ANTI TIROSINASE

Pendahuluan

• Melanin = pigmen atau zat warna alami pada makhluk hidup

• Melanin berlebih = Timbul noda coklat pada kulit, terlalu berlebihan dapat menyebabkan hiperpigmentasi

• Pembentukan melanin:Melanosit Melanin(Proses ini dikatalisasi oleh sinar UV dan enzim tirosinase)

• Dengan menginhibisi enzim tirosinase proses pembentukan melanin melambat mencerahkan warna kulit

• Inhibitor enzim tirosinase antara lain:• Asam askorbat• Arbutin• Kojic acid• Merkuri• Hidrokinon

• Penelitian terus berlanjut untuk mendapatkan senyawa inhibitor tirosinase yang aman dan efisien

• Senyawa aktif dalam bahan alam yang berfungsi sebagai inhibitor tirosinase diantaranya adalah arbutin, asam elagat, oksiresveratrol, kloroforin, dan noratokarpanon, dan artokarpanon.

• Tanaman yang memiliki senyawa aktif sebagai inhibitor tirosinase biasanya juga memiliki senyawa aktif yang berfungsi sebagai antioksidan

Jurnal 1

POTENSI EKSTRAK Rhizophora sp. SEBAGAI INHIBITOR TIROSINASE

(Potency of Rhizophora sp. Extracts as Tyrosinase Inhibitor)Eti Rohaeti1, Irmanida Batubara1,2, Anastasia Lieke LDN1,

Latifah K Darusman1,21 Departemen Kimia FMIPA Institut Pertanian Bogor

2 Pusat Studi Biofarmaka LPPM Institut Pertanian bogor

Alat dan Bahan

ALAT

lempeng KLT analitikkertas saring Whatman nomor 1chamber,gelas pialagelas ukurpipet mohrpipet volumetrikpelat silika geltabung reaksineraca analitikpenguap putar vortex.

BAHAN

R. mucronata R. StylosaMetanol

METODE

Preparasi dan Ekstraksi Rhizophora sp.

Pemisahan bagian daun, batang, dan akar yang kemudian dikeringkan dan direndam dalam larutan metanol

Sampel tanaman kering ini diekstraksi dengan metanol dengan perbandingan 1:10 selama 24 jam sebanyak 3 kali ulangan

Ekstrak yang diperoleh disaring dengan menggunakan kertas saring Whatman nomor 1 dan dipekatkan dengan penguap putar pada suhu 300C.

Sampel daun, batang, dan akar R. mucronata dan batang R. stylosa yang telah kering selanjutnya diekstraksi

menggunakan metode maserasi.

• Maserasi dilakukan dengan cara merendam sampel ke dalam pelarut metanol. Rendemen yang diperoleh dapat dilihat pada Tabel 2.

• Berdasarkan hasil ekstraksi sampel Rhizophora sp.dari berbagai daerah, rendemen tertinggi dari ekstrak metanol daun, batang dan akar Rhizophora sp.berturut-turut terdapat pada daerah Gebang, Cirebon; Pantai Kapuk, Jakarta; dan Gebang, Cirebon, yaitu sebesar 28.33%; 16.06%; dan 14.36%.

• Berdasarkan Tabel 2, diperoleh bahwa sebagian besar ekstrak daun, batang, dan akar yang berasal dari pulau Jawa tidak memberikan nilai IC50 pada monofenolase dan difenolase hingga konsentrasi 2000 μg/ml.

• Hal ini mengindikasikan bahwa bagian daun, batang, dan akar R. mucronata dari pulau Jawa tidak memiliki potensi inhibitor tirosinase. Ekstrak daun, batang, dan akar R. mucronata dan R. stylosa dari Samboja, Kalimantan Timur memiliki potensi sebagai inhibitor tirosinase pada monofenolase. Ekstrak akar R. mucronata memiliki aktivitas inhibitor tirosinase lebih baik daripada daun dan batang dari segi monofenolase. Jika dibandingkan dengan batang R. mucronata, maka batang R. stylosa dari Samboja, Kalimantan Timur memiliki aktivitas inhibitor tirosinase yang lebih baik dalam hal monofenolase

KESIMPULAN

• Ekstrak R. mucronata yang berasal dari daerah pulau Jawa tidak memiliki aktivitas inhibitor tirosinase, sedangkan ekstrak R. mucronata dan R. stylosa daerah Samboja, Kalimantan Timur memiliki aktivitas inhibitor tirosinase. Aktivitas akar R. mucronata dan batang R. stylosa dari Samboja, Kalimantan Timur memberikan daya penginhibisi yang lebih baik, yaitu dari segi monofenolase (IC50: 15.34 μg/ml dan IC50: 38.02 μg/ml).

