DISOSIASI JARINGAN, PENENTUAN KEPADATAN DAN VIABILITAS SEL

Oleh :Nama: Bagus Hendrawan NIM: B1J013184Rombongan: IKelompok: 4

LAPORAN PRAKTIKUM KULTUR JARINGAN HEWAN

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAANUNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMANFAKULTAS BIOLOGIPURWOKERTO2015III. HASIL DAN PEMBAHASANA. PembahasanHasil praktikum disosiasi jaringan, penentuan kepadatan dan viabilitas sel diperoleh data perhitungan dari rombongan I kelompok 1, yaitu jumlah kepadatan sel yang diperoleh 13 x 106 sel/ml dan viabilitas sel yang diperoleh adalah 55% dari total sel 18,5 x 107 sel/ml dalam 0,07g hepar ikan. kelompok 2, yaitu jumlah kepadatan sel yang diperoleh 6,2 x 105 sel/ml dan viabilitas sel yang diperoleh adalah 39,74% dari total sel 88,5 x 107 sel/ml dalam 0,07g hepar ikan. kelompok 3, yaitu jumlah kepadatan sel yang diperoleh 22 x 105 sel/ml dan viabilitas sel yang diperoleh adalah 43,56% dari total sel 27,5 x 106 sel/ml dalam 0,07g hepar ikan.kelompok 4, yaitu jumlah kepadatan sel yang diperoleh 128 x 105 sel/ml dan viabilitas sel yang diperoleh adalah 51,17% dari total sel 18,28 x 107 sel/ml dalam 0,07g hepar ikan. Hasil yang diperoleh masing-masing kelompok menunjukkan hasil kepadatan sel, viabilitas sel, dan total sel yang berbeda-beda dari proses disosiasi jaringan hepatopankreas ikan, hal ini dapat disebabkan oleh pengaruh beberapa faktor. Faktor-faktor yang dapat mempengaruhi hasil praktikum diantaranya adalah konsentrasi masing-masing larutan medium harus tepat, usia organisme yang digunakan untuk disosiasi umumnya semakin tua suatu organisme maka viabilitas selnya akan semakin berkurang, aseptivitas di sepanjang jalannya praktikum harus selalu dijaga agar terhindar dari resiko kontaminan yang dapat mempengaruhi hasil dari praktikum, ketepatan dan ketelitian saat melakukan penghitungan menggunakan haemocytometer juga mempengaruhi hasil yang didapat, selain itu faktor lain seperti kondisi suhu yang sesuai (37%) dan waktu yang tepat juga dapat menentukan efektifitas hasil praktikum. Teknik kultur sel digunakan untuk mempelajari ekspresi gen dan uji sitotoksik. Kultur sel primer saat ini banyak diaplikasikan untuk penelitian di bidang biologi, termasuk diantaranya studi mengenai proses diferensiasi, efek obat-obatan, serta analisa kromosomal. Tahap pertama yang dilakukan untuk mendapatkan sel donor adalah disosiasi jaringan dengan tujuan memisahkan sel-sel bagian atau jaringan pengikat tempatnya melekat, dan menghilangkan bagian-bagian yang nekrotik, pembuluh darah dan lemak yang menempel. Jaringan dapat didisosiasi secara mekanik melalui proses pencacahan dan pemipetan secara perlahan-lahan. Cara lain adalah secara enzimatik, yaitu dengan menggunakan enzim-enzim tertentu seperti tripsin, kolagenase, elastase, hyaluronidase, DNase, pronase atau variasi dari beberapa jenis enzim dalam larutan dapar atau medium tertentu sampai diperoleh suspensi sel tunggal (Worthington, 2003). Selain bertujuan untuk mendapatkan suspensi sel yang tunggal, teknik disosiasi yang efektif seharusnya menghasilkan suspensi sel yang memiliki viabilitas tinggi dan dapat meminimumkan terjadinya proses agregasi sel kembali pasca disosiasi (Freshney, 2005).Praktikum kali ini menggunakan 3 macam medium, yaitu handling medium, disociating medium dan washing medium. Handling medium merupakan salah satu medium yang memiliki fungsi untuk menjaga dan mempertahankan sel agar tidak mengalami dehidrasi. Setiap 1 ml handling medium terdiri atas 950 ml medium DMEM ditambah 50 ml antibiotik. Setiap 1 ml disociating medium terdiri atas 850 ml medium dasar ditambah 50 ml antibiotik dan 100 ml tripsin-EDTA. Setiap 1 ml washing medium terdiri atas 90% medium dasar ditambah 10% suplemen serum. Salah satu variasi dari media Eagles yaitu Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM) yang mengandung vitamin dan asam amino 4 kali lebih besar dan mengandung 2-4 kali lebih banyak glukosa dari medium Eagles (Maat, 2011).Antibiotik digunakan untuk menghindari adanya resiko kontaminasi dari patogen atau mikroba lain yang tidak diharapkan. Tripsin dikenal sebagai enzim pengurai yang kuat (Worthington, 2003). Tripsin dapat memecah ECM sehingga sel dengan jaringan terpisah. Penambahan serum berfungsi untuk menekan aktivitas tripsin dan memberikan zat nutrisi yang dibutuhkan oleh sel selama proses disosiasi berlangsung (Freshney, 2005). Pemberian serum pada medium disosiasi biasanya dilakukan untuk disosiasi yang menggunakan konsentrasi tripsin tinggi dan dalam waktu inkubasi yang lama agar sel tetap kuat. Pemberian tripsin dengan konsentrasi tinggi bertujuan agar penempelan antar sel tidak terjadi (Brown et al., 2007). Serum dapat menginaktifkan fungsi tripsin karena di dalam serum terdapat anti-tripsin, oleh karena itu meskipun aktivitas disosiasi tinggi disebabkan oleh kedua enzim yang berperan dalam proses disosiasi tetapi viabilitas sel pada larutan disosiasi tetap tinggi. Serum juga bermanfaat untuk melindungi medium dari efek toksisitas senyawa-senyawa tertentu pada media yang digunakan (Mather & Roberts, 1998).Organ yang digunakan dalam praktikum disosiasi kali ini adalah bagian dari hepatopankreas ikan, bagian ini dipilih karena memiliki struktur jaringan yang lunak dan mudah untuk dilakukan proses disosiasi jaringan, menentukan kepadatan sel dan viabilitas sel. Viabilitas didefinisikan sebagai jumlah sel-sel yang mampu berkembang dalam medium kultur. Cara untuk mengukur viabilitas sel dan kepadatan sel dimulai dengan mengambil sebagian kecil (9 bagian) dari suspensi sel hasil disosiasi kemudian supernatan dibuang dan pellet diberi pewarna dengan pewarna trypan blue dan kemudian dihomogenkan. Pellet kemudian diletakkan pada haemocytometer dan diamati menggunakan mikroskop cahaya. Interpretasi yang tampak pada mikroskop adalah sel yang mati akan menyerap warna trypan blue, sedangkan sel yang hidup tidak akan menyerap warna. Proporsi sel yang hidup kemudian dihitung menggunakan haemocytometer. Kepadatan sel dapat diperoleh dengan menghitung jumlah rata-rata 5 kotak sedang dkalikan 2,5 dikalikan lagi dengan 105. Viabilitas sel dapat dihitung dengan rumus jumlah total sel yang hidup dibagi dengan jumlah total sel yang dihitung dikalikan dengan 100%. DAFTAR REFERENSIBrown, C. 2007. Angiogenesis: In Vitro Systems. In Vitro Systems, London.

Echalier, G. 1997. Drosophila Cell in Culture. Academic Press, New York.

Freshney, R. I. 2010. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 7th ed. John Wiley & Sons, Inc., New York.

Goosen, M. F. A., Daugulis, A. J., dan Faulkner. 1993. Insect Cell Culture Enginering. Marcel Dekker. Inc., New York.

Livy, Winata. 1992. Teknik Kultur Jaringan Tumbuhan. Pusat Antar Universitas Bioteknologi IPB, Bogor. Maat, Suprapto. 2011. Teknik Dasar Kultur Sel. Airlangga University Press, Surabaya.

Mather, Jennie. P., dan Penelope, E. Roberts. 1998. Introduction to Cell and Tissue Culture: Theory and Technique. Plenum Press, New York.

Worthington Biochemical Corporation. 2003. Cell Isolation Theory, Book: Tissue Dissociation, New York.