IDENTIFIKASI SPESIES MIKROORGANISME SAMPEL

I. Tujuan Percobaan :

Mampu menggunakan teknik pewarnaan, pengkulturan, dan uji biokimia yang

telah didapat untuk menentukan genus kultur bakteri yang belum diketahui.

II. Dasar Teori :

Spesies berasal dari bahasa Latin species

yang merupakan tingkatan dalam taksonomi

yang terkecil, biasanya digunakan untuk

mengklasifikasi organisme baik yang hidup

maupun organisme yang fosil.

Dalam biologi, species adalah salah satu

bentuk pengelompokan dalam klasifikasi

makhluk hidup.. Dalam sistem tatanama

binomial, nama suatu spesies makhluk

hidup terdiri atas dua kata: nama genusnya

(diawali dengan huruf kapital) dan nama penunjuk spesiesnya. Misalnya, dari

gambar di samping,Panthera pardus, Nama Panthera merupakan nama genus

atau marga sedangkan pardus merupakan nama species.

Berikut penjelasan singkat mengenai 3 spesies sampel yang kelompok kami

temukan. Ketiga spesies sampel kami antara lain adalah E. coli, Staphylococcus

epidermis dan Proteus mirabilis.

1. E.coli

Escherichia coli, atau biasa disingkat E.

coli, adalah salah satu jenis spesies utama

bakteri gram negatif. Pada umumnya,

bakteri yang ditemukan oleh Theodor

Escherich ini hidup pada tinja, dan dapat

menyebabkan masalah kesehatan pada

manusia, seperti diare, muntaber dan masalah pencernaan lainnya. E. coli

banyak digunakan dalam teknologi rekayasa genetika. Biasa digunakan sebagai

vektor untuk menyisipkan gen-gen tertentu yang diinginkan untuk

dikembangkan. E. coli dipilih karena pertumbuhannya sangat cepat dan mudah

dalam penanganannya.

2. Staphylococcus epidermis

Staphylococcus epidermis merupakan bakteri non-motil, jenis coccus gram-

positive cocci, dan berbeda dengan Staphylococcus aureus, bakteri ini tidak

memiliki enzim koagulase. Bakteri ini merupakan bakteri yang patogen dan

aktif dalam aliran darah melalui luka, jarum dll. Infeksi dari bakter in berakibat

pembengkakan pada daerah yang terinfeksi. 

3.Proteus mirabilis

Proteus mirabilis merpakan bakteri gram negative dan bakteri fakultatif

anaerob. Bakteri ini memiliki kemampuan motalitas dan aktivitas urease.

P.mirabilis menyebabkan 90% infeksi yang disebabkan oleh jenis ‘Proteus’.

P.mirabilis dapat menggunakan urea dan citrate untuk produksi energi.

Bakteri ini dapat memproduksi gas hydrogen sulfide dan membentuk zona

bening pada media. P.mirabilis ini motil, memiliki peritrichous flagella yang

diketahui sebagai penyebab pergerakan. Bakteri ini pada umumnya ditemukan

pada intestinal manusia. P.mirabilis tidak pathogen pada guinea pigs atau ayam.

Uji – uji biokimia pada P.mirabilis adalah sebagai berikut :

*Indole negative dan reduksi nitrat positif (tidak ada gas yang diproduksi)

*Metyl red positif dan Voges-Proskauer negatif

*Catalase positif and Cytochrome Oxidase negatif

Untuk mengidentifikasi spesies suatu bakteri, praktikan perlu melakukan

serangkaian uji yang berurutan sesuai dengan hasil percobaan yang telah ada.

Berikut adalah penjelasan berbagai uji yang harus dilakukan dalam

mengidentifikasi spesies sampel :

1.Pewarnaan Gram

Pewarnaan gram adalah suatu metode yang digunakan untuk membedakan

mikroorganisme berdasarkan susunan & struktur dinding sel mikroorganisme.

Metode pewarnaan gram membutuhkan 4 jenis reagen yaitu : crystal gentian

violet (Gram I), iodine (Gram II), alkohol 95% (GramIII), dan saphranin

(Gram IV). Dengan menggunakan metode pewarnaan gram, bakteri dapat

digolongkan menjadi 2 kelompok, yaitu : bakteri gram (+) yang akan

berwarna biru-ungu dan bakteri gram (-) yang berwarna merah.

Beberapa fungsi reagen dalam pewarnaan gram yang menentukan spesies

sampel termasuk dalam gram (+) atau gram (-) adalah sebagai berikut:

Pemberian kristal fiolet berfungsi untuk mewarnai semua sel. (baik gram

negatif maupun positif)

Iodin berfungsi sebagai mordan. Di dalam sitoplasma iodin membentuk

komplek dengan kristal fiolet. Pembentukan kompleks mengakibatkan sel

berwarna biru tua.

Pemberian alkohol memiliki 2 fungsi:

– Pada gram positif alkohol mengakibatkan peptidoglikan terdehidrasi

sehingga ukuran porinya mengecil. Ini mengakibatkan kristal violet

tidak dapat keluar dari sitoplasma.

– Pada gram negatif alkohol mencuci dinding sel dan meninggalkan

lubang kecil pada peptidoglikan. Ini mengakibakan kristal violet tercuci

keluar dan sel menjadi tidak berwarna.

Staphylcuococs (+) E. coli (-)

Safranin berfungsi sebagai couter staining. Safranin akan memberi warna

pada gram negatif sehingga gram positif dan negatif akan terlihat berbeda

secara jelas di bawah mikroskop.

Dari hasil pewarnaan gram, selain dapat membedakan mikroorganisme

berdasarkan susunan & struktur dinding sel mikroorganisme, praktikan juga

dapat mengidentifikasi morfologi dari bakteri tersebut. Berikut gambar

tentang berbagai bentuk morfologi dari bakteri sebagai berikut :

2.Uji Biokimia

Biokimia adalah uji yang dilakukan untuk mengetahui metabolisme dan

reaksi yang dijalankan oleh suatu mikroorganisme. Jenis – jenis uji biokimia

untuk mengidentifikasi spesies antara lain :

a.Reaksi Litmus Milk

Media yang digunakan : litmus broth

Komposisi Media : - Litmus (0,5 gr)

- Skim milk powder (100 gr)

- Sodium sulfite (0,5 gr)

Lama inkubasi : 24 – 48 jam pada 370C

Penyusun susu terbesar yang digunakan sebagai dasar uji biokimia dalam

media litmus milk adalah laktosa, protein susu yaitu kasein, lacto-albumin

dan lactoglobulin.Untuk melihat adanya perubahan metabolisme yang

diproduksi dalam medium, digunakan pH indicator yaitu oxidase-reduction

indicator litmus. Indicator ini akan menyatu dalam medium. Saat ini,litmus

milk merupakan medium yang baik untuk mikroorganisme yang dapat

mencerna substrat milk, tergantung dari komplemen enzimatik bakteri

tersebut. Beberapa perubahan biokimia dalam litmus milk :

Fermentasi Laktosa

Organisme mampu menggunakan laktosa sebagai sumber karbon untuk

produksi energi, dengan menggunakan induksi enzim -galactosidase.

Degradasi laktosa dirumuskan sebagai berikut:

Adanya asam laktat dapat dengan mudah dideteksi karena litmus

bewarna ungu pada pH netral dan berubah menjadi merah muda ketika

medium menjadi asam yaitu pada pH sekitar 4.

Adanya gas

Produk akhir pada fermentasi laktosa adalah CO2 + H2 . Adanya gas

ini mungkin dapat dilihat sebagai pemisahan ‘curd’ atau pembelahan

dalam curd sebagai akibat adanya gas yang naik ke permukaan.

Reduksi Litmus

Fermentasi adalah proses anaerobic yang meliputi biooksidasi yang

terjadi karena tidak ada molekul oksigen. Oksidasi ini mungkin akan

terlihat sebagai perpindahan hydrogen (dehydrogenation) dari

substrat.Karena ion hidrogen tidak dapat dalam bentuk bebas/melayang-

layang,hydrogen memerlukan akseptor elektron yang dapat mengikat ion

hydrogen jika hal tersebut tidak terjadi maka reaksi reduksi-oksidasi

tidak akan berjalan dan produksi energy tidak dapat dihasilkan. Pada tes

litmus milk, litmus berperan sebagai akseptor. Saat berada dalam

kondisi oksidasi, litmus berwarna ungu; ketika litmus menerima

hydrogen dari substrat, litmus akan tereduksi dan berubah menjadi putih

atau warna putih susu. Oksidasi laktosa ini memproduksi asam laktat,

asam butirat, gas CO2 dan gas H2.

Gas hydrogen dikenal sebagai hydrogen litmus acceptor, yang

menyebabkan perubahan menjadi putih dan menandakan bahwa laktosa

tereduksi.

Terbentuknya Curd

Aktivitas biokimia dari mikroorganisme yang berbeda ditumbuhkan

pada litmus milk menghasilkan produksi 2 tipe curd (clots) yang

berbeda. Curd yang terbentuk bergantung pada mekanisme biokimia

yang membentuk curd tersebut Ada 2 jenis curd yang mungkin

terbentuk yaitu :

-Acid curd

Asam laktat atau asam organic lain menyebabkan pengendapan milk

protein casein sebagai calcium caseinate menjadi bentuk gumpalan

yang tidak larut.

-Rennet curd

Beberapa organisme menghasilkan rennin, enzim yang berperan

mengubah casein menjadi bentuk paracasein, selain itu adanya calcium

ion diubah menjadi calcium paracaseinate dan membentuk gumpalan

yang tidak larut. Tidak seperti acid curd, curd jenis ini berupa gumpalan

semisolid yang lembut. Gumpalan ini akan mengalir perlahan saat

tabung dimiringkan.

Proteolysis (Peptonization)

Ketidakmampuan beberapa mikroorganisme untuk menghasilkan energi

melalui jalur fermentasi laktosa menandakan bahwa mikroorganisme

tersebut harus menggunakan sumber nutrisi lainnya sebagai protein

untuk menghasilkan energi. Dengan menggunakan enzim proteolitik,

Lactose Glucose Pyruvic acid-Lactic acid-Butyric acid-CO2 + h2

organisme menghidrolisis milk protein, terutama casein, menjadi bentuk

dasarnya yaitu asam amino. Proses pencernaan protein disertai dengan

perubahan sejumlah besar ammonia yang dihasilkan dalam medium

dengan alkaline pH. Litmus berubah warna menjadi lapisan ungu yang

berada di atas/ permukaan dari tabung. reaksi sedangkan bagian

bawahnya kehilangan strukturnya dan membentuk cairan kecoklatan

Reaksi Alkaline

Reaksi alkaline dibuktikan ketika warna pada medium tidak berubah

atau berubah menjadi biru. Reaksi ini mengindikasikan partial

degradation dari casein menjadi rantai polipeptida yang lebih pendek,

dengan disertai pelepasan produk akhir alkaline yang menyebabkan

perubahan warna.

Beberapa kemungkinan hasil yang diperoleh dari uji Litmus Milk :

Keterangan gambar :A.  Acid/Reduction/Curd

B.  Reduction/Curd (arrow denotes gas pocket)

C.  Uninoculated Control

D.  Acid Formation

E.  Proteolysis of casein

F.  Alkaline Reaction

b.Fermentasi Karbohidrat

Media yang digunakan : phenol red lactose, fructose, glucose,

mannitol broth

Komposisi Media : - Casein peptone (10 gr)

-Lactose/fructose/glucose/mannitol (5 gr)

- Sodium chloride (5 gr)

- Phenol red (0,018 gr)

Lama inkubasi : 24 - 48 jam pada 370C

Kebanyakan organisme memperoleh energi melalui suatu urutan reaksi

enzimatis tertentu dan terintegrasi,yang mengarah pada biooksidasi substrat,

seringkali karbohidrat. Organisme menggunakan karbohidrat secara

berbeda, tergantung pada komplemen enzimnya. Beberapa organisme

mampu memfermentasikan gula seperti glukosa secara anaerob, sedangkan

yang lain dengan aerob. Anaerob fakultatif mampu melakukan keduanya

sedangkan beberapa organisme justru tidak mampu mengoksidasi glukosa

secara anareob maupun aerob.

Pada fermentasi, substrat-substrat seperti karbohidrat dan alkohol

mengalami disimilasi secara anaerob dan menghasilkan asam organik

(sebagi contoh : laktat, format, atau asam asetat) yang disertai adanya gas

seperti hydrogen atau karbondioksida. Fermentasi digambarkan dengan baik

lewat degradasi glukosa melalui jalur Embden-Meyerhof, yang dikenal

dengan jalur glikolisis. Satu mol glukosa dikonversi menjadi dua mol asam

piruvat, yang mana merupakan senyawa intermediet utama yang dihasilkan

dari degradasi glukosa. Hasil metabolisme asam piruvat lebih lanjut tidak

sama untuk semua organisme, dan variasi produk akhir menunjukkan

kemampuan fermentasi mereka yang berbeda. Degradasi fermentasi secara

anaerob mengambil tube broth fermentasi yang mengandung tabung

Durham, yang berguna untuk mendeteksi gas yang dihasilkan. Medium

fermentasi karbohidrat mengandung :

-Nutrient broth untuk pertumbuhan semua organisme

-Karbohidrat spesifik yang berfungsi sebagai substrat untuk determinasi

kemampuan fermentasi organisme-organisme.

-pH indicator phenol red, yang merah pada pH netral (7) dan menjadi

kuning bila sedikit asam (pH 6,8).

Inkubasi dilakukan dalam waktu 48 jam. Inkubasi yang berlebih dapat

menutupi reaksi produksi asam oleh produksi alkali yang disebabkan

kegiatan enzimatik pada substrat, selain karbohidrat.

Setelah inkubasi, karbohidrat yang telah difermentasi dengan hasil

sampingan asam akan menyebabkan phenol red menjadi kuning, yang

mengindikasikan reaksi positif. Pada beberapa kasus, produksi asam disertai

produksi gas (CO2) yang terlihat sebagai gelembung pada tabung Durham.

Kultur yang tidak mampu memfermentasi substrat karbohidrat tidak akan

merubah warna indicator, dan tabung tetap warna merah, serta tidak ada gas

pada tabung Durham. Ini merupakan reaksi negatif.

Kekurangan fermentasi karbohidrat oleh beberapa organisme tidak dapat

diartikan sebagai ketiadaan pertumbuhan. Organisme menggunakan nutrien

lain dalam medium sebagai sumber energi. Di antara nutrien tersebut adalah

pepton yang ada pada nutrient broth. Pepton dapat didegradasi oleh enzim

mikrobial menjadi asam amino yang secara enzimatis dikonversi menjadi

asam ketoamino lewat deaminasi oksidatif. Asam ketoamino tersebut lalu

dimetabolisme lewat siklus Krebs untuk menghasilkan energi. Reaksi

tersebut membebaskan ammonia hidroksida (NH4OH) dan menghasilkan

lingkungan alkalin, yang menimbulkan warna merah tua.

c.Produksi H2S

Media yang digunakan : SIM agar deep tubes

Komposisi Media : - Bacteriological agar (3,5 gr)

- Ferric ammonium sulfate (0,2 gr)

- Casein peptone (20 gr)

- Meat peptone (6,1 gr)

- Sodium thiosulfate (0,2 gr)

Lama inkubasi : 24 – 48 jam pada 370C

Terdapat dua jalur fermentasi utama yang mana beberapa

mikroorganisme mampu memproduksi hydrogen sulfide (H2S) :

Jalur I : gas H2S dapat diproduksi oleh reduksi (hidrogenasi) sulfur

organic yang ada di asam amino sistein, yang mana merupakan

komponen peptone yang terdapat pada medium. Pepton tersebut

didegradasi oleh enzim microbial menjadi asam amino, meliputi sistein.

Asam amino ini dengan keberadaan sistein desulfurase, kehilangan atom

sulfur dan direduksi dengan penambahan hydrogen dari air untuk

membentuk H2S.

Jalur II : gas H2S dapat dihasilkan dari reduksi senyawa sulfur anorganik

seperti thiosulfat (S2O32-), sulfat (SO4

2-), atau sulfit (SO32-). Medium yang

mengandung sodium thiosulfat, dengan mikroorganisme tertentu dapat

direduksi menjadi sulfite dengan pembebasan H2S. Atom sulfur

bertindak sebagai akseptor hydrogen selama oksidasi senyawa anorganik

seperti ditunjukkan sebagai berikut :

Pada percobaan digunakan SIM medium yang mengandung peptone dan

sodium thiosulfat sebagai substrat sulfur, ferro sulfat (FeSO4) sebagai

indicator H2S, dan Agar untuk membuat medium menjadi semisolid dan

mendorong respirasi anaerob. Ferrous ammonium sulfat gas, membentuk

endapan tak larut ferrous sulfide berwarna hitam yang dapat dilihat di

sepanjang tusukan inokulasi, yang mengindikasikan terbentuknya H2S.

Ketiadaaan endapan menunjukkan reaksi negative. SIM agar juga dapat

digunakan untuk mendeteksi motilitas organisme. Motilitas disadari saat

pertumbuhan kultur dari organisme berflagellata tidak sesuai dengan garis

inokulasi. Pertumbuhan organisme nonmotil sesuai dengan garis inokulasi

ditunjukkan sebagai berikut :

d.Reduksi Nitrat

Media yang digunakan :Nutrient Agar

Kompisisi Media : - Peptone from casein (10 gr)

- Meat extract (3 gr)

- Agar (12 gr)

Reagen yang diperlukan :Solution A (asam sulfanilat),Solution B (α-

naphthylamine) dan bubuk Zn.

Lama inkubasi :24 – 48 jam pada 370C

Reduksi nitrat oleh beberapa mikroorganisme aerobik dan fakultatif

anaerobik terjadi dengan adanya molekul oksigen yaitu proses anaerobik.

Pada respirasi organisme anaerobic merupakan proses oksidatif karena itu

sel menggunakan substrat inorganic seperti nitrat (NO3- ) atau sulfat (SO4

2-)

untuk suplai oksigen yang kemudian menjadi akseptor hydrogen akhir selam

pembentukan energi. Perubahan nitrat menjadi nitrit dapat dilihat dari reaksi

di bawah ini:

Beberapa organisme mempunyai kapasitas enzimatik untuk mengurangi

jumlah nitrit menjadi ammonia (NH3+) atau molekul nitrogen (N2).

Reduksi nitrat dapat diterangkan dengan mengkultivasi organisme dalam

medium nitrat broth. Pada dasarnya,medium mengandung nutrient broth

bersupplemen 0,1% kalium nitrat (KNO3) sebagai substrat nitrat. Dapat

ditambahkan agar medium menjadi semisolid yaitu dengan penambahan

0,1% agar. Kondisi agar yang semisolid akan menyebabkan difusi oksigen

ke dalam medium menjadi sedikit sehingga bakteri anaerob akan melakukan

reduksi nitrat

Setelah kultur diinkubasi, kemampuan organisme untuk mengurangi nitrat

atau nitrit dapat dibuktikan dengan penambahan 2 reagen: Larutan A yaitu

asam sulfanilat, diikuti dengan pemberian Larutan B yaitu α-naphthylamine.

Adanya proses reduksi dengan penambahan Larutan A dan B akan

menghasilkan warna cherry red.

NO3- + 2H+ + 2e- NO2

- + H2O

Nitrat

Reduktase

Nitrat Hydrogen electron

Nitrit Air

NO2- NH3

+

Nitrit Ammonia

2NO3- + 12H+ + 10e- N2 + 6H2O

Nitrat Gas Nitrogen

NO3- NO2

-

Nitrat

Reduktase

Kultur yang tidak memproduksi perubahan warna seperti yang tertera di

atas memiliki 2 kemungkinan :

*Nitrat tidak direduksi oleh organisme, atau

*Organisme mempunyai semacam potensi enzim nitrate reductase yaitu

nitrat secara cepat direduksi melalui nitrit menjadi ammonia atau bahkan

menjadi molekul nitrogen.

Untuk membuktikan ada tidaknya nitrat yang direduksi melalui

terbetuknya nitrite,bubuk besi ditambahkan sedikit ke kultur yang telah

diberi Larutan A dan B. Besi mereduksi nitrat menjadi nitrit. Bila ada

perubahan menjadi warna merah maka membuktikan nitrat tidak direduksi

menjadi nitrit oleh organisme. Jika nitrat tidak direduksi, reaksi reduksi

nitrat dikatakan negatif. Bila setelah penambahan besi tidak ada perubahan

warna, mak nitrat pada medium direduksi melalui nitrit menjadi ammonia

dan gas nitrogen. Ini adalah reaksi yang positif.

e.Produksi Indol

Media yang digunakan : SIM agar deep tubes

Kompisisi Media : - Bacteriological agar (3,5 gr)

- Ferric ammonium sulfate (0,2 gr)

- Casein peptone (20 gr)

- Meat peptone (6,1 gr)

- Sodium thiosulfate (0,2 gr)

Reagen yang diperlukan : Kovac’s reagent

Lama inkubasi : 24 – 48 jam pada 370C

Triptofan adalah asam amino esensial yang dapat mengalami oksidasi

melalui beberapa aktifitas enzimatik bakteri. Konfersi triptofan menjadi

produk metabolit dilakukan oleh enzim triptofanase. Reaksinya sebagai

berikut :

Kemampuan hidolisis triptofan dan produksi indol bukan karakteristik

mikroorganisme dan oleh sebab itu dapat berfungsi sebagai penanda

biokimia.

Dalam uji ini digunakan agar SIM (Sulphite Indole Motility) yang

mengandung substrat trytophan. Keberadaan indol dideteksi dengan

menambahkan reagