramesh et al.,

2009).

Salah satu obat sitostatik yang mampu menimbulkan ADR berupa efek

genotoksik tersebut adalah siklofosfamid yang digunakan untuk terapi lymphoma,

leukemia, multiple myeloma, mycosis fungoides, neuroblastoma, retinoblastoma,

kanker payudara, dan kanker ovarium (American Cancer Society, 2010).

Siklofosfamid merupakan salah satu obat sitostatik golongan nitrogen mustard

yang biasa digunakan saat ini di (Holland et al., 2003). Nitrogen mustard

merupakan bifunctional alkylating agents yang merusak DNA melalui

pembentukan guanin-guanin dan guanin-adenin interstrand crosslink (Holland et

al., 2003) melalui transfer alkyl-groups pada basa DNA secara kovalen (Helleday

et al., 2008). Bifunctional alkylating agent merupakan agen pengalkilasi DNA

yang akan bereaksi dengan dua basa DNA berbeda dan menjurus pada DNA

crosslink (Helleday et al., 2008).

Efek genotoksik tersebut disebabkan oleh aktivasi siklofosfamid menjadi

4-hidroksisiklofosfamid yang dikatalisis oleh CYP2B6; 2C9; 3A4 yang

merupakan isozyme dari enzim oksidase hepatic cythochrome P450 (CYP450).

CYP3A4 merupakan bentuk utama dari CYP450 dengan persentase jumlah yang

cukup banyak (25% dari seluruh famili CYP450 dan sangat penting dalam

oksidasi obat (Guengrich, 1995; Shimada et al., 1994). Senyawa 4-

hidroksisiklofosfamid tersebut selanjutnya akan mengalami interkonversi secara

3

cepat menjadi tautomernya, aldofosfamid. Aldofosfamid akan mengalami reaksi

eliminasi secara spontan (non-enzimatik) untuk menghasilkan phosphoramide

mustard (PM). PM inilah yang secara umum diketahui sebagai DNA crosslinking

agent (Shukla et al., 2001) yang dapat mengakibatkan terbentuknya mikronukleus

dan kematian sel (Bryce et al., 2010; Tripathi and Jena, 2009).

Strategi efektif pengatasan efek genotoksik siklofosfamid adalah dengan

menggunakan agen anti-genotoksik yang mampu mencegah efek genotoksik.

Salah satu bahan alam yang mampu berperan sebagai agen anti-genotoksik adalah

daun pepaya (Carica papaya L.). Aktivitas biologis daun pepaya tersebut,

sebagian besar merupakan kontribusi dari kaemferol dan quercetin (Zhang and

Zhuo, 2004), di mana kedua senyawa tersebut memiliki aktivitas antioksidan

(Chopra et al., 2000). Namun, kandungan quercetin dalam daun pepaya lebih

tinggi dibandingkan dengan kaemferol (Canini et al., 2007). Selain itu, quercetin

merupakan flavonoid paling kuat dalam melindungi tubuh melawan reactive

oxygen species (ROS) yang dihasilkan dari metabolisme normal ataupun yang

dihasilkan dari induksi kerusakan DNA oleh agen eksogen (De Groot, 1994;

Grace, 1994).

Dalam penelitian ini, digunakan ekstrak kasar daun pepaya, karena

berdasarkan penelitian Koul et al. (2005), ekstrak kasar (crude extract) dari suatu

tumbuhan menyebabkan efek samping penggunaan yang lebih rendah dengan

keberadaan berbagai senyawa yang terkandung di dalamnya yang dapat bekerja

secara sinergis dan meminimalkan efek samping. Dengan demikian, diharapkan

quercetin yang diduga terkandung dalam crude extract daun pepaya, mampu

4

berperan sebagai agen anti-genotoksik khususnya terhadap agen genotoksik

siklofosfamid. Mekanisme anti-genotoksik tersebut adalah melalui penghambatan

metabolisme siklofosfamid oleh CYP3A4, sehingga tidak terbentuk PM yang

berperan sebagai ROS dan menimbulkan efek genotoksik. Selain itu mekanisme

anti-genotoksik tersebut juga dapat terjadi melalui inaktivasi ROS yang dihasilkan

dari induksi agen genotoksik siklofosfamid.

Oleh karena itu, tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui efek anti-

genotoksik ekstrak etanolik daun pepaya serta interaksi quercetin dengan

CYP3A4. Kandungan senyawa daun pepaya diidentifikasi secara kualitatif

melalui kromatografi lapis tipis (KLT). Sedangkan metode penelitian yang

digunakan untuk mengetahui efek anti-genotoksik ekstrak etanolik daun pepaya

adalah mammalian in vivo micronucleus test dengan parameter berupa jumlah

micronucleated polychormatic erytrhocyte (MNPCE)/ 1000 PCE dan %

polychromatic erythrocyte (PCE)/ (PCE+ normochromatic erythrocyte (NCE))

sebagai parameter aktivitas anti-genotoksik. Selain itu, juga dilakukan metode

molecular docking untuk mengamati interaksi quercetin pada CYP3A4. Metode

ini dilakukan menggunakan software PLANTS dengan parameter docking score.

B. Rumusan Masalah

1. Apakah ekstrak etanolik daun pepaya berefek anti-genotoksik terhadap

siklofosfamid dengan parameter penurunan jumlah MNPCE/1000 PCE

dan kenaikan % PCE/(PCE+NCE) berdasarkan mammalian in vivo

micronucleus test?

2. Bagaimana interaksi senyawa quercetin yang terkandung dalam ekstrak

5

etanolik daun pepaya terhadap enzim oksidase CYP3A4 dibandingkan

dengan siklofosfamid berdasarkan molecular docking?

C. Tujuan Penelitian

1. Tujuan Umum

Secara umum, penelitian ini bertujuan untuk menguji efek ekstrak

etanolik daun pepaya sebagai agen anti-genotoksik potensial yang

berfungsi untuk mencegah efek genotoksik siklofosfamid.

2. Tujuan Khusus

a. Mengetahui efek anti-genotoksik ekstrak etanolik daun pepaya

terhadap siklofosfamid dengan parameter penurunan jumlah

MNPCE/1000 PCE dan kenaikan % PCE/(PCE+NCE) berdasarkan

mammalian in vivo micronucleus test

b. Mengetahui interaksi senyawa quercetin yang terkandung dalam

ekstrak etanolik daun pepaya terhadap enzim oksidase CYP3A4

dibandingkan dengan siklofosfamid berdasarkan molecular docking.

D. Pentingnya Penelitian

Penelitian ini sangat penting bagi institusi fakultas farmasi UGM dalam hal

potensi pengembangannya sebagai agen anti-genotoksik berbasis bahan alam

dalam skala penelitian ataupun kerja sama dengan industri farmasi. Bagi dunia

ilmu pengetahuan, hasil penelitian ini juga penting dalam menambah khasanah

ilmu pengetahuan mengenai pentingnya agen anti-gentoksik dewasa ini,

6

mengingat tingginya kasus adverse drug reaction (ADR) yang menyebabkan

efek samping berupa efek genotoksik. Di samping itu, penelitian ini dapat

menjadi rujukan yang dapat dipertanggung jawabkan secara ilmiah bagi

penelitian lain yang berbasis genotoksisitas. Data yang diperoleh dari penelitian

ini dapat dipublikasikan menjadi sebuah artikel dalam jurnal ilmiah sehingga

bermanfaat bagi pengembangan penelitian selanjutnya dan bermanfaat bagi

masyarakat luas.

E. Tinjauan Pustaka

1. Efek Genotoksik

Efek genotoksik merupakan efek kerusakan deoxyribonucleic acid

(DNA) yang dipengaruhi oleh agen kimia maupun fisika yang mampu

memodifikasi basa nukelotida ataupun sugar-phosphate backbone dari DNA

(Kastan et al., 2004). Kerusakan pada DNA tersebut diantaranya dapat

diakibatkan oleh terjadinya ikatan kovalen suatu agen toksik pada DNA.

Agen-agen yang dapat menyebabkan efek genotoksik tersebut, di antaranya

agen endogen (by-products reaktif dari proses metabolisme atau inflamasi)

(Hoeijmakers et al., 2011), agen eksogen (agen yang terdapat dalam

makanan, air, ataupun udara) (Jackson et al.,2009), agen fisik (sinar

ultraviolet), reactive oxygent spesies (ROS), intercalating agents, alkylating

agents, dan analog basa. Mekanisme agen genotoksik tersebut dalam merusak

DNA dapat berjalan secara langsung, tidak langsung, ataupun keduanya

(Swift et al., 2014).

7

Jenis kerusakan DNA dapat berdampak pada kematian atau

mutagenisitas sel, yang dapat menjurus pada kanker. Terdapat enam jenis

kerusakan DNA, yaitu depurinasi basa, oksidasi basa, deaminasi basa,

metilasi basa, DNA-DNA crosslink, dan DNA-protein crosslink.

1) Depurinasi basa

Depurinasi basa (Gambar 1a) merupakan proses mutagenik yang

apabila tidak diperbaiki dapat menyebabkan kesalahan replikasi DNA

dan terkadang dapat menjurus pada kanker (Cavalieri et al., 2012).

Depurinasi basa ini terjadi melalui hidrolisis ikatan antara purin dan

gula deoksiribosa DNA, yang merupakan abasic site (Lindahl, 1993).

