9Waktu Optimum Produksi Senyawaantimikrob Isolat Bacillus sp.

Optimasi waktu produksiantimikrob dilakukan terhadap 3 isolatBacillus sp. terpilih yaitu, A21, F13, dan G3.Hasil uji aktivitas antimikob supernatankultur menunjukkan hanya supernatanBacillus sp. F13 yang membentuk zonabening pada uji tersebut.

Plot nilai OD600 dan diameter zonabening terhadap waktu inkubasi,menghasilkan kurva produksi senyawaantimikrob selama pertumbuhan Bacillus sp.F13 (Gambar 8).

Pengujian aktivitas antimikrobsupernatan Bacillus sp. F13 terhadap X.oryzae pv. oryzae menunjukkan bahwadiameter zona bening terbesar (d=0.38 cm)dihasilkan dari kultur yang diambil padaumur 12 jam yaitu, ketika kultur berada padaakhir fase logaritmik. Zona bening yangpaling luas menunjukkan waktu produksisenyawa antimikrob yang optimum.Diameter zona bening semakin mengecilketika kultur berada pada awal fase stasioner(12-48 jam inkubasi). Aktivitaspenghambatan sama sekali tidak terdeteksi(d=0 cm) pada pengamatan berikutnya(Gambar 8a).

Pengujian aktivitas antimikrobsupernatan Bacillus sp. F13 terhadap P.syringae pv. glycines menunjukkan bahwadiameter zona bening terbesar (d= 0.38 cm)dihasilkan dari kultur yang diambil padaumur 12 jam yaitu, ketika kultur berada padaakhir fase logaritmik. Aktivitaspenghambatan sama sekali tidak terdeteksi(d=0 cm) pada pengamatan berikutnya(Gambar 8b).

Pengujian aktivitas antimikrobsupernatan Bacillus sp. F13 terhadap P.fluorescens B menunjukkan bahwa diameterzona bening terbesar (d=0.06 cm) dihasilkandari kultur yang diambil pada umur 12 jamyaitu, ketika kultur berada pada akhir faselogaritmik. Diameter zona bening tidakmengalami perubahan ketika kultur beradapada awal fase stasioner (12-48 jaminkubasi) d=0.6 cm. Aktivitas penghambatansama sekali tidak terdeteksi (d=0 cm) padapengamatan berikutnya (Gambar 8c).

0

0.5

1

1.5

2

0 12 24 36 48 60 72Waktu Inkubasi (jam)

Log

pop

ulas

i sel

(cfu

/ml)

0

0.25

0.5

0.75

1

diam

eter

zon

aha

mba

t (cm

)

Log populasi sel diameter zona hambat

(a)

0

0.5

1

1.5

2

0 12 24 36 48 60 72Waktu Inkubasi (jam)

Log

pop

ulas

i sel

(cfu

/ml)

0

0.25

0.5

0.75

1

diam

eter

zon

aha

mba

t (cm

)

Log populasi seldiameter zona hambat

(b)

0

0.5

1

1.5

2

0 12 24 36 48 60 72Waktu Inkubasi (jam)

Log

pop

ulas

i sel

(cfu

/ml)

0

0.25

0.5

0.75

1

diam

eter

zon

aha

mba

t (cm

)

Log populasi seldiameter zona hambat

(c)

Gambar 8 Aktivitas antimikrob supernatankultur Bacillus sp. F13 selamainkubasi terhadap (a) X. oryzaepv. oryzae, (b) P. syringae pv.glycines, (c) P. fluorescens B.(data menunjukkan nilai rataan SE, n = 2).

PEMBAHASAN

Seleksi untuk mengetahui aktivitasantimikrob isolat-isolat Bacillus sp.dilakukan dengan uji antagonis terhadap 6bakteri uji yaitu, E. coli, S. aureus, X. oryzae

10

pv. oryzae, P. syringae pv. glycines, P.fluorescens A dan P. fluorescens B.Aktivitas penghambatan antimikrob ketigaBacillus sp. tersebut memiliki spektrumyang luas, karena mampu menghambatbakteri Gram positif dan Gram negatif.Aktivitas antimikrob dalam uji antagonisditunjukkan oleh adanya pembentukan zonabening disekitar koloni Bacillus sp.Pembentukan zona bening untuk E. coli danS. aureus membutuhkan waktu inkubasiselama 2 hari, sedangkan untuk X. oryzae pv.oryzae, P. syringae pv. glycines, dan P.fluorescens B membutuhkan waktu inkubasi3-4 hari.