Pendahuluan

• Anti tirosinase menjadi penting karena dapat menghambat sintesa dari pigmen melanin

• Karena kemampuannya untuk menurunkan pigmentasi, anti tirosinase penting dalam beberapa bidang, meliputi industri kosmetik, sebagai obat, dan dalam industri makanan .

• Meskipun melanin menghasilkan zat yang efektif secara kuat melawan radiasi sinar UV, tetapi akumulasi melanin yang abnormal dapat menyebabkan masalah dalam bidang kecantikan seperti melasma, bintik-bintik, dan pikun

• Meskipun anti tirosinase dapat diperoleh dari dua cara yaitu secara alami dan sintesis, dilakukan upaya pencegahan untuk terjadinya komersialisasi pada inhibitor ini.

• Ada banyak jenis anti tirosinase seperti hidrokinon, derivat asam askorbat, asam azelat, retinoid, arbutin, dan kojic acid.

• Namun, telah diketahui bahwa beberapa pemutih, seperti hidrokinon dan kojic acid merupakan bahan yang berbahaya karena memiliki efek samping yang tidak diharapkan seperti sitotoksisitas, kanker kulit, dan dermatitis.

• Telah disintesis senyawa baru yang memiliki struktur berbeda yang dapat menjadi solusi dalam mengatasi gangguan pada kulit terkait dengan pigmentasi.‘

Tujuan

• Identifikasi dan karakterisasi antitirosinase baru. • Efek hambatan dari 3-DBP pada aktivitas tirosinase

murin dan, melanogenesis dievaluasi menggunakan model invitro dengan sel melanoma tikus B16F10.

• Selanjutnya digunakan tikus tanpa rambut HRM2 secara invivo. 3-DBP diidentifikasi sebagai senyawa pemutih kulit yang dapat digunakan dalam mengatasi hiperpigmentasi kullit tanpa senyawa yang bersifat sitotoksik.

Metode dan bahan

1. Bahan• 3-DBP mengandung 1 pirolidin-dion telah disintesis

menggunakan reaksi Wittig di dalam laboratorium.• Mushroom tirosinase L-tyrosine, α-melanocyte

stimulating hormone (α-MSH), dan reagen kimia lain yang dibeli dari Sigma (St.Louis, MO, USA).

• Antibodi terhadap tirosinase, microphtalmia-associated transcription factor (MITF), dan β-actin dibeli dari laboratorium bioteknologi Santa Cruz ( Santa cruz, CA, USA).

Sintesis dari (E)-3-(2,4-dihydroxybenzylidene)pyrrolidine-2,5-dione (3-DBP)

Kultur sel

• Sel melanoma murin B16F10 diperoleh dari American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA).

• Sel dikultur dalam media Dulbecco's Modified Eagle (DMEM), yang mengandung 10% serum janin sapi (FBS, Gibco, NY, USA), dan penisilin / streptomisin (100IU/50µg/mL) dengan kelembaban udara di atmosfer mengandung 5% CO2 pada suhu 37oC.

• Sel B16F10 dikultur dalam 24 sumuran untuk control hidup (MTT) dan 60 Π dish untuk uji ketersediaan melanin dan uji aktivitas tirosinase. Semua percobaan dilakukan 3 kali untuk meyakinkan keakuratannya.

Uji stabilitas sel • Uji viabilitas sel diperoleh dari 3-(4,5-dimethylthiazol-

2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT; Sigma). Selanjutnya 5 x 104 sel diletakkan pada masing-masing sumuran dari 24 sumuran.

• Setelah sel diberi 3-DBP pada rentang konsentrasi 10-200µM selama 24 jam, larutan MTT ditambahkan dan derivat tidak larut berasal dari sel dehidrogenase yang larut dalam campuran etanol dan dimetilsulfoksida (EtOH-DMSO, larutan 1:1).

• Serapan dari masing-masing sumuran pada 560 nm menggunakan microplate reader.

Evaluasi aktivitas mushroom tyrosinase

• 20 µL larutan cair dari tirosinase jamur (100 unit) ditambahkan pada 96 sumuran microplate dengan 200 µL campuran reaksi yang mengandung 1mM larutan L-tyrosine, 50 mM dapar fosfat (pH 6,5), dan bahan uji 3-DBP (0.5-10µM).

• Larutan uji diinkubasi pada suhu 25oC selam 30 menit. • Setelaah inkubasi, sejumlah dopachrome yang

dihasilkan oleh larutan pereaksidalam mikroplate reader dideteksi dengan spektrofotometri pada λ 492 nm (OD492).