Abasic site ini terbentuk ketika DNA termodifikasi oleh karsinogen

kimiawi pada posisi N3 dan N7 purin dan posisi O2 dari pirimidin,

yang melabeli ikatan glikosida dan meningkatkan kecepatan hilangnya

basa (Lawley et al., 1963; Drinkwater et al., 1980).

2) Oksidasi basa

Oksidasi basa (Gambar 1b) dapat disebabkan oleh reactive oxygen

spesies (ROS) yang menyebabkan perubahan basa DNA mayor seperti

timin glikol (Dizdaroglu et al., 2012). Produk basa DNA mayor yang

disebabkan oleh oksidasi dapat menyebabkan kesalahan dalam

replikasi DNA yang menjurus pada mutagenesis (Cooke et al., 2003).

Penambahan gugus hidroksil pada C5 dan C6 timin akan membentuk

timin glikol yang merupakan kerusakan DNA paling umum akibat

induksi oleh interaksi timin dengan ROS. Timin glikol bersifat non

8

polar; C5 metil akan menonjol keluar dan mencegah basa menumpuk

di atas DNA yang rusak, sehingga menghalangi DNA polimerase

selama replikasi DNA (Yoon et al., 2010).

3) Deaminasi basa

Deaminasi basa (Gambar 1c) merupakan proses hilangnya basa

adenin, guanin atau sitosin (Lindahl, 1993). Produk deaminasi dapat

berupa urasil, urasil glikol, santin dan hipoksantin. Deaminasi ini

terjadi secara spontan dan diinduksi oleh ROS atau agen seperti nitrit

oksida. Deaminasi adenin, guanin atau sitosin dapat berefek

mutagenik karena gugus 4-amino pada piridin dan gugus 6-amino

pada purin mendonasikan hidrogen selama pembentukan pasangan

basa Watson-Crick. Saat basa-basa tersebut terdeaminasi pada residu-

residu gugus keto, maka akan menggantikan gugus amino yan

menerima ikatan hidrogen pada pasangan basa Watson-Crick normal

(Kow, 2002).

4) Metilasi atau alkilasi basa

Metilasi atau alkilasi basa (Gambar 1d) terjadi ketika gugus metil

atau akil ditambahakan pada basa (Lindahl et al., 1993). Metilasi basa

dapat bersifat mutagenik ataupun sitotoksik, selain itu basa dapat

termetilasi pada atom O dan N tergantung jenis agen pemetilasi dan

jenis DNA (single strand atau double strand) (Drablos et al., 2004).

Produk metilasi seperti O6-metilguanin, bersifat sangat mutagenik dan

sitotoksik karena DNA polimerase sering menambahkan timin pada

9

pasangan basa dengan O6-metilguanin secara tidak benar (Warren et

al., 2006). Efek metilasi basa ini tergantung jenis agen pemetilasi

tersebut (monofunctional alkylating agent atau bifunctional alkylating

agent). Monofuncional alkylating agent akan memodifikasi single

base (biasanya pada atom N7 dari purin adenin dan guanin) yang

menyebabkan bulky DNA adduct. Sementara itu, bifunctional

alkylating agent akan bereaksi dengan dua basa DNA berbeda dan

menjurus pada DNA crosslink (Helleday et al., 2008).

5) DNA-DNA crosslink

DNA-DNA crosslink terjadi ketika dua basa DNA berikatan

secara kovalen satu sama lain, seperti melalui bifunctional alkylating

agent yang memiliki dua sisi reaktif (Kondo et al., 2010). Jika basa-

basa DNA saling berdekatan, maka akan terjadi intrastrand crosslink

(Gambar 1e), sedangkan jika basa-basa DNA berada pada DNA

strand yang berbeda, maka akan terjadi interstrand crosslink (Gambar

1f).

Interstrand crosslink akan menghalangi mesin replikasi DNA

melalui pencegahan pemisahan strand (Noll et al., 2006) dan

membengkokkan DNA. Terhalangnya mesin replikasi DNA ini dapat

dapat menjurus pada double-strand breaks (DSBs) (Kondo et al.,

2010). Interstrand crosslink ini bersifat sangat toksik, karena

mempengaruhi kedua strand DNA dan dapat menjurus pada

kehilangan informasi template (Kowalczyk et al., 2002).

10

6) DNA-protein crosslink

DNA-protein crosslink merupakan salah satu jenis kerusakan DNA

yang akan membentuk helix distorting adducts yang akan menghalangi

mesin replikasi DNA.yang dapat menjurus ke kerusakan DNA strand

dan mutagenesis (Barker et al., 2005). Efek biologis DNA-protein

crosslink masih belum banyak diketahui dibandingkan dengan jenis

kerusakan DNA lain, karena sulit dideteksi (Shoulkamy et al., 2012).

DNA-protein crosslink terjadi ketika terdapat protein-protein yang lebih

stabil berikatan dengan DNA, sehingga membentuk kompleks kovalen

yang dapat dikonversi menjadi single strand breaks (SSBs) atau double

strand breaks (DBSs), saat protein-protein tersebut bertemu degan

mesin transkripsi atau replikasi DNA (Connelly et al., 2004).

Gambar 1. Jenis kerusakan DNA. (a) Depurinasi basa nukleotida guanin, membentuk

abasic site; (b) Oksidasi basa timin menjadi timin glikol; (c) Deaminasi basa sitosin

menjadi urasil; (d) Metilasi guanin menjadi O6-metilguanin; (e) Intrastrand guanin-

guanin crosslink; (f) Interstrand guanin-guanin crosslink; (g) DNA-protein crosslink

(Swift and Golsteyn., 2014).

A. Depurinasi basa

Nukleotida guanin Deoksiribosa dan fosfat Basa guanin

B. Oksidasi basa C. Deaminasi basa D. Metilasi basa

E. Intrastrand crosslink F. Interstrand crosslink G. DNA-protein crosslink

11

2. Siklofosfamid

Banyak agen sitotoksik yang biasa digunakan untuk terapi pasien kanker,

namun menyebabkan tingginya tingkat kerusakan DNA yang menginisiasi

cell cycle checkpoints dan menjurus pada cell cycle arrest atau pun kematian

sel (Helleday et al., 2008). Salah satu agen sitotoksik tersebut adalah

alkylating agents yang merupakan elektrofil yang melakukan transfer alkyl-

groups pada basa DNA secara kovalen (Helleday et al., 2008). Terdapat

beberapa jenis alkylating agents, di antaranya nitrogen mustard, nitrosourea,

senyawa aziridin, akil sulfonat dan senyawa triazin.

Nitrogen mustard merupakan bifunctional alkylating agents yang

merusak DNA melalui pembentukan guanin-guanin dan guanin-adenin

interstrand crosslink. Mekloretamin, bendamustin, melfalan, klorambusil,

ifosfamid dan siklofosfamid, merupakan nitrogen mustard yang biasa

digunakan saat ini (Holland et al., 2003). Siklofosfamid (Gambar 2)

merupakan salah satu obat sitostatik yang biasa digunakan untuk terapi

lymphoma, leukemias, multiple myeloma, mycosis fungoides, neuroblastoma,

retinoblastoma, kanker payudara, dan kanker ovarium (American Cancer

Society, 2010).

Gambar 2. Struktur kimia siklofosfamid (IARC, 1981).

12

Siklofosfamid sebagai pro drug, tidak menunjukkan aksi sebagai

alkylating agent dan tidak menimbulkan kerusakan organ karena gugus

penarik elektron dari atom P akan menurunkan efek nukleofilik dari

β-kloroetilamino pada atom N serta mampu mencegah pembentukan agen

pengalkilasi reaktif (ion etileniminium). Pro drug ini memerlukan aktivasi

metabolisme melalui hepatic-mixed function oxidase untuk membentuk

4-hidroksisiklofosfamid. Hepatic-mixed function oxidase yang

memetabolisme siklofosfamid adalah berupa CYP2B6; CYP2C9; CYP3A4

yang merupakan isozyme dari cythochrome P450 (CYP450). Senyawa 4-

hidroksisiklofosfamid hasil metabolisme hepatic-mixed function oxidase

tersebut terdapat pada kesetimbangan dengan tautomer cincin terbuka berupa

aldofosfamid yang mengalami eliminasi β untuk menghasilkan alkylating

agent berupa phosoramid mustard pada sel target. Siklofosfamid juga

dimetabolisme oleh aldehid dehidrogenase menjadi metabolit inaktif, yaitu

karboksifosfamid. (Lloyd and Smith, 1988). Reaksi metabolisme

siklofosfamid dapat dilihat pada Gambar 3.

13

Gambar 3. Reaksi metabolisme siklofosfamid (Lloyd and Smith, 1988). Siklofosfamid

dapat teraktivasi menjadi 4-hidroksisiklofosfamid melalui katalisis oleh hepatic-mixed

function oxidase. 4-hidroksisiklofosfamid akan mengalami interkonversi secara cepat

menjadi tautomernya, aldofosfamid. Aldofosfamid selanjutnya akan mengalami reaksi

eliminasi secara spontan untuk menghasilkan phosphoramide mustard (PM) yang merupakan

DNA crosslinking agent.

Metabolit toksik dari siklofosfamid ini akan menyerang atom N7 dari

residu guanin pada major groove DNA. Proses ini akan diulangi dengan β(2)-

kloroetil kedua yang menyerang atom N7 guanin yang terletak pada strand

DNA yang berseberangan. Proses tersebut akan memberikan peningkatan

interstrand cross-link yang mengunci dua strand DNA secara bersamaan dan

efektif (Thurston and Sylvia, 1988). Hal inilah yang dapat mengakibatkan

terbentuknya mikronukleus dan kematian sel (Bryce et al., 2010; Tripathi and

14

Jena, 2009). Mekanisme aksi siklofosfamid terhadap DNA dapat dilihat pada

Gambar 4.

Gambar 4. Mekanisme aksi siklofosfamid terhadap DNA. Metabolit toksik dari

siklofosfamid ini akan menyerang atom N7 dari residu guanin pada major groove DNA.

Proses ini akan diulangi dengan β(2)-kloroetil kedua yang menyerang atom N7 guanin yang

terletak pada strand DNA yang berseberangan. Proses tersebut akan memberikan peningkatan

interstrand cross-link yang mengunci dua strand DNA secara bersamaan dan efektif

(Thurston and Lobo, 1988).

3. Cytochrome P450

Cytochrome P450 merupakan enzim yang bertanggung jawab terhadap

metabolisme senyawa endogen dan eksogen (Ingelman-Sundberg, 2004).

Penamaan cytochrome P450 adalah berdasarkan penamaan cytochrome

dengan CYP yang diikuti dengan angka famili gen terindikasi (>40%

mengindentifikasi level sekuen asam amino yang diperlukan untuk menjadi

famili yang sama dan >55% identifikasi sekuen asam amino) dan jumlah gen

yang bersangkutan (Nelson et al., 1996). Human cytochrome P450 dapat

dibagi menjadi 3 kelompok utama yaitu:

1) Famili CYP 1-51 yang biasanya memiliki afinitas tinggi terhadap

substrat

15

2) Famili CYP 1-3 yang biasanya memiliki afinitas rendah terhadap

substrat

3) Famili CYP 4 yang berperan dalam metabolisme asam lemak dan

xenobiotik

Famili CYP450 yang paling penting dalam metabolisme obat adalah

CYP3A4 (Ingelman-Sundberg et al., 2004). CYP3A4 merupakan bentuk

utama dari CYP450 dengan persentase jumlah yang cukup banyak (25% dari

seluruh famili CYP450 dan sangat penting dalam oksidasi obat (Guengrich,

1995; Shimada et al., 1994). Selain itu, CYP3A4 juga merupakan enzim yang

bertanggung jawab terhadap 50% metabolisme obat yang digunakan secara

klinis (Gambar 5) (Bertz and Granneman, 1997). Enzim ini sangat mudah

terinduksi oleh sejumlah obat maupun senyawa kimia tertentu. CYP3A4 juga

sangat penting dalam metabolisme makanan dan senyawa dari alam, seperti

flavonoid, mikotoksin (aflatoksin B1), pestisida dan sejumlah bahan

tambahan makanan (Guengrich, 1999).

Gambar 5. Jumlah relatif bentuk hepatic human cytochrome P450 di liver dan

peranannya dalam metabolisme obat klinis. Data tersebut diperoleh berdasarkan

klirens 315 obat, 56% di antaranya dimetabolisme oleh CYP450 primer dan 26% di

antaranya dimetabolisme oleh CYP450 yang belum diketahui. CYP3A4 merupakan

enzim yang bertanggung jawab terhadap 50% metabolisme obat yang digunakan secara

klinis (Bertz and Granneman, 1997).

Peranan relatif enzim

dalam memetabolisme

obat

Jumlah relatif enzim

dalam memetabolisme

obat

16

4. Daun Pepaya (Carica papaya L.)

1) Klasifikasi dan Morfologi Tanaman

Daun pepaya (Carica papaya L.) (Gambar 6) banyak dijumpai di

berbagai daerah di Indonesia dengan berbagai nama lokal. Nama-

nama lokal daun pepaya tersebut di antaranya, Pente (Aceh); Botik

(Batak Toba); Kates (Palembang); Kalikih (Minangkabau); Gedang

(Lampung); Gedang (Sunda); Kates (Jawa Tengah); Kates (Madura);

Gedang Kustela (Banjar); Kates (Sasak); Kampaya (Bima); Kala jawa

(Sumbawa); Padu (Flores); Papaya (Gorontalo); Papaya (Manado);

Unti Jawa (Makasar); Kaliki riaure (Bugis); Papaya (Halmahera);

Papae (Ambon); Palaki (Seram); dan Kapaya (Tidore).

Sedangkan klasifikasi ilmiah daun pepaya adalah sebagai berikut:

Divisi : Spermatophyta

Sub divisi : Angiospermae

Kelas : Dicotyledoneae

Bangsa : Violales

Suku : Caricaceae

Marga : Carica

Jenis : Carica papaya L.

Nama umum : Pepaya

(BPOM RI, 2008).

