49

PENGARUH POLARITAS DAN KONSENTRASI EKSTRAK ANDALIMAN TERHADAP PERTUMBUHAN Bacillus cereus

ABSTRAK

Ekstraksi andaliman secara bertingkat dengan heksana, etilasetat dan metanol, dan masing-masing menghasilkan ekstrak nonpolar, semipolar dan polar. Ekstrak etilasetat dan ekstrak metanol andaliman dapat menghambat pertumbuhan Bacillus cereus, sedangkan ekstrak heksana tidak menunjukkan adanya aktivitas penghambatan.

Secara umum ekstrak etilasetat menghasilkan penghambatan yang relatif lebih tinggi dibandingkan ekstrak metanol. Fase pertumbuhan eksponensial B. cereus adalah fase yang paling peka terhadap ekstrak etilasetat dibandingkan fase adaptasi dan stasioner. Konsentrasi ekstrak etilasetat 10-50% (w/w) pada fase eksponensial menunjukkan diameter penghambatan terhadap B. cereus berkisar 12.42-19.22 mm. Nilai MIC dan MBC ekstrak etilasetat terhadap B. cereus sebesar 0.20 dan 1.20%. Aktivitas penghambatan ekstrak etilasetat lebih tinggi baik terhadap spora maupun sel vegetatif. Bila dibandingkan dengan antibiotik (penisilin G, streptomisin dan polimiksin) aktivitas antibakteri ekstrak andaliman terhadap B. cereus hanya kali lebih rendah.

PENDAHULUAN

Pemilihan pelarut organik yang digunakan dalam ekstraksi komponen

bioaktif tanaman merupakan faktor penting dan menentukan untuk mencapai

tujuan dan sasaran ekstraksi komponen. Dengan mengetahui sifat senyawa yang

akan diekstraksi dapat dipilih pelarut yang sesuai berdasarkan polaritasnya.

Senyawa polar lebih mudah larut dalam pelarut polar dan senyawa nonpolar lebih

mudah larut dalam pelarut nonpolar, sedangkan semipolar dapat larut diantara

pelarut polar dan nonpolar. Derajat polaritas tergantung pada ketetapan dielektrik ,

semakin besar tetapan dielektrik, maka pelarut semakin polar (Houghton dan

Raman 1998).

Houghton dan Raman (1998) lebih lanjut mengemukakan bahwa secara

umum terdapat tiga metode ekstraksi, yaitu metode maserasi, refluks dan

perkolasi. Selain itu dapat dilakukan ekstraksi bertingkat dengan menggunakan

pelarut yang berbeda, secara berturut-turut mulai dengan pelarut nonpolar

(n-heksana, siklo heksana, toluena dan kloroform) lalu menggunakan pelarut yang

semipolar (etilasetat, diklorometan dan dietileter), kemudian dengan pelarut polar

(metanol, etanol dan air). Dari proses ekstraksi bertingkat seperti ini akan

50

dihasilkan ekstrak awal (ekstrak kasar) yang mengandung berturut-turut senyawa

nonpolar, semipolar dan polar (Hostettmann et al. 1997).

Hasil penelitian Ardiansyah (2001) yang menggunakan ekstraksi

bertingkat metode maserasi dan refluks dengan pelarut heksana, etilasetat, dan

metanol menunjukkan bahwa konsentrasi 5% ekstrak etilasetat andaliman mampu

menghambat B. cereus sebesar 7.1 mm. Selanjutnya Yasni (2001) menyatakan

bahwa ekstrak andaliman mengandung minyak atsiri yang dapat menyebabkan

penghambatan terhadap bakteri patogen. Hasil pengujian ekstrak yang diperoleh

dengan metode refluks menunjukkan aktivitas penghambatan lebih rendah

dibandingkan dengan metode maserasi (Ardiansyah 2001). Penelitian ini

bertujuan untuk mengetahui lebih mendalam pengaruh polaritas dan konsentrasi

ekstrak andaliman terhadap aktivitas antibakteri pada beberapa fase pertumbuhan

B. cereus dengan menggunakan metode difusi sumur.

METODOLOGI

Bahan dan alat

Bahan yang digunakan adalah buah andaliman Varietas S imanuk, yang

berasal dari Medan dan diperoleh dari Pusat Pasar Senen Jakarta. Kultur Bacillus

cereus FNCC 134 diperoleh dari koleksi kultur Pusat Antar Universitas Pangan

dan Gizi, Universitas Gadjah Mada (UGM), Yogyakarta.

Analisis Proksimat (Apriyantono et al. 1989)

Pengujian proksimat yang dilakukan adalah kadar air (metode oven), kadar

protein (metode Kjeldhal-mikro), kadar lemak (metode soxhlet), kadar abu total,

kadar karbohidrat (by difference).

Ekstraksi dengan Metode Maserasi (Harbone 1996)

Ekstraksi dilakukan dengan perbandingan bahan dan pelarut 1:4 (w/v).

Proses ekstraksi dilakukan secara bertingkat dengan metode maserasi,

menggunakan pelarut heksana untuk memperoleh ekstrak nonpolar; ampas

diekstraksi lebih lanjut dengan pelarut etilasetat untuk memperoleh ekstrak

semipolar; dan kemudian ampas yang diperoleh diekstraksi dengan pelarut

metanol untuk memperoleh ekstrak polar. Secara rinci dapat dilihat pada diagram

alir proses ekstraksi menggunakan metode maserasi (Gambar 4.1).

51

Buah Andaliman (pencucian, sortasi, pengeringan beku)

Gambar 4.1 Diagram Alir Proses Ekstraksi Andaliman Dengan Metode Maserasi

Ekstraksi dengan pelarut nonpolar (heksana)

Sonikasi (15 menit)

Ampas

Inkubasi bergoyang suhu 370C, 24 jam

Filtrat

Ekstraksi dengan pelarut semipolar (etilasetat)

Evaporasi (450C), 45 menit

Sonikasi (15 menit)

Inkubasi bergoyang suhu 370C, 24 jam

Ekstrak no npolar

Filtrat

Evaporasi (450C), 1.5 jam

Ekstraksi dengan pelarut polar ( metanol)

Sonikasi (15 menit)

Inkubasi bergoyang suhu 370C, 24 jam

Ampas

Filtrat

Evaporasi (450C), 2 jam

Ampas

Ekstrak polar

Ekstrak semipolar

di ulangi

di ulangi

di ulangi

52

Penentuan Fase Pertumbuhan B. cereus (Lin et al. 2000)

Sebanyak 10 l suspensi diinokulasikan ke dalam 10 ml NB (nutrient

broth) dan diinkubasi pada suhu 370C selama 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 16, 20,

25 jam (Harrigan 1998); Lin et al. 2000). Pada setiap waktu inkubasi dilakukan

penghitungan jumlah sel dengan metode pour plate menggunakan media NA

(nutrient agar) (Harrigan 1998).

Pengujian Antibakteri Ekstrak Andaliman Menggunakan Metode Difusi Sumur (Garriga et al. 1993)

Pengujian ini menggunakan ekstrak etilasetat dan metanol masing-masing

sebanyak 60 l ekstrak dengan konsentrasi 0, 10, 20, 30, 40, dan 50% (w/w). Cara

pembuatan konsentrasi masing-masing ekstrak andaliman dapat dilihat pada

Lampiran 2, sedangkan kontrol menggunakan pelarutnya masing-masing.