Perbedaan waktu pembentukanzona bening dipengaruhi oleh kecepatanpertumbuhan bakteri uji. Koloni E. coli danS. aureus dapat teramati dalam waktu 24jam sedangkan koloni X. oryzae pv. oryzae,P. syringae pv. glycines, P. fluorescens Adan P. fluorescens B teramati setelahinkubasi 3-4 hari. Hal ini dikarenakan,waktu generasi E. coli dan S. aureus lebihpendek daripada X. oryzae pv. oryzae, P.syringae pv. glycines, P. fluorescens A danB. Waktu generasi adalah selang waktu yangdibutuhkan bagi sel untuk membelah diriatau untuk meningkatkan populasinyamenjadi dua kali lipat (Pelczar & Chan2006). Waktu generasi untuk E. coli dan S.aureus adalah 15-20 menit, sedangkanwaktu generasi X. oryzae pv. oryzae, P.syringae pv. glycines, dan P. fluorescensberturut-turut adalah 4-5 jam, 2.6 jam, dan2.8 jam (Pelczar & Chan 2006; Yamasaki etal 2006; West 2005; Klaus & Peter 1997).

Metode double layer merupakanmetode semi kuantitatif, karena data yangdihasilkan belum dapat dijadikan sebagaiukuran yang tepat. Oleh karena itu, aktivitasantimikrob dari ketiga isolat Bacillus sp.terpilih diamati lebih lanjut dengan ujikompetisi dalam kultur cair. Pada ujikompetisi, aktivitas antimikrob dari isolatterpilih diukur berdasarkan daya hambatnyaterhadap pertumbuhan populasi sel bakteriuji.

Daya hambat terhadappertumbuhan populasi bakteri uji dinyatakandalam persen penghambatan. Penghambatanpertumbuhan bakteri uji diantaranyadisebabkan oleh adanya senyawa antimikrobyang diekskresikan oleh Bacillus ke dalamkultur. Salah satu contoh antimikrob yangdihasilkan oleh genus Bacillus adalahbakteriosin megacin yang diproduksi oleh B.megaterium dan antibiotik basitrasin yang

diproduksi oleh B. subtilis (Tagg et al 1976;Williams et al 1996). Menurut Verschuere etal. (2000) penghambatan pertumbuhan tidakselalu berkaitan dengan produksi senyawaantimikrob seperti antibiotik, tetapi jugakarena adanya senyawa metabolit primeratau adanya perubahan pH.

Uji kompetisi dilakukan padabeberapa rasio inokulum Bacillus sp. danbakteri uji. Dari hasil pengamatan terhadappopulasi sel bakteri uji, ternyata persenpenghambatan ketiga isolat Bacillus tersebutterhadap pertumbuhan bakteri uji mencapailebih dari 85% untuk semua rasio inokulumyang dicobakan.

Hasil uji kompetisi menunjukkanbahwa isolat Bacillus sp. F13, G3, dan A21mampu menghambat X. oryzae pv. oryzae,dengan kuat berturut-turut pada saatinkubasi 24 jam (99.62%), 24 jam (98.3%),dan 72 jam (100%). Isolat Bacillus sp. F13,G3, dan A21 mampu menghambat P.syringae pv. glycines dengan kuat saatinkubasi ke 24 jam (100%). Isolat Bacillussp. F13, G3, dan A21 mampu menghambatP. fluorescens B dengan kuat berturut-turutsaat inkubasi 24 jam (100%), 24 jam(96.99%), dan 48 jam (97.73%). Hal inimenunjukkan bahwa isolat Bacillus sp. F13memiliki efisiensi dan efektifitas dalampengendalian patogen tanaman. Ini terkaitdengan mekanisme penyebaran penyakitpada tanaman yang cepat sehinggamembutuhkan pengendalian yang efektifdan efisien dalam waktu dan hasil produksi.

Ketiga isolat Bacillus sp. terpilihmemiliki kemampuan penghambatan yangberbeda-beda terhadap ketiga bakteri uji.Perbedaan penghambatan terlihat darilamanya waktu inkubasi yang dibutuhkanuntuk menghambat bakteri uji.

Semakin lama waktu inkubasi, dayahambat isolat Bacillus sp. A21 terhadapbakteri uji semakin meningkat. Hal initerlihat setelah akhir pengamatan selama 72jam, populasi sel dari bakteri uji mengalamipenurunan. Populasi sel P. syringae pv.glycines yang dikompetisikan denganBacillus sp. A21 sangat rendah selama masainkubasi pada berbagai rasio inokulum.Sementara, X. oryzae pv. oryzae dan P.fluorescens B populasi selnya mengalamipenurunan sejalan dengan lamanya waktuinkubasi.

Semakin lama waktu inkubasi dayahambat isolat Bacillus sp. F13 dan G3terhadap bakteri uji semakin menurun. Halini terlihat setelah akhir pengamatan selama

11

72 jam, populasi sel dari bakteri ujimengalami peningkatan. Populasi sel P.syringae pv. glycines yang dikompetisikandengan Bacillus sp. F13 dan G3 sangatrendah selama masa inkubasi pada berbagairasio inokulum. Sementara pada X. oryzaepv. oryzae dan P. fluoresens B populasi selmengalami peningkatan sejalan denganlamanya waktu inkubasi.

Ketiga isolat ini tidak dapatdiaplikasikan untuk formulasi campuranagen hayati dengan P. fluorescens B. Hal inidikarenakan, ketiga isolat Bacillus sp. inidapat menekan pertumbuhan dari P.fluorescens B. Menurut Arwiyanto et al.(2007), pencampuran mikroba agenpengendali hayati harus memilikikompatibilitas antar isolat, ini dimaksudkanuntuk mendapatkan kombinasi antar isolatyang tidak saling menghambat satu denganyang lain.

Penghambatan ketiga isolatBacillus sp. terhadap bakteri ujimenunjukkan bahwa ketiga isolat tersebutdapat diaplikasikan di lingkungan sebagaiagen pengendali hayati. Agen pengendalihayati Bacillus sp. diketahui mampumengendalikan beberapa bakteri patogentular tanah dan mampu memacupertumbuhan tanaman serta menghasilkanantimikrob yang dapat menekanpertumbuhan berbagai patogen tanaman(Modjo 1991).

Uji aktivitas antimikrob supernatanyang dilakukan menunjukkan hanyasupernatan isolat Bacillus sp. F13 yangmenghasilkan zona bening. Sedangkansupernatan 2 isolat lainnya (A21 dan G3)tidak membentuk zona bening. Hal ini bukanberarti kedua isolat tersebut tidakmengekskresikan senyawa antimikrob,karena pada uji antagonis kedua isolattersebut mampu membentuk zona bening.

Bakteriosin dapat dibedakan dariantibiotik, diantaranya dari prosesproduksinya. Bakteriosin dihasilkan padasaat pertumbuhan bakteri mencapai faselogaritmik, sedangkan antibiotik diproduksipada saat akhir fase stasioner (Jack et al.1995). Plot kurva pertumbuhan terhadapaktivitas antimikrob supernatan isolatBacillus sp. F13 menunjukkan senyawaantikmikrob diproduksi optimum pada akhirfase logaritmik. Pada B. thuringiensisproduksi bakteriosin juga terjadi pada fasepertumbuhan logaritmik (Torkar & Matijasic2003). Produksi bakteriosin butyricin olehClostridium acetobutyricum terjadi pada

akhir fase logaritmik (Tagg et al. 1976),sedangkan pada C. perfringen produksibakteriosin perfringocin terjadi pada awalfase stasioner (Clarke et al. 1975).Berdasarkan informasi tersebut didugasenyawa antimikrob yang dihasilkan olahisolat Bacillus sp. F13 adalah bakteriosin.

Mekanisme kerja bakteriosin dalammenghambat pertumbuhan bakteridiantaranya adalah menghambatpembentukan dinding sel target,menghambat pembentukan asam nukleatatau protein, serta membentuk pori-poripada membran sel target sehinggapermeabilitas membran sel terganggu(Williams et al. 1996).

Efektivitas bakteriosin tergantungpada konsentrasi bakteriosin, kemampuanionisasi, suhu, pH, dan fase pertumbuhan selindikator (Hurst 1981). Uji antagonismenunjukkan luas zona bening disekitarkoloni Bacillus sp. A21, F13, dan G3bertambah diameternya sampai padapengamatan 48 jam. Namun, setelahinkubasi 72 jam diameter zona beningmenjadi lebih kecil. Hal ini diduga karenainkubasi yang dilakukan lebih dari waktuoptimum produksi senyawa antimikrobdalam media. Dajani dan Wannamaker(1969) melaporkan inkubasi terlalu lamamenyebabkan aktivitas bakteriosin menurun,hal ini kemungkinan disebabkandiproduksinya inaktivator dan adanyareabsorbsi terhadap senyawa antimikrobyang diproduksi sel. Selain itu, menurut Joet al. (1996) jika waktu inkubasidiperpanjang maka aktivitas bakteriosinakan menurun karena terbebasnya proteasedari sel autolisis. Bakteriosin merupakanmolekul protein sehingga mudahterdegradasi oleh protease.

Bakteriosin diproduksi oleh bakteriGram positif maupun bakteri Gram negatif(Jack et al. 1995). Sebagian besarbakteriosin dihasilkan oleh bakteri Grampositif terutama paling banyak diteliti ialahdari genus Bacillus. Beberapa jenisbakteriosin yang dihasilkan oleh Bacillusdiantaranya ialah coagulin yang dihasilkanoleh B. coagulans I4 (Hyronimus et al. 1998).Bakteriosin Bacillus yang telahdiaplikasikan dalam bidang industri ialahbacillocin 490 yang dihasilkan oleh B.liceniformis (Martirani et al. 2002). Padamulanya aktivitas bakteriosin dinyatakanhanya menghambat spesies spesifik tetapibeberapa bakteriosin telah dibuktikanmemiliki spektrum aktivitas penghambatan

12

yang luas sehingga dapat diaplikasikansecara luas di industri (Jack et al. 1995).