Habitus berupa perdu dengan tinggi ±10 m. Batang tidak

berkayu, silindris, berongga berwarna putih kotor. Daun tunggal,

17

bentuknya bulat, ujungnya runcing, pangkalnya bertoreh dan tepinya

bergerigi dengan diameter 25-27 cm, pertulangan menjari dengan

panjang tangkai 25-100 cm berwarna hijau. Bunga tunggal, bentuknya

bintang, terdapat di ketiak daun, berkelamin satu atau berumah dua.

Bunga jantan terletak pada tandan yang serupa malai, kelopak kecil

dengan kepala sari bertangkai pendek dan warnanya kuning, bentuk

mahkotanya terompet, tepinya bertajuk lima dan bertabung panjang

dengan warna putih kekuningan. Bunga betina berdiri sendiri,

mahkotanya lepas, kepala putiknya lima, duduk, bakal buahnya

beruang satu dan warnanya putih kekuningan. Buah buni, bentuknya

bulat memanjang, bergading, warna hijau muda bila masih muda dan

jingga bila sudah tua. Bentuk biji bulat panjang, kecil dan bagian

luarnya dibungkus selaput yang berisi cairan. Akar tunggang,

bercabang dan berwarna putih kekuningan (BPOM RI, 2008). Gambar

bagian-bagian tanaman pepaya dapat dilihat pada Gambar 6.

(a) (b) (c) Gambar 6. Bagian-bagian tanaman pepaya (Carica papaya L.).

(a) daun pepaya (b) bunga pepaya (c) buah pepaya

(BPOM RI, 2008).

18

2) Penelitian Terdahulu

Daun pepaya memiliki berbagai senyawa aktif yang mampu

meningkatkan total antioksidan dalam darah dan menurunkan tingkat

peroksidasi lipid, seperti papain, chymopapain, cystatin, tocopherol,

ascorbic acid, flavonoids, cyanogenic glucosides, dan glucosionalets

(Seigler et al., 2002). Daun pepaya muda memiliki aktivitas sebagai

agen antioksidan yang lebih tinggi dibandingkan dengan bagian lain

dengan menurunkan absorbansi larutan kontrol 1,1-difenil 1-2 pikril-

hidrazil (DPPH) dengan EC 50 sebesar 1.0 ± 0.08 mg/ml (Maisarah et

al., 2013). Aktivitas biologis daun pepaya ini, sebagian besar

merupakan kontribusi dari kaemferol dan quercetin. Kaemferol dan

quercetin merupakan senyawa yang ditemukan melimpah pada

banyak tumbuhan yang dapat dimakan, meliputi, sayuran daun, buah

dan minuman (Zhang and Zhuo, 2004), di mana kedua senyawa

tersebut memiliki aktivitas antioksidan (Chopra et al., 2000).

Menurut Canini et al (2007), ekstrak metanolik daun pepaya

mengandung quercetin dan kaemferol sebanyak 0,04 mg/g dan 0,03

mg/g daun kering, berdasarkan analisis kuantitatif menggunakan gas

chromatography-mass spectrophotometry (GC-MS). Namun, etanol

lebih dipilih sebagai pelarut dikarenakan etanol relatif lebih tidak

toksik dibandingkan dengan metanol (Pritchard, 2007). Selain itu,

kemampuan etanol dalam menyari senyawa antioksidan tidak berbeda

signifikan dengan metanol (Hamadou et al., 2014).

19

Quercetin (3,3’,4’,5,7-pentahidroksiflavon) tergolong senyawa

flavonoid yang dikarakterisasi oleh turunan fenil benzo(γ)piron

dengan dua cincin benzena yang dihubungkan oleh cincin piran atau

piron heterosiklik (Kuh-nau, 1976; Morand et al., 1998). Senyawa ini

memiliki efek anti-genotoksik melalui mekanisme antioksidan dan

modulasi metabolisme (Srinivas et al., 2013). Senyawa quercetin

berperan sebagai antioksidan melalui stabilisasi ROS dengan gugus

hidroksil yang dimilikinya, sehingga menyebabkan ROS menjadi

inaktif (Korkina and Avanas, 1997). Struktur kimia quercetin dapat

dilihat pada Gambar 7.

Gambar 7. Struktur kimia quercetin (Harwood et al.,2007).

Mekanisme senyawa antioksidan dalam menginaktivasi ROS

dapat terjadi melalui proses oksidasi senyawa antioksidan oleh ROS,

sehingga menghasilkan ROS yang inaktif. Senyawa antioksidan

menstabilkan ROS dengan peranan dari gugus hidroksinya yang

memiliki reaktivitas tinggi (Nijveldt, R.J., 2001). Reaksi inaktivasi

ROS oleh senyawa antioksidan dapat dilihat pada Gambar 8,

sedangkan visualisasi inaktivasi ROS oleh senyawa antioksidan dapat

dilihat pada Gambar 9.

20

Gambar 8. Reaksi inaktivasi ROS oleh senyawa antioksidan (Nijveldt, R.J.,

2001). Gugus hidroksi pada senyawa antioksidan akan menstabilkan ROS dan

membuatnya menjadi inaktif.

Gambar 9. Visualisasi inaktivasi ROS oleh senyawa antioksidan (Williams,

Carey A. et al., 2007). Senyawa stabil dalam tubuh, baik senyawa endogen maupun

eksogen akan mengalami reaksi metabolisme normal berupa oksidasi, sehingga

menghasilkan senyawa radikal bebas (ROS). Senyawa radikal bebas (ROS) akan

distabilkan oleh senyawa antioksidan, sehingga menjadi senyawa stabil yang inaktif.

5. Mammalian In Vivo Micronucleus Test

Mammalian in vivo micronucleus test merupakan suatu uji untuk

mendeteksi kerusakan yang diinduksi oleh agen uji pada kromosom atau

aparatus mitotik dari eritroblas melalui analisis eritrosit sebagai sampel pada

sel bone marrow dan atau sel darah perifer pada mamalia, biasanya roden

(OECD 474, 1997). Prinsip dari metode ini adalah bahwa mikronukleus akan

diekspresikan pada sel yang membelah secara tidak sempurna karena

mengalami kerusakan DNA. DNA yang rusak tidak mampu menuju benang

spindle saat mitosis, sehingga pada tahap telofase terbentuk membran nukleus

yang akan menutupi kromosom DNA yang rusak tersebut dan membentuk

fragmen nukleus kecil yang disebut mikronukleus (Zhou and Elledge, 2000).

Oksidasi

Senyawa stabil

Radikal bebas

Antioksidan

Senyawa stabil

21

Mikronukleus merupakan hasil dari kerusakan kromosom yang kemudian

tampak sebagai nukleus berukuran kecil di dalam sel. Mikronukleus mudah di

amati pada sel polikromatik eritrosit. Proses pembentukan mikronukleus pada

sel darah merah mamalia berkaitan dengan terganggunya proses eritropoiesis

oleh senyawa yang potensial genotoksik. Pada mamalia dewasa, organ

pembentuk sel darah merah yang aktif adalah sumsum tulang belakang dan

limpa. Pada organ tersebut, terdapat sel punca yang akan berkembang

menjadi sel calon darah merah (eritroblas) (Krishna and Hayashi, 2000).

Mikronukelus terbentuk ketika kromosom asentrik atau fragmen kromatid

atau seluruh kromosom tidak terdapat pada sel anak saat proses mitosis

lengkap, melainkan masih tetap berada di dalam membran nukleus (Fenech et

al., 2011).

Proses eritropoiesis terdiri dari dua tahap, yakni tahap proliferasi dan tahap

maturasi. Terjadinya paparan senyawa genotoksik pada proses proliferasi

dapat menyebabkan kerusakan pada DNA. Abnormalitas kromosom

menyebabkan fragmen kromosom tidak dapat bergabung dengan nukleus

anakan dan akan membentuk suatu mikronukleus pada fase pembelahan.

Selanjutnya pada tahap maturasi sel darah merah, eritroblast akan

berkembang menjadi sel-sel sebagai berikut:

1) Polychromatic Erytrocyte (PCE)

PCE adalah sel darah merah muda yang masih memiliki DNA di

dalamnya, sehingga apabila diberi perlakuan pengecatan Giemsa pada

preparatnya akan berwarna biru.

22

2) Normochromatic Erytrocyte (NCE)

NCE adalah sel darah merah yang telah matang, yakni sel darah merah

yang nukleusnya telah menghilang. Apabila diberi perlakuan pengecatan

Giemsa sel pada preparatnya, NCE tidak dapat menyerap Giemsa dan

akan berwarna abu-abu.

3) Micronucleated Polychromatic Erytrocyte (MNPCE)

MNPCE adalah sel darah merah muda yang mengandung

mikronukleus di dalamnya akibat adanya proses mutasi DNA

(Krishna and Hayashi, 2000).

Analisis jumlah rasio PCE/NCE akan mengGambarkan ketoksikan suatu

senyawa yang dipaparkan, sedangkan jumlah MNPCE menunjukkan tingkat

kerusakan genetik dalam sistem eritropoitik suatu makhluk hidup. Eritrosit

bermikronukleus yang terbentuk di sumsum tulang belakang dan limpa

tersebut akan bersirkulasi ke seluruh tubuh melalui pembuluh darah vena

sehingga memungkinkan pemeriksaan via darah tepi (Mac Gregor et al.,

2004). Proses screening dapat dilakukan baik secara in vitro maupun in vivo

dan sudah digunakan secara luas dalam studi biomonitoring manusia (Majer

et al., 2001; Neri et al., 2003).

6. Molecular Docking

Molecular docking merupakan metode utama dalam proses desain molekul

obat berbasis struktur (structure-based drug design, SBDD). Metode ini

dilakukan melalui simulasi secara komputasi yang memodelkan interaksi

antara ligan dan reseptor pada sisi aktifnya (Huang and Zhou, 2007). Protein-

23

Ligand ANT System (PLANTS) adalah program aplikasi penambatan molekul

berdasarkan algoritma Ant Colony Optimization (ACO) (Korb et al., 2006).

Software ini sederhana dan mudah diaplikasikan, namun PLANTS tidak

menyediakan fungsi preparasi protein, ligan, maupun visualisasi (Purnomo,

2011).

PLANTS tidak memiliki aplikasi untuk Windows, sehingga hanya bisa

dijalankan dengan LINUX. Penggunaan PLANTS dengan Windows

memerlukan Co-Pendrivelinux-KDE (suatu software untuk hibridisasi LINUX

dalam Windows), Yet Another Scientific Artificial Reality Application

(YASARA) (untuk visualisasi dan preparasi protein), serta ChemSketch (untuk

preparasi senyawa atau ligan yang akan di-docking-kan dengan protein target).

Hasil dari PLANTS adalah docking score yang menunjukkan potensi interaksi

ligan terhadap protein target. Senyawa yang memiliki skor docking terendah

merupakan ligan dengan konformasi terbaik pada protein target (Purnomo,

2011).

F. Landasan Teori

Ekstrak etanolik daun pepaya (Carica papaya L.) merupakan hasil

ekstraksi etanol daun pepaya yang teridentifikasi mengandung senyawa

quercetin. Berdasarkan penelitian terdahulu, ekstrak metanolik daun pepaya

mengandung senyawa flavonoid, di mana sebagian besar merupakan

quercetin dan kaemferol yang keduanya merupakan senyawa antioksidan.

Senyawa quercetin terdapat dalam jumlah yang lebih banyak dibandingkan

dengan kaemferol. Penelitian sebelumnya juga telah menyebutkan bahwa,

24

quercetin merupakan flavonoid paling kuat dalam melindungi tubuh melawan

reactive oxygen species (ROS) yang dihasilkan dari metabolisme normal

ataupun dari induksi kerusakan DNA oleh agen eksogen, sehingga quercetin

menjadi fokus utama dalam penelitian ini.

Dewasa ini, telah terjadi tingginya kasus ADR akibat penggunaan obat

sitostatik dengan efek samping berupa kerusakan DNA (efek genotoksik).

Salah satu obat sitotoksik tersebut adalah siklofosfamid yang merupakan obat

sitotoksik golongan nitrogen mustard yang sering digunakan untuk terapi

kanker lymphoma, leukemias, multiple myeloma, mycosis fungoides,

neuroblastoma, retinoblastoma, dan kanker payudara serta ovarium.

Nitrogen mustard merupakan bifunctional alkylating agents yang merusak

DNA melalui pembentukan guanin-guanin dan guanin-adenin interstrand

crosslink melalui transfer alkyl-groups pada basa DNA secara kovalen. Efek

genotoksik tersebut timbul dari metabolit genotoksik siklofosfamid akibat

metabolisme oleh enzim oksidase CYP450, terutama CYP3A4.

Strategi efektif untuk mengatasi efek genotoksik tersebut adalah dengan

menggunakan agen anti-genotoksik yang berasal dari bahan alam, yaitu

ekstrak etanolik daun pepaya. Senyawa quercetin yang diduga terkandung

dalam ekstrak etanolik daun pepaya memiliki efek antioksidan yang mampu

menghambat metabolisme siklofosfamid oleh CYP3A4, sehingga tidak

terbentuk phosphoramide mustard (PM) yang berperan sebagai ROS dan

menimbulkan efek genotoksik. Selain itu, mekanisme anti-genotoksik

tersebut juga dapat terjadi melalui inaktivasi ROS yang dihasilkan dari

25

induksi agen genotoksik siklofosfamid. Evaluasi efek genotoksik tersebut

dilakukan melalui mammalian in vivo micrnucleus test. Sedangkan,

mekanisme yang memperantarai aktivitas anti-genotoksik ekstrak etanolik

daun pepaya tersebut, kemudian dikonfirmasi melalui molecular docking

untuk mengetahui interaksi quercetin terhadap enzim oksidase CYP3A4

dibandingkan dengan siklofosfamid.

G. Hipotesis

1. Ekstrak etanolik daun pepaya berefek anti-genotoksik terhadap

siklofosfamid dengan parameter penurunan jumlah MNPCE/1000 PCE

dan kenaikan % PCE/(PCE+NCE) berdasarkan mammalian in vivo

micronucleus test.

2. Senyawa quercetin yang terkandung dalam ekstrak etanolik daun pepaya

mampu berinteraksi lebih kuat terhadap enzim oksidase CYP3A4

dibandingkan dengan siklofosfamid berdasarkan molecular docking.