• Konsentrasi hambatan -50 (IC50) adalah konsentrasi dari senyawa yang dapat menghambat respons standar sebesar 50%.

• Untuk menghitung mekanisme hambatan dari 3-DBP,dilakukan uji kinetik tirosin. Berbagai macam konsentrasi L-tyrosine (16, 8, 4, 2, 1mM) digunakan pada uji inhibisi.

• Sesudah pengujian, masing-masing hasil dihitung mengikuti plot Lineweaver-Burk.

• Hasil plot menunjukkan kecepatan reaksi (1/V) berbanding dengan konsentrasi substrat (1/S). Berdasarkan pada konvergensi garis pada plot, maka mekanisme inhibisi dapat ditemukan.

Penentuan kadar melanin• Pada penelitian ini jumlah melanin digunakan sebagai

indeks dari melanogenesis. • Secara singkat, sel B-16 diletakkan pada 60Π-dish dan

diinkubasi dengan atau tanpa 100 µM α-MSH, selanjutnya sel diinkubasi selama 48 jam dengan atau tanpa 3-DBP pada rentang konsentrasi dari 10 – 100 µM.

• Setelah dicuci 2X dengan PBS, sampel dilarutkan dalam 500 µL NaOH 1N. Sampel diinkubasi pada 60o C selama 1 jam dan diaduk untuk melarutkan melanin.

• Diukur serapannya pada λ 405 nm dibandingkan dengan kurva strandar melanin sintetis

Evaluasi aktivitas tirosinase sel• Aktivitas tirosinase pada sel B16F10 diukur

berdasarkan pada laju oksidasi L-DOPA. Sel diletakkan pada 60Π- well dishes dengan kepadatan 5×104 cells/mL..

• Sel B16 diinkubasi dengan atau tanpa 100µM α-MSH dan diuji selama 48 jam dengan berbagai macam konsentrasi (10-100µM) dari 3-DBP.

• Sel- sel digoreskan pada 500µL dari 50 µM dapar Na3PO4 (pH6.8) mengandung 25 µL dari 1% Triton X-100 dan 25 µL dari 0,1 µM fenilmetil-sulfonil florida dan dibekukan pada -80oC selama 30 menit

• Setelah diencerkan dan diaduk, ekstrak seluler diklarifikasi dengan cara sampel disentrifugasi pada 12000 X g selama 30 menit pada 4oC.

• Supernatan (80µL) dan 20 µL dari L-DOPA (2mg/ml) diletakkan pada p96-well palte, dan diukur serapannya pada λ492 nm dan dibaca setiap 10 menit selama 1 jam pada 37oC menggunakan ELISA plate reader.

Uji dengan western blot

• Sel hasil penggoresan /sel lisat (20µg dari masing-masing protein) dimasak selama 5 menit dalam gel- mengandung dapar (0,125 M Tris-HCl, pH6,8, 4% SDS, 10% 2-merkaptoetanol, dan 0,2 % biru bromfenol). Pada perbandingan 1:1, total protein setara dengan masing-masing sampel secara terpisah menggunakan SDS-PAGE pada 10% dan dipindahkan ke membran polivinilidin fluorida (PVDF).

• Membran secara cepat ditempatkan pada blocking buffer (5% susu nonfat) dalam 10 mM Tris, pH 7,5, 100mM NaCl, dan 0,1% Tween 20. Bercak disimpan pada suhu ruang selam 1 jam.

• Membran diinkubasi dengan antibody spesifik primer pada 4oC selama 24 jam, diikuti dengan inkubasi horseradish peroxidase conjugated anti-mouse antibody (Santa Cruz, 1:10,000), anti rabbit antibody (Santa Cruz, 1:10,000), atau anti-goat antibody (Santa Cruz, 1:10,000) pada 25 °C selama 1 jam .

• Pelabelan antibody dideteksi menggunakan West-zol Plus dan chemiluminescence Fluorchem TMSP (Alpha Innotech Corporation, San Leandro, CA, USA). Protein penanda bercak digunakan untuk menemukan bobot molekul.

Evaluasi aktivitas depigmentasi pada mencit tanpa bulu hmr2

• Efikasi depigmentasi secara in vivo dari 3-DBP diujicobakan pada hewan telah dilakukan oleh Universitas Nasional Pusan.

• Mencit tanpa bulu jantan berusia 6 minggu HRM-2 yang mengandung melanin diperoleh dari Laboratorium Hewan Hosino (Yasino, Saitama, Jepang) dan ditempatkan dalam ruang kontrol (23o C ± 1o C, kelembaban 55 ± 5%, 12 jam pencahayaan / ruang gelap) dengan pemberian air dan diet standar lab seperlunya.