Penentuan aktivitas antibakteri berdasarkan zona penghambatan yang ditunjukkan

dengan diameter areal bening.

Pengujian Kualitatif Komponen Fitokimia Ekstrak Andaliman (Harbone

1996)

Pengujian ini dilakukan untuk menentukan penggolongan ekstrak

andaliman nonpolar, semipolar dan polar pada komponen alkaloid, fenol

hidrokuinon, terpenoid, steroid, flavonoid dan saponin.

Penentuan MIC dan MBC Ekstrak Andaliman (Kubo et al. 1995)

Ke dalam 14 tabung ekstrak andaliman dengan konsentrasi 0.0, 0.2, 0.4,

0.8, 1.2, 1.6, 2.0, 2.4, 2.8, 3.2, 3.6, 4.0, 5.0, dan 6.0% (w/w) diinokulasikan 30 l

suspensi B. cereus, lalu diinkubasi 370C selama 24 dan 48 jam. Nilai MIC (%)

yaitu konsentrasi minimum ekstrak yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri

uji sebanyak 90% selama 24 jam. Nilai MBC diperoleh dengan menentukan

konsentrasi terendah dari 14 seri tabung uji yang menunjukkan penurunan

pertumbuhan bakteri uji secara drastis (> 99.9%) setelah diinkubasi 48 jam

dibandingkan dengan jumlah bakteri uji awal (nol jam).

53

Pengaruh pH terhadap Aktivitas Ekstrak Andaliman (Carson dan Riley 1995)

Sebanyak 25 ml agar yang mengandung B. cereus pada fase eksponensial

(106 cfu/ml) dituangkan ke dalam cawan petri hingga ketebalan 4 mm. Setelah

agar membeku, dibuat sumur dengan diameter 6 mm dan dimasukkan 60 l

ekstrak yang telah diatur pHnya masing-masing pada pH 4, 5, 6 dan 7. Penentuan

pengaruh pH berdasarkan zona penghambatan yang efektif, ditunjukkan dengan

diameter areal bening.

Pembandingan Potensi Bakterisidal Ekstrak Andaliman dengan Streptomisin, Polimiksin B dan Penisilin G (Lin et al. 2000)

Pengujian dilakukan dengan metode difusi sumur (Garriga et al. 1993)

pada konsentrasi antibiotik masing-masing sebesar 10, 100, 1000 g/l (Lewis

et al. 2004) untuk polimiksin B, streptomisin dan penisilin G, sedangkan

konsentrasi ekstrak andaliman 4000 g/l (Ardiansyah 2001). Penentuan potensi

bakterisidal dari ekstrak terhadap B. cereus didasarkan pada zona penghambatan

yang ditunjukkan dengan diameter areal bening untuk masing-masing antibiotik

dan ekstrak andaliman.

Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak Andaliman terhadap Spora (Nuraida et al. 1999)

Suspensi B. cereus mengandung 106 cfu/ml spora/sel vegetatif diuji

dengan metode difusi sumur (Garriga et al. 1993) dengan ekstrak uji sebanyak

60 l. Untuk mengetahui pembentukan spora pada B. cereus terlebih dahulu

bakteri ditumbuhkan pada suhu 37OC dan diamati pembentukan sporanya setelah

diinkubasi 24, 48, 72 dan 96 jam.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Rendemen, Proksimat dan Sifat Fisiko Kimia Andaliman

Hasil analisis proksimat andaliman dan rendemen minyak atsiri yang

dihasilkan dapat disimak pada Tabel 4.1. Kadar lemak buah andaliman (2.58%)

lebih tinggi daripada kadar protein (1.93%) sehingga hasil ekstraksi yang

54

diperoleh dengan pelarut nonpolar juga leb ih tinggi dibandingkan dengan ekstrak

semipolar maupun polar. Rendemen ekstrak bubuk andaliman berdasarkan

polaritas pelarut dan hasil analisis kualitatif komponen aktif dari masing-masing

jenis ekstrak andaliman dapat dilihat pada Tabel 4.2.

Tabel 4.1 Analisis Proksimat dan Kandungan Minyak Atsiri Andaliman

Variabel pengamatan Jumlah (%)

Kadar air 67.71 Kadar protein 1.93 Kadar lemak 2.58 Kadar abu total 1.80 Kadar karbohidrat 25.98 Kadar air andaliman setelah kering beku (dry basis) 6.23 Rendemen andaliman kering beku 32.29 Kadar minyak atsiri andaliman segar (wet basis) 8.01

Tabel 4.2 Rendemen dan Hasil Analisis Kualitatif Komponen Aktif

Ekstrak Andaliman

Komponen aktif Ekstrak Heksana

Ekstrak Metanol

Ekstrak Etilasetat

Rendemen (%) 6.30 4.15 3.17 Alkaloid + + + Tanin - + - Fenol Hidrokuinon - + + Flavonoid + + + Triterpenoid + + + Saponin - + + Steroid + + +

Keterangan: + : mengandung komponen - : tidak mengandung komponen

Kadar air bubuk andaliman cukup rendah (6.23%) dan rendemen buah

setelah pengeringan beku relatif tinggi (32.29%). Demikian pula rendemen

minyak atsiri andaliman segar yang diperoleh cukup tinggi, (8.01% w/w)

dibandingkan dengan minyak atsiri biji atung sebanyak 1.79% (Murhadi 2002),

sereh segar sebanyak 0.25 -0.50% (Oyen dan Nguyen 1999) atau minyak atsiri

kunyit segar sebanyak 3 5% (Purseglove 1981). Rendemen yang relatif tinggi

dan tingginya kandungan minyak atsiri buah andaliman ini merupakan potensi

55

untuk pemanfaatannya sebagai pengawet pangan alami. Profil komponen aktif

minyak atsiri andaliman yang dilaporkan Yasni (2001) menyatakan terdapat 11

komponen dengan 5 komponen utama yaitu a-pinen, limonen, geraniol, sitronella

dan geranil asetat. Komponen minyak atsiri tersebut dapat menghambat

pertumbuhan bakteri patogen (E. coli, Pseudomonas, B. cereus, dan S. aureus)

dan kapang (Fusarium sp , Penicillium sp dan Aspergillus flavus).

Pada Tabel 4.2 dapat dilihat bahwa rendemen dengan pelarut heksana,

etilasetat dan metanol berturut-turut sebesar 6.30, 4.15 dan 3.17%. Menurut

Houghton dan Raman (1998), ekstrak heksana (nonpolar) mengandung

komponen yang bersifat nonpolar seperti lilin, lemak dan minyak atsiri,

sedangkan ekstrak etilasetat (semipolar) sebagian besar mengandung senyawa-

senyawa alkaloid, aglikon-aglikon, dan glikosida. Ekstrak metanol (polar)

terutama mengandung kelompok senyawa gula, asam-asam amino, glikosida dan

kelompok senyawa yang juga larut dalam petroleum eter, heksana, kloroform,

etilasetat, etanol dan air dalam jumlah dan proporsi berbeda-beda.

Tingginya rendemen ekstrak nonpolar andaliman menunjukkan bahwa

komponen yang dapat larut dalam heksana lebih banyak dibandingkan komponen

semipolar (etilasetat) maupun komponen polar (metanol). Selain itu rendemen

ekstrak nonpolar yang tinggi dapat juga disebabkan karena pelarut yang

digunakan pertama adalah heksana. Kemampuan pelarut heksana untuk

melarutkan banyak kelompok senyawa organik terutama dalam bentuk senyawa

nonpolar suatu campuran organik dapat menghasilkan rendemen lebih besar.

Pada penelitian ini penghilangan pelarut dilakukan dengan menggunakan

vakum rotavapor pada suhu 450C dan dikeringbekukan hingga terbentuk

konsentrat pekat. Penghilangan pelarut pada suhu 450C kemungkinan komponen

aktif andaliman masih belum mengalami perubahan, hal ini merupakan salah satu

penyebab tingginya rendemen ekstrak yang diperoleh.

Komponen-komponen alkaloid dalam jaringan tanaman dapat diekstrak

melalui beberapa metode, diantaranya dengan metode maserasi menggunakan

aseton (Ramsewak et al. 1999); metode homogenisasi menggunakan pelarut

etanol (polar) dalam etilasetat (Holstege et al. 1995); dan metode soxhlet

56

menggunakan metanol yang diakhiri dengan ekstraksi menggunakan diklorometan

(Brooke et al. 1996).

Pada Tabel 4.2 dapat dilihat pula bahwa komponen aktif yang terdapat

pada ekstrak etilasetat dan metanol adalah alkaloid, fenol hidrokuinon, flavonoid,

triterpenoid, saponin, steroid, sedangkan tanin hanya terdapat pada ekstrak

metanol. Puuponen-Pimia et al. (2001) melaporkan bahwa komponen fenolik

yang terkandung pada ekstrak berry mampu menghambat beberapa bakteri Gram

negatif, diantaranya adalah Salmonella enterica SH-5014 dan E. coli CM871.

Dari beberapa hasil penelitian dapat diketahui bahwa senyawa-senyawa

fenolik tanaman yang telah terbukti memiliki aktivitas antibakteri diantaranya

adalah turunan dari p-benzekuinon sepert i: 2,3-dimetoksi-5-metil-p-benzokuinon,

2,6-difenil-p-benzekuinon, dan 2,6-dimetoksi-p-benzokuinon (Nishina et al.

1991). Ekstrak metanol dari tanaman Mitracarpus scaber yang mempunyai

komponen asam galat dan asam 3,4,5-trimetoksi asam benzoat, dapat

menghambat pertumbuhan S. aureus (MIC 3.90 dan 0.97 g/ml), sedangkan

senyawa 4-metoksiasetofenon dan 3,4,5-trimetoksiasetofenon sangat efektif

menghambat Candida albicans (MIC 1.95 g/ml), serta komponen kaemferol-3-

o-rutinosida, rutin dan psoralen mempunyai aktivitas rendah terhadap bakteri dan

kapang, hal ini ditunjukkan dengan nilai MIC 125-500 g/ml (Bisignano et al.

2000). Selain itu ekstrak nonpolar rosemary yang termasuk dalam komponen

fenolik mampu menghambat bakteri Gram positif seperti B. cereus, S. aureus dan

Streptococcus pyogenes (Campo et al. 2000).

Senyawa-senyawa tanin yang telah terbukti memiliki aktivitas antibakteri

terutama yang berasal dari ekstrak teh hijau yang mempunyai kemampuan untuk

menghambat pertumbuhan bakteri Streptococcus mutans. Senyawa aktif dari tanin

tersebut adalah galokatekin, epigalokatekin, dan epigalokatekin galat. Diantara

ketiga senyawa aktif tersebut galokatekin mempunyai aktivitas antibakteri paling

tinggi dengan nilai MIC 250 g/ml. Penghambatan oleh ketiga senyawa aktif

tersebut diduga karena adanya gugus hidroksil (Sakanaka et al. 1989). Tanin

bersifat dapat menggumpalkan protein, dan membentuk kompleks dengan

beberapa polisakarida, asam nukleat dan alkaloid, dan juga dapat mempengaruhi

warna, serta berkontribusi terhadap rasa dan aroma (Shahidi dan Naczk 1995).

57

Steroid merupakan subklas dari triterpenoid dengan komponen C30

(Banthorpe 1996). Ekstrak metilen diklorida tanaman R. apicula mengandung tiga

komponen steroid, yaitu kampesterol (4.61%), stigmaterol (18.47%) dan sitosterol

(76.92%). Keller et al. (1998) melaporkan bahwa kandungan steroid yang

mempunyai aktivitas antibakteri merupakan senyawa metabolit sekunder yang

dihasilkan oleh fungi Fomitopsis pinicola.

Daun kedaung mengandung saponin dan antosianin yang keduanya

berhubungan dengan antibakteri dan antiparasit (Zuhud et al. 2001). Senyawa

saponin dan flavonoid dilaporkan memiliki daya antibakteri terhadap beberapa

spesies bakteri, sedangkan senyawa terpen merupakan senyawa antibakteri utama

dalam rempah (Naidu dan Davidson 2000).

Senyawa antibakteri alkaloid tanaman, diantaranya dilaporkan oleh

Bhattacharyya et al. (1993) dari kulit kayu tanaman Clausena heptaphylla,

Chakraborty et al. (1995) dari daun tanaman Clausena heptaphylla, dan

Ramsewak et al. (1999) dari daun tanaman Murraya koenigii.

Pola Pertumbuhan B. cereus

Hasil pengamatan pola pertumbuhan bakteri B. cereus dapat dilihat pada

Gambar 4.2.

Gambar 4.2 Kurva Pola Pertumbuhan B. cereus

4

6

8

10

0 1 2 3 4 5 6 8 10 12 16 20 25

Lama Inkubasi (jam)

Jum

lah

Bak

teri

(log

cfu/

ml)

58

Fase adaptasi B. cereus berlangsung pada interval waktu 1-3 jam,

sedangkan fase eksponensial berlangsung sekitar 9 jam mulai dari jam ke 3

sampai dengan jam ke 12, dan stasioner berlangsung mulai dari jam ke 16 sampai

dengan jam ke 25.

Berdasarkan data tersebut ditetapkan bahwa untuk mewakili fase adaptasi

dipilih 1 jam, sedangkan fase eksponensial dan fase stasioner masing-masing

8 jam dan 16 jam. Jumlah sel B. cereus selama fase adaptasi belum meningkat,

yaitu pada jam ke-3 sebesar 104 cfu/ml. Fase eksponensial mulai jam ke-3 sampai

jam ke-12 meningkat pesat sampai 10 6 cfu/ml dan setelah jam ke-16 sampai jam

ke-25 jumlahnya tetap (fase stasioner), yaitu 108 cfu/ml. Jumlah sel B. cereus

setelah 1 jam inkubasi sebanyak 5.6x104 cfu/ml, setelah 8 jam inkubasi meningkat

sampai 7.4x106 cfu/ml dan mencapai jumlah tetap yaitu 3.4x108 cfu/ml setelah

16 jam inkubasi. Data selengkapnya disajikan pada Lampiran 1. Fase adaptasi

B. cereus berlangsung selama 3 jam dan merupakan persiapan untuk fase

berikutnya. Menurut Madigan et al. (2003) fase eksponensial pertumbuhan bakteri

sangat cepat, teratur, dan semua bahan dalam sel berada dalam keadaan seimbang.

Ultee et al. (2000) melaporkan bahwa kisaran fase pertumbuhan B. cereus adalah

fase adaptasi 1-3 jam, fase eksponensial 8-10 jam sedangkan fase stasioner

berkisar 16-20 jam.

Pengaruh Polaritas dan Konsentrasi Ekstrak Andaliman terhadap B. cereus

Hasil pengujian aktivitas antibakteri ekstrak heksana (nonpolar), etilasetat

(semipolar) dan metanol (polar) terhadap B. cereus dengan metode difusi sumur

dapat dilihat pada Lampiran 2, 3 dan 4. Secara umum ekstrak etilasetat

(semipolar) memiliki daya penghambatan lebih tinggi dibandingkan ekstrak

metanol (polar) terhadap B. cereus pada masing-masing fase pertumbuhan.

Ekstrak heksana (nonpolar) andaliman tidak menunjukkan efek penghambatan

terhadap sel B. cereus.

Ekstrak Nonpolar

Hasil pengujian aktivitas antibakteri ekstrak nonpolar andaliman terhadap

sel vegetatif B. cereus dapat dilihat pada Lampiran 2, 3, dan 4. Ekstrak nonpolar

59

andaliman tidak menunjukkan adanya aktivitas antibakteri pada fase adaptasi, fase

eksponensial maupun fase stasioner. Hal ini dapat dijelaskan bahwa media NA

yang digunakan bersifat polar, sedangkan ekstrak nonpolar lebih dominan

mengandung komponen minyak atsiri, dimana ekstrak dalam media NA tidak

mampu berdifusi secara baik sehingga tidak menunjukkan aktivitas

penghambatan.

Polaritas yang rendah pada ekstrak heksana disebabkan karena

mengandung minyak atsiri, bahan non minyak seperti lilin, sterol dan sedikit

senyawa fenolik. Menurut Nychas (1995) komponen bioaktif yang berperan

sebagai antibakteri dalam ekstrak heksana adalah minyak atsiri dan fenolik.

Ekstrak heksana mengandung minyak atsiri yang relatif tinggi (Ozean dan

Erkmen 2001) dan minyak atsiri ini mempunyai aktivitas antibakteri, namun

keberadaan minyak atsiri dalam ekstrak tersebut tidak menunjukkan

penghambatan pada B. cereus. Hasil analisis identifikasi komponen aktif ekstrak

heksana pada Tabel 4.2 menunjukkan adanya kandungan alkaloid, flavonoid,

triterpenoid dan steroid yang relatif rendah dibandingkan dengan ekstrak etilasetat

dan ekstrak metanol. Ekstrak heksana ini ternyata tidak mengandung tanin, fenol

hidrokuinon dan saponin. Kemungkinan komponen aktif yang terdapat pada

ekstrak heksana tersebut pada konsentrasi 10-50% masih belum dapat

menghambat pertumbuhan B. cereus, sedangkan pada ekstrak etilasetat dan

metanol pada konsentrasi tersebut sudah menunjukkan penghambatan.

Hasil penelitian Kanazawa et al. (1995) melaporkan bahwa ekstrak

heksana (senyawa minyak atsiri dan lipida lainnya) yang mempunyai ukuran

molekul besar tidak dapat masuk berpenetrasi dalam dinding sel. Ukuran molekul

besar tersebut akan menjadi penghalang masuknya komponen minyak atsiri

maupun senyawa fenolik ke dalam sel akibatnya sel tetap akan tumbuh.

Ekstrak Semipolar

Senyawa yang bertanggungjawab sebagai antibakteri dalam ekstrak

etilasetat adalah senyawa semipolar yang merupakan senyawa fenolik (Hiserodt,

1998), steroid, alkaloid, triterpenoid, flavonoid dan saponin (Tabel 4.2). Aktivitas

ekstrak etilasetat andaliman pada setiap fase pertumbuhan (fase adaptasi, fase

60

eksponensial dan fase stasioner) berpengaruh sangat nyata (p

61

Terutama dengan adanya ekstrak etilasetat yang banyak mengandung komponen

antibakteri seperti alkaloid, fenol hidrokuinon, steroid, flavonoid, triterpenoid dan

saponin akan dapat mengganggu proses pertumbuhan dan pembelahan sel,

menyebabkan terjadinya kerusakan sel.

Konsentrasi fenolik, alkaloid dan steroid dalam ekstrak etilasetat cukup

tinggi untuk berdifusi dan menghambat pertumbuhan bakteri. Kemampuan

senyawa semipolar untuk menghambat pertumbuhan bakteri berkaitan dengan

komponen dinding sel bakteri yang tidak bersifat absolut hidrofobik maupun

absolut hidrofilik. Kanazawa et al. (1995) menyatakan bahwa suatu senyawa

semipolar mempunyai aktivitas antibakteri yang maksimum, karena untuk

interaksi suatu senyawa antibakteri dengan bakteri diperlukan keseimbangan

hidrofilik-lipofilik (HLB: hydrophilic-lipophilic balance). Kemungkinan senyawa

semipolar mempunyai afinitas lebih tinggi untuk berinteraksi dengan dindin g sel,

sehingga ekstrak semipolar lebih efektif menghambat pertumbuhan B. cereus

daripada ekstrak metanol (polar) dan heksana (nonpolar).

Ekstrak Polar

Ekstrak polar andaliman memberikan pengaruh sangat nyata (p

62

sifat antibakteri yaitu yang termasuk dalam 3 grup fenolik yaitu asam fenolik,

flavonoid dan diterpenoid fenolik.

Gambar 4.4 Pengaruh Konsentrasi Ekstrak Metanol Andaliman pada Fase Pertumbuhan B. cereus

Komponen yang banyak terdapat pada tumbuh-tumbuhan dan bersifat

polar antara lain senyawa dari golongan fenolik. Mekanisme komponen

antibakteri fenolik pada umumnya akan berinteraksi dengan protein yang ada pada

dinding sel atau sitoplasma melalui ikatan hidrogen dan interaksi hidrofobik

(Naidu dan Davidson 2000). Mekanisme lain dari ekstrak polar andaliman dalam

menghambat pertumbuhan bakteri kemungkinan adalah dengan mengganggu

aktivitas enzim dalam sel. Penelitian yang dilakukan oleh Wendaken dan

Sakaguchi (1995) menunjukkan bahwa ekstrak air dan ekstrak etanol dari

cengkeh, kayu manis dan saga yang bersifat polar akan menghambat enzim

dekarboksilase khususnya histidin, lisin dan ornitin dekarboksilase dari bakteri

E. aerogenes.

Selanjutnya Hiserodt et al. (1998) melaporkan bahwa polaritas suatu

senyawa mempengaruhi aktivitas antibakteri, seperti 6-gingerol yang mempunyai

rantai alkil lebih polar daripada 10-gingerol yang memberikan penghambatan

yang lebih rendah terhadap Mycobacterium avium. Fenomena ini menunjukkan

bahwa senyawa polar cenderung mempunyai aktivitas antibakteri yang lebih

rendah. Pada pengujian tahap selanjutnya digunakan hanya ekstrak etilasetat dan

0

5

10

15

20

25

30

Fase adaptasi Fase eksponensial Fase stasioner

Dia

met

er P

engh

amba

tan

(mm

)