SIMPULAN

Sebanyak 31 isolat Bacillus sp.diseleksi daya hambatnya terhadap S.aureus, E. coli, X. oryzae pv. oryzae, P.syringae pv. glycines, dan 2 isolatP. fluorescens dengan metode double layer.Tigabelas isolat diantaranya menunjukkanaktivitas penghambatan terhadap S. aureus,E. coli, dan X. oryzae pv. oryzae, 8 isolatmampu menghambat P. fluorescens A, 9isolat mampu menghambat P. fluorescens B,dan 8 isolat mampu menghambat P.syringae pv. glycines. Terpilih 3 isolatBacillus sp. yang memiliki IndeksPenghambatan (IP) paling tinggi terhadap X.oryzae pv. oryzae. Ketiga isolat tersebutadalah A21, F13, dan G3.

Isolat Bacillus sp. F13 dan G3 lebihcepat dan efektif menekan pertumbuhan X.oryzae pv. oryzae dan P. syringae pv.glycines dibandingkan Bacillus sp. A21.Isolat Bacillus sp. F13, G3, dan A21 mampumenekan pertumbuhan P. fluorescens.Sehingga, ketiga isolat Bacillus tersebuttidak dapat dibuat dalam bentuk formulasicampuran dengan P. flourescens.

Aktivitas antimikrob Bacillus sp.F13 menunjukkan bahwa zat antimikrobdiproduksi pada akhir fase logaritmikpertumbuhan.

SARAN

Perlu dilakukan penelitian lebihlanjut untuk melakukan pemurnian dankarakterisasi senyawa antimikrob isolatBacillus sp. A21, F13, dan G3, sehinggadapat ditentukan identitas senyawanya.Selain itu, perlu dilakukan uji antagonisantar ketiga Bacillus terpilih, sertapengkajian aplikasinya sebagai agenbiokontrol dalam skala rumah kaca danlapangan.

DAFTAR PUSTAKA

Asman A. 1996. Penyakit layu padatanaman nilam dan carapengendaliannya. Di dalam:Integrated Control on MainDisease of Industrial Crops.Prosiding Pertemuan IlmiahTahunan; Bogor, 13?14 Mar 1996.Bogor: Research Institute for Spice

and Medicinal Crops, Bogor. hlm.284?290.

Arwiyanto T, Maryudani YMS, Azizah NN.2007. Sifat-sifat fenotikPseudomonas fluorescens, agensiapengendali hayati penyakit lincatpada Tembakau Temanggung. J.Biodiversitas 8(2):147-151.

Clarke DJ, Robson RM, and Morris JG.1975. Purification of twoClostridium bacteriocins byprocedures appropriate tohydrophobic proteins. J.Antimicrob Agent Chemother7(2):256-264.

Dajani AS, Wannamaker LW. 1969.Demonstration of bactericidalsubstance against beta-hemolyticstreptococci in supernatant fluids ofstaphylococcal cultures. J Bacterial97(5):985-991.

Dirmawati SR. 2005. Penurunan intensitaspenyakit pustul bakteri kedelaimelalui strategi cara tanamtumpangsari dan penggunaanagensia hayati. J. AGRIJATI 1(1):7-10.

Hurst A. 1981. Nissin advances. J. ApplMicrobiol 27(3):85-123.

Hyronimus B, Marrec CL, Urdaci MC. 1998.Coagulin, a bacteriocin-likeinhibitory substance produce byBacillus coagullan I4.. J. ApplMicrobiol 85(4):42-50.

Irina VP, Philippe B, Bernard V, Bernard F.2001. In vitro anti-Heliobacterpylori activity of the probioticstrain Bacillus subtilis is due tosecreation of antibiotics. J.Antimicrobe Agent Chemother45(11):3156-3161.

Jack RW, Tagg JR, Ray B. 1995.Bacteriosin of Gram-positivebacteria. Microb Rev. 59(2):171-200.

Jo YB, Kyung MB, Sung-Koo, Hong-ki J.1996. Evaluation at optimumconditions for bacteriocinproduction from Lactobacillus sp.JB-42 isolated from kimichi. JMicrobiol Biotechnol 6(7): 63-67.

Klaus, Peter R. 1997. Pseudomonassyringae pathovars and relatedpathogens. Philadelphia:Lipponicott Williams & Wilkins.

Lisboa MP, Bonatto D, Bizani D, HenriquesJAP, Brandelli A. 2006.Characterization of a bacteriocin-