• Setelah periode aklimasi (2 minggu), mencit dibagi menjadi 6 hewan dalam 5 kelompok secara acak

• 3-DBP disiapkan dalam 3 konsentrasi (0,4 ; 2; dan 10µM) dalam larutan propilen glikol dan etanol (3:7).

• Larutan kontrol dan larutan 3-DBP terlarut (200µL) dioleskan secara topikal pada tempat yang ditandai (3 cm X 3 cm) pada bagian kulit dorsal hewan sekali sehari.

• Hewan dipaparkan dengan UVB dalam sebuah CROSSLINKER (BEX-800, Ultra-Lum, Inc., Claremont, CA, USA) pada 150mJ/cm2.

• Warna kulit diukur menggunakan spektrofotometer CR-10 (Konica Minolta Sensing, Inc., Sakai, Osaka. Jepang) dimana warna dijelaskan berdasarkan nilai L*, a*, dan b* menurut sistem warna dari komisi internasional l’Edairage.

Pewarnaan fontana-masson• Kulit yang telah diberi 4% paraformoldehid

selama 1 malam pada suhu ruang dan diuji warna untuk melanin menggunakan kit pewarnaan Fontana-Masson dari American Mastertech, Inc (Lodi, CA, USA) mengikuti instruksi manufaktur.

• Secara singkat, lembaran kulit yang telah diwarnai dengan larutan Ag ammoniacal selama 60 menit pada 60o C diikuti dengan inkubasi dalam AuCl2 0,1% dan kemudian dalam Na2S2O3 5%

Hasil

• 3-DBP didesain dengan kombinasi karakter struktur dari resorsinol dan pirolidin-2,5-dion menjadi 1 senyawa. 3-DBP (gambar. 1a) disiapkan dengan reaksi Wittig antara 2,4-dihidroksibenzaldehid dan trifenilfosforidenil suksinamid, yang telah disintesis dari reaksi adisi Michael dari trifenilfosfin menjadi maleimid (gambar 1b).

• Proses reaksi Wittig dilakukan dalam refluk perlahan dengan metanol akan dihasilkan 3-DBP sebanyak 82 % yang padat dan berwarna coklat pucat. Isomer dengan konfigurasi (E) diperoleh dari filtrasi dari pengendapan dalam reaksi Wittig.

• Struktur 3-DBP diperoleh dengan 1H dan 13C NMR dan analisis spektrometri massa.

Penemuan efek anti melanogenesis dalam mushroom tyrosinase

• Dalam gambar 2a, tergambar aktivitas hambatan tirosinase

• Nilai IC50 dari 3-DBP dan faktor pembanding (reservatrol dan asam kojat) ditunjukkan dalam gambar 2b. Nilai IC50 yang rendah dari 3-DBP mengindikasi bahwa memiliki nilai potensial dibandingkan reservatrol dan asam kojat yang digunakan sebagai kontrol positif

Evaluasi aktivitas depigmentasi 3-dbp dalam klutur sel

• Digunakan sistem sel melanoma B16F10 untuk mengevaluasi aktivitas depigmentasi dari 3-DBP

• Hasil uji invitro dari sel B16F10 dengan 3-DBP untuk pertahanan sel , aktivitas tirosinase dan keberadaan melanin ditunjukkan pada gambar 3

• Hasil uji viabilitas menggunakan MTT untuk sel B16F10 (gambar. 3a) menunjjukkan bahwa 3-DBP relatif tidak bersifat sitotoksik pada sel

Efek 3-dbp dalam pigmentasi kulit secara invivo

• Efek hambatan dari 3-DBP dalam pigmentasi kulit secara in vivo yang diuji pada kandungan melanin dari mencit tanpa bulu ditunjukkan dalam gambar. 4a

• Hewan yang diberi larutan 3-DBP selama 3 hari dan diberi paparan UVB tidak menunjukkan adanya iritasi kulit

• Paparan UVB mengurangi pigmentasi yang diwakili oleh nilai L* (gambar 4b)

Kesimpulan

• Identifikasi 3-DBP sebagai senyawa antimelanogenik baruyang diuji secara invitro dan invivo

• Senyawa yang dapat menurunkan srimulasi melanogenesis melalui α-MSH , disamping hambatan non kompetitif tirosinase secara in vitro

• 3-DBP juga menunjukkan efikasi yang baik melawan melanogenesis akibat induksi UVB pada model hewan.