10% 20% 30% 40% 50%

`

63

ekstrak metanol, karena hasil pengamatan aktivitas ekstrak heksana terhadap

B. cereus dengan metode difusi sumur tidak menunjukkan adanya penghambatan.

Ekstrak metanol memiliki aktivitas lebih rendah daripada ekstrak

etilasetat. Moshi dan Mbwambo (2005) menyatakan bahwa ekstrak semipolar

(etilasetat) mampu menghambat bakteri E. coli dan B. anthracis dengan diamater

hambat lebih besar daripada ekstrak polar (etanol). Demikian juga penelitian

Springfield et al. (2003) ekstrak etilasetat tanaman Carpobrotus muirii dan C.

quadrifidus lebih berpotensi dalam menghambat S. aureus dan Mycobacterium

smegmatis daripada ekstrak air.

Potensi Aktivitas Ekstrak Andaliman Dibandingkan dengan Antibiotik

Hasil pengamatan diameter penghambatan ekstrak etilasetat, ekstrak

metanol dan beberapa jenis antibiotik pada beberapa konsentrasi terhadap bakteri

B. cereus dapat dilihat pada Tabel 4.3.

Tabel 4.3 Diameter Penghambatan Beberapa Antibiotik dan Ekstrak

Andaliman terhadap B. cereus

Antibiotik Konsentrasi Rataan (mm) Standar Deviasi Streptomisin 10 g/ml 19.75 0.92

100 g/ml 27.55 1.77 1000 g/ml 33.65 0.78

Penisilin G 10 g/ml 16.00 0.71 100 g/ml 17.45 0.49 1000 g/ml 19.85 0.49

Polimiksin B 10 g/ml 14.75 0.21 100 g/ml 15.60 0.57 1000 g/ml 16.65 1.48

Etilasetat 4000 g/ml 18.81 0.21 Metanol 4000 g/ml 15.98 0.14

Antibiotik streptomisin menunjukkan penghambatan tertinggi (33.65 0.78

mm), selanjutnya diikuti oleh penisilin G (19.85 0.49 mm) dan polimiksin B

(16.65 1.48 mm) masing-masing pada konsentrasi 1000 g/ml. Konsentrasi

yang digunakan untuk melarutkan ekstrak etilasetat dan metanol adalah 4000

g/ml (Ardiansyah 2001). Pada konsentrasi 4000 g/ml pengaruh ekstrak

etilasetat dan ekstrak metanol terhadap B. cereus masing-masing sebesar

18.81 0.21 mm dan 15.98 0.14 mm. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak

64

etilasetat memiliki potensi penghambatan yang setara dengan penisilin G, dan

ekstrak metanol pada konsentrasi 4000 g/ml memiliki potensi penghambatan

yang setara dengan polimiksin B pada konsentrasi 1000 g/ml. Potensi

penghambatan ekstrak etilasetat dan ekstrak metanol pada konsentrasi 4000 g/ml

sekitar 1/8 dari kekuatan penghambatan streptomisin, dan sekitar 1/4 dari

kekuatan penghambatan antibiotik penisilin G dan polimiksin B. Hal ini

menunjukkan bahwa kekuatan ekstrak etilasetat dan metanol juga efektif

menghambat bakteri Gram positif dan Gram negatif terutama S. aureus dan dapat

di duga mekanisme aktivitas antibakteri serupa dengan polimiksin B, yaitu

mengganggu keutuhan membran sel bakteri

Penisilin G merupakan antibiotik yang berspektrum luas dan biasanya

efektif terhadap kebanyakan bakteri Gram positif dan Gram negatif terutama

strain Staphylococcus aureus dan enterokokus yang biasanya menimbulkan

penyakit infeksi pencernaan, kardiovaskular, kulit, dan lain sebagainya.

Streptomisin dapat menghambat sintesis protein pada bakteri Gram positif dan

Gram negatif seperti enterokokus pada penyakit endokarditis, tuberkulosis

terutama pada sub unit ribosom 30S. Polimiksin bersifat bakterisidal terhadap

bakteri Gram negatif berbentuk basil biasanya digunakan untuk mengobati infeksi

pada permukaan kulit dan mata.

Penisilin G merupakan antibiotik yang menghambat sintesis dinding sel

bakteri. Dinding sel bakteri, terdiri dari polipeptidoglikan yaitu suatu kompleks

polimer mukopeptida (glikopeptida). Penisilin G menghambat reaksi yang paling

dini dalam proses sintesis dinding sel. Oleh karena tekanan osmotik dalam sel

bakteri lebih tinggi daripada di luar sel, maka kerusakan dinding sel bakteri akan

menyebabkan terjadinya lisis, yang merupakan dasar efek bakterisidal pada

bakteri yang peka.

Mekanisme penghambatan antibiotik penisilin G dengan cara

penggabungan gugus amino bebas asam penisilanat pada gugus-gugus karboksil

bebas dari berbagai jenis radikal. Berbagai radikal (R) yang terikat pada asam

amino penisilanat menentukan sifat-sifat farmakologik. Penisilin memiliki daya

kerja tertinggi terhadap bakteri Gram positif tetapi tidak aktif terhadap bakteri

Gram negatif (Jawetz et al. 1996).

65

Polimiksin B merupakan antibiotik yang mengganggu keutuhan membran

sel bakteri. Polimiksin B sebagai senyawa amonium kuaterner dapat merusak

membran sel setelah bereaksi dengan fosfat pada fosfolipid membran sel bakteri.

Polimiksin B dapat mengubah tegangan permukaan (surface active agents)

sehingga merusak permeabilitas selektif dari membran sel bakteri. Kerusakan

membran sel menyebabkan keluarnya berbagai komponen penting dari dalam sel

seperti protein, asam nukleat, nukleotida dan lain -lain (Setiabudy dan Gan 1999).

MIC dan MBC Ekstrak Andaliman

Hasil pengujian nilai MIC dan MBC ekstrak andaliman terhadap bakteri

B. cerus berbeda-beda. Ekstrak etilasetat dan metanol mengandung komponen

aktif yang dapat menghambat dan membunuh B. cereus. B. cereus lebih peka

terhadap ekstrak etilasetat dengan nilai MIC sebesar 0.20%, sedangkan ekstrak

metanol memiliki nilai MIC sebesar 0.80% (w/w). Nilai MBC ekstrak etilasetat

terhadap B. cereus adalah 1.20% dibandingkan ekstrak metanol sebesar 1.60%

(w/w) (Lampiran 29).

Tingkat kepolaran mempengaruhi penghambatan terhadap sel. Meurut

Davidson dan Branen (1993), semakin menurun polaritas (mendekati nonpolar)

akan semakin efektif menghambat bakteri Gram positif dibandingkan dengan

bakteri Gram negatif (). Hal ini sejalan pula dengan hasilhasil penelitian dari

Farag et al. (1989) dan Kim et al. (1995) yang membuktikan bahwa komponen

komponen minyak atsiri yang bersifat semipolar sampai nonpolar, lebih kuat daya

antibakterinya terhadap kelompok bakteri Gram positif dibandingkan kelompok

bakteri Gram negatif (Friedman et al. 2004a). Bakteri Gram positif mempunyai

kecenderungan lebih peka terhadap senyawa semipolar dibandingkan dengan

bakteri Gram negatif. Hal ini disebabkan karena perbedaan struktur dinding sel

bakteri. Pada bakteri Gram positif sebagian besar dinding selnya terdiri dari

lapisan peptidoglikan dan asam teikoat sehingga mudah dilewati komponen

ekstrak yang bersifat hidrofilik.

Ekstrak etilasetat memberi pengaruh peka B. cereus d ibandingkan dengan

ekstrak metanol. Setiap zat yang dapat menghambat salah satu langkah dalam

biosintesis peptidoglikan akan menyebabkan dinding sel bakteri yang tumbuh

66

menjadi lemah dan sel akan mengalami lisis (Jawetz et al. 1996). Komponen-

komponen ekstrak etilasetat dan metanol diduga berikatan dengan a-karboksil

residu alanin ujung dari satu rantai peptidoglikan yang menghambat sintesis

dinding sel sehingga sel akan mengalami kerusakan dan lisis.

Pengaruh pH terhadap Aktivitas Antibakteri Ekstrak Andaliman

Ekstrak etilasetat dan ekstrak metanol memiliki daya hambat yang

berpengaruh tidak nyata (p>0.01) pada tingkat keasaman atau pH ekstrak. Kisaran

diameter penghambatan ekstrak etilasetat terhadap B. cereus secara berurutan

adalah (18.23-17.15 mm) (Lampiran 32). Diameter penghambatan ekstrak

etilasetat andaliman pada pH 4 paling tinggi terhadap sel B. cereus (sebesar

18.23 mm), sedangkan rataan diameter penghambatan ekstrak metanol pada

pH 4 - pH 7 adalah sebesar 11.75-10.55 mm (Lampiran 33). Hasil ini

menunjukkan bahwa pada kisaran pH 4 sampai dengan pH 7 ekstrak metanol

memiliki daya penghambatan relatif sama, sedangkan penghambatan ekstrak

metanol lebih rendah dibandingkan ekstrak etilasetat.

Perbedaan kemampuan penghambatan ekstrak etilasetat dibandingkan

ekstrak metanol diduga bahwa kandungan komponen senyawa antibakteri lebih

banyak terdapat pada ekstrak etilasetat dibandingkan dengan ekstrak metanol.

Pada ekstrak etilasetat komponen hidrofobik dan hidrofilik masing-masing

terdapat dalam ekstrak dan memiliki aktivitas antibakteri yang tinggi. Akibatnya

daya hambat tertinggi diperoleh pada ekstrak etilasetat karena komponen yang

bersifat hidrofobik dan hidrofilik mampu masuk dalam membran sel dan

menghambat metabolisme sel.

Mekanisme penghambatan pada pH rendah disebabkan oleh kondisi asam

sel yang bereaksi untuk mempertahankan pH konstan dalam sel. Jika pH

diturunkan maka proton yang terdapat dalam jumlah tinggi dalam medium akan

masuk ke dalam sel. Proton (ion H+) dari asam masuk dalam sel melalui gradien

proton transmembran (Ray 2001), hal ini menyebabkan pH sitoplasma menurun.

Penurunan pH sitoplasma menyebabkan enzim-enzim bekerja untuk

mengembalikan pH intern al sel menjadi pH normal (Booth 1985). Proton ini harus

dikeluarkan untuk mencegah terjadinya pengasaman dan denaturasi komponen-

67

komponen sel. Aktivitas mengembalikan pH internal sel menjadi pH normal

memerlukan banyak energi. Bila energi yang dibutuhkan dalam jumlah tinggi,

maka metabolisme sel akan mengganggu sehingga lama kelamaan sel akan

mengalami kematian (Fardiaz 1992).

Aktivitas Antibakteri Ekstrak Andaliman terhadap Spora B. cereus

Pengujian aktivitas antibakteri spora bakteri B. cereus dilakukan untuk

mengetahui aktivitas antibakteri ekstrak andaliman dibandingkan dengan sel

vegetatif. Pengujian ini dilakukan pada kultur cair yang berumur 24, 48, 72 dan 96

jam, karena pada interval umur tersebut hampir semua sel vegetatif telah

membentuk spora. Pengujian aktivitas antibakteri ekstrak etilasetat dan ekstrak

metanol terhadap spora dan sel vegetatif B. cereus disajikan pada Gambar 4.5 dan

Gambar 4.6. Selanjutnya dapat dilihat perbedaan aktivitas antibakteri ekstrak

etilasetat dan ekstrak metanol terhadap spora bakteri, dan bila dibandingkan

dengan sel vegetatifnya. Pada Gambar 4.5 diameter penghambatan meningkat

dengan bertambahnya lama inkubasi hingga 96 jam sedangkan pada sel vegetatif

sebaliknya (Gambar 4.6). Diameter penghambatan terhadap sel vegetatif

umumnya lebih tinggi bila dibandingkan penghambatan terhadap spora B. cereus

(Lampiran 36 dan 37) dengan perbedaan sekitar 7.83 mm selama 24 jam.

12.43 13.7314.63

16.05

11.43 12.05 12.15 12.60

0

5

10

15

20

25

24 48 72 96

Lama Inkubasi (jam)

Dia

met

er P

engh

amba

tan

(mm

)

Etilasetat

Metanol

Gambar 4.5 Aktivitas Antibakteri Ekstrak Andaliman terhadap Spora B. cereus

Hal ini menunjukkan bahwa spora mempunyai ketahanan yang lebih tinggi

dibandingkan dengan sel vegetatifnya. Lama inkubasi B. cereus hingga 24-96 jam

68

akan menyebabkan terbentuknya spora yang semakin banyak untuk

mempertahankan diri, sehingga dengan adanya ekstrak andaliman pertumbuhan

spora akan terhambat.

19.25

16.03 15.80 16.3318.03

14.20 15.0516.98

0

5

10

15

20

25

24 48 72 96

Lama Inkubasi (jam)

Dia

met

er P

engh

amba

tan

(mm

)

Etilasetat

Metanol

Gambar 4.6 Aktivitas Antibakteri Ekstrak Andaliman terhadap Sel Vegetatif B. cereus

Pengaruh ekstrak etilasetat pada spora B. cereus yang diinkubasi 96 jam

dapat menghambat sebesar 16.05 mm, sedangkan diameter penghambatan ekstrak

metanol lebih rendah, yaitu sebesar 12.60 mm. Berbeda dengan diameter

penghambatan pada sel vegetatif B. cereus, lama inkubasi 24 jam pertama sudah

menunjukkan penghambatan tertinggi dibandingkan dengan lama inkubasi

96 jam. Diameter penghambatan ekstrak etilasetat andaliman pada sel vegetatif

dengan lama inkubasi 24 jam menunjukkan penghambatan lebih tinggi

(19.25 mm), sedangkan pada ekstrak metanol diameter penghambatannya lebih

rendah (18.03 mm).

Ultee et al. (1998) melaporkan bahwa spora bakteri lebih tahan terhadap

aktivitas senyawa antibakteri alami dibandingkan dengan sel vegetatif. Hal ini

ditunjukkan pada karvakrol yang mempunyai aktivitas sporosidal terhadap spora

B. cereus, baik pada konsentrasi 1.75 maupun 2.0 mmol/l. Spora lebih tahan

terhadap ekstrak metanol andaliman dibandingkan dengan sel vegetatif. Pada

konsentrasi 2 mmol/l diperlukan waktu inkubasi 37 menit untuk membentuk spora

sebanyak 2 log (cfu/ml), sedangkan untuk sel vegetatif diperlukan waktu inkubasi

selama 20 menit. Nuraida et al. (1999) melaporkan bahwa ekstrak biji picung

mampu menghambat spora B. cereus dengan areal penghambatan sebesar 1.0 mm,

sedangkan terhadap sel vegetatif ekstrak tersebut mampu menghasilkan areal

69

penghambatan yang lebih besar (4.2 mm). Perbedaan ketahanan ini diduga karena

perbedaan struktur fisik dan kimia antara spora dengan sel vegetatifnya (Cano dan

Calome 1986; Friedman et al. 2004b).

Pada spora terdapat lapisan terluar yang tipis dan lembut yang disebut

eksosporium. Di bawah lapisan eksosporium terdapat suatu lapisan lagi yang

disebut dengan bungkus spora (coat spore) yang terdiri dari satu lapisan atau

berlapis-lapis yang membentuk struktur yang mirip dengan dinding sel. Adanya

struktur yang berlapis-lapis pada spora akan mengakibatkan terhambatnya

penetrasi ekstrak etilasetat maupun ekstrak metanol andaliman, disamping

kandungan air yang lebih rendah (15%) bila dibandingkan dengan sel vegetatif

(75%) juga akan menyebabkan spora lebih tahan dibandingkan dengan sel

vegetatifnya (Cano dan Colome 1986). Selain itu kandungan asam dipikolinat dan

tingginya kandungan ion kalsium yang hanya dimiliki oleh spora ju ga merupakan

faktor yang dapat menyebabkan spora tahan terhadap perlakuan kimia (Fardiaz

1992).

SIMPULAN

Konsentrasi dan polaritas ekstrak andaliman mempengaruhi aktivitas

antibakteri. Ekstrak etilasetat (semipolar) menunjukkan aktivitas yang lebih tinggi

daripada ekstrak metanol (polar) terhadap B. cereus. Aktivitas antibakteri ekstrak

andaliman dipengaruhi oleh fase pertumbuhan B. cereus. Ekstrak etilasetat lebih

menghambat pada fase eksponensial (19.22 mm), sedangkan ekstrak metanol

lebih efektif pada fase adaptasi (14.15 mm). Nilai MIC ekstrak etilasetat terhadap

B. cereus adalah 0.2% dan nilai MBC 1.20%.

Ekstrak etilasetat dan metanol berpotensi sebagai antibiotik, yaitu pada

konsentrasi 4000 g/ml sekitar 1/8 dari streptomisin, dan sekitar 1/4 dari penisilin

G dan polimiksin B masing-masing pada konsentrasi 1000 g/ml. Dengan

demikian ekstrak andaliman dapat menghambat spora dan sel vegetatif B. cereus.

Ekstrak etilasetat dan metanol pada pH 4-7 menunjukkan tidak berpengaruh

nyata (p>0.01) terhadap B. cereus. Kemampuan ekstrak etilasetat dalam

menghambat spora B. cereus cukup baik, dimana diameter penghambatannya

70

setelah 96 jam lebih besar (16.05 mm) dibandingkan ekstrak metanol (12.60

mm). Demikian pula pada sel vegetatif, penghambatan ekstrak etilasetat

andaliman dengan lama inkubasi 24 jam menunjukkan penghambatan lebih tinggi

(19.25 mm) dibandingkan ekstrak metanol (18.03 mm).

DAFTAR PUSTAKA

Apriyantono A, Fardiaz D, Puspitasari NL, Yasni S, dan Budiyanto S. 1989.

Petunjuk Laboratorium Analisis Pangan. PAU Pangan dan Gizi IPB. Bogor.

Ardiansyah. 2001. Teknik ekstraksi komponen antimikroba buah andaliman

(Zanthoxylum acanthopodium DC) dan antarasa (Litsea cubeba). [skripsi]. Bogor: Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor.

Banthorpe DV. 1996. Terpenoids. Di dalam: Mann J, Davidson RS, Hobbs JB,

Banthorpe DV, Harbone JB, editor. Natural Product Their Chemistry and Biological Significance. Harlow: Longman. Hlm 289-359.

Bhattaacharyya P, Biswas GK, Barua AK, Saha C, Poy IB, dan Chowdhury BK.

1993. Clausenalene, a carbazole alkaloid from Clausena heptaphylla. Phytochemistry. 33(1):248-250.

Bisignano G, Sanogo R, Marino A, Aquino R, DAngelo V, Germano MP, De

Pasquale R dan Pizza C. 2000. Antimicrobial activityof Mitracarpus scaber extract and isolated constituents. Letter Appl Microb 30: 105-108.

Brooke P, Harris DJ dan Longmore RB. 1996. Isolation of minor lupin alkaloids.

A simple procedure for the isolation of angustifoline from lupinus angustifollius (Cv. Fest) seeds, with application to other lupin alkaloids. J Agric Food Chem 44(8):2129-2133.

Chakraborty A, Saha C, Podder G, Chowdhury BK, dan Bhattacharyya. 1995.

Carbazole alkaloid with antimicrobial activity from Clausena heptaphylla. Phytochemistry 38(3): 787-789.

Campo JD, Amiot MJ dan Christophe NT. 2000. Antimicrobial effect of rosemary

extracts. J Food Prot 10: 1359-1368 Cano RJ dan Colome JS. 1986. Microbiology. West Publishing Company. New

York. Carson CF dan Riley TV. 1995. Antimicrobial activity of the major components

of the essential oil of Melaleuca alternifolia . J Appl Bacteriol 78: 264-269.

71

Davidson PM dan Brannen AL. 1993. Antimicrobials in Food. Marcel Dekker. New York.

Farag RS, Daw ZY, Hewedl FM dan El-Baroty GSA. 1989. Antimicrobial activity

of some Egyption spice essential oils. J Food Prot 52(9):665-667. Fardiaz S. 1992. Mikrobiologi Pengolahan Pangan Lanjut. Bogor: PAU Pangan

dan Gizi Institut Pertanian Bogor. Friedman M, Henika PR, Levin CE dan Mandreil RE. 2004a. Antibacterial

activities of plant essential oils and their components against Escherichia coli O157:H7 and Salmonella enteritica in apple juice. J Agric Food Chem 52: 6042-6048.

Friedman M, Buick R dan Elliott CT. 2004b. Antibacterial activities of naturally

occuring coumpounds against antibiotic -resistant Bacillus cereus vegetative cells and spora, Escherichia coli, and Staphylococcus aureus. J Food Prot 67:1774-1778

Garriga M, Hugas M, Aymerich T dan Monfort JM. 1993. Bacteriocinogenic

activity of Lactobacilli from fermentor sausages. J Appl Bacterio 75: 142-148.

Harbone JB. 1996. Metode Fitokimia. Penuntun cara modern menganalisis

tumbuhan. Padmawinata K, Sudiro I, Penerjemah. Bandung: Penerbit ITB. Harrigan WF. 1998. Laboratory Methods in Food Microbiology. 3 rd edition. San

Diego. Hiserodt RD, Franzblau SG dan Rosen RT. 1998. Isolation of 6-,8- and 10-

Gingerol from ginger rhizome by HPLC and preliminary evaluation of inhibition of Mycobacterium avium and ycobacterium tuberculosis. J Agric Food Chem 3: 477-480.

Holstege DM, Seiber JN, dan Galey FD. 1995. Rapid multiresidue screen for

alkaloids in plant material and biological samples. J Agric Food Chem 43(3): 691-699.

Hostetmann K, Wolfender JL dan Rodrigue ZS. 1997. Rapid detection and

subsequent isolation of bioactive constituents of crude plant extracts. Planta Med 63:2-10

Houghton PJ dan Raman A. 1998. Laboratory Handbook for the Fractination of

Natural Extracts. Thomson Science, London. Jawetz E, Melnick J dan Adelberg E. 1996. Medical Microbiology. Appleton &

Lange. San Fransisco.

72

Kanazawa A, Ikeda T dan Endo T.1995. A novel approach to mode of action of cationic biocides morphological effect on antibacterial activity. J Appl Bacteriol 78: 55-60.

Kim JM, Marshal MR, Cornell JA, Boston JF dan Wei CI. 1995. Antibacterial

activity of carcacrol, citral and geraniols againts Salmonella typhimurium in culture medium and fish cubes. J Food Sci 60 (6): 1365-1368.

Kubo A, Lunde CS, Kubo I. 1995. Antimicrobial activity of the olive oil flavor

compounds. J Agric Food Chem. 40(6):999-1003. Lewis K, Salyers AA, Taber HW, Wax RG. 2004. Bacterial Resistance to

Antimicrobials. Marcel Dekker, Inc. Lin CM, Preston JF III dan Wei CI. 2000. Antibacterial mechanism of allyl

isothiocyanate. J Food Prot Vol 63 (6): 727-734. Madigan MT, Martinko JM, Parker J. 2003. Brock Biology of Microorganisms.

Tenth Edition. Southern Illinois University Carbondale. Murhadi. 2002. Isolasi dan karakterisasi komponen-komponen antibakteri dari biji

Atung (Parinarium glaberimum Hassk). [disertasi]. Bogor. Program Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.

Naidu AS dan Davidson PM. 2000. Phyto-phenols. Di dalam Naidu AS, editor.

Natural Food Antimicrobial Systems. New York: CRC Press. Nishina AK, KinaichiH, Uchibori T, Seino H dan Osawa T. 1991. 2,6-dimethoxy-

p-benzequinone as an antimicrobial substance in the bark of Phyllostachys heterocyclavar. Pubscens a species of thick-stemmed bamboo. J Agric Food Chem 39:266-269.

Nuraida L, Andarwulan N dan Kristikasari E. 1999. Aktivitas antimikroba biji

picung (Pangium edule Reinw.) segar dan terfermentasi terhadap bakteri patogen dan perusak makanan. J Ilmu dan Tek Pangan 4 (2): 18-26.

Nychas GJE.1995. Natural antimicrobials from plants. Di Dalam: Gould GW.

(Eds). New Methods of Food Preservation. Blackie Academic and Profesional. London.

Nychas GJE dan Tassou CC. 2000. Traditional preservatives-oils and spices. Di

dalam: Robinson RK, Batt CA, Patel PD, editor. Encyclopedia of Food Microbiology. Volume 1. :ondon: Academic Press.

Oyen LPA dan Nguyen XD. 1999. Plant resources of South-East Asia No. 19.

Essential oil plants. Bogor: Prosea Bogor Indonesia.

73

Ozean M, dan Erkmen O. 2001. Antimicrobial activityof the essential oils of Turkish plant spices. Eur Food Res Technol 212: 658-660.

Purseglove JW.1981. Spices. Volume II. New York: Longman Inc.

Puupponen-Pimia R, Nohyyenk L. Meier C, Kahkonen M, Heihonen M. 2001. Antimicrobials properties of phenolic compound from berries. J Appl Microbiol 90:494-507.

Ramsewak RS, Nair MG, Strasburg GM, Dewit DL dan Nitiss JL. 1999.

Biologically active carbazole alkaloids from Murraya koeniglii. J. Agric Food Chem 47 (2) 444-447.

Sakanaka S, Kim M, Tan iguchi M, Yamamoto T. 1989. Antibacterial substances

in Japanese green tea extract against Streptococcus mutan , a cariogenic bacterium. Agric Biol Chem 53(9):2307-2311.

Setiabudy R. dan Gan VHS. 1995. Antimikroba. Di Dalam: Ganiswarna SG,

Setiabudy R, Suyatna FD, Purwantyastuti dan Nafrialdi. Farmakologi dan Terapi. Edisi 4. Gaya Baru. Jakarta.

Shahidi F dan Naczk M. 1995. Foods Phenolics. Technomic Co., Inc. Lancaster. Ultee A, Gorris LGM dan Smid EJ. 1998. Bacterial activity of carvacrol towards

the food-borne pathogen Bacillus cereus. J App Microbiol 85: 213-218. Ultee A, Slump RA, Steging G dan Smid EJ. 2000. Antimicrobial activity of

carvacrol toward Bacillus cereus on rice. J Food Prot Vol 63. No.5:620-624.

Ultee A, Slump RA, Steging G dan Smid EJ. 2000. Antimicrobial activity of

carvacrol toward Bacillus cereus on rice. J Food Prot Vol 63. No.5:620-624.Wendaken CN dan Sakaguchi M. 1995. Inhibition of amino acid decarboxylase activity of Enterobacter aerogenes by active components in spices. J Food Prot 58(3): 280.

Yasni S. 2001. Aktivitas antimikroba minyak atsiri buah andaliman

(Zanthoxyllum acanthopodium DC) dan antarasa (Litsea cubeba) terhadap bakteri dan kapang serta profil deskriptif komponen aktif penyusunnya.Di dalam: Nuraida L, Dewanti-Hariyadi R, editor. Pangan Tradisional: Basis Bagi Industri Pangan Fungsional dan Suplemen. Pusat Kajian Makanan Tradisional IPB. Bogor. Hal 130-138.

Zuhud EAM, Rahayu WP, Wijaya CH dan Sari PP. 2001. Aktivitas antimikroba ekstrak kedawung (Parkia roxburghii G. Don) terhadap bakteri patogen. Jurnal Teknologi & Industri Pangan XII (1): 6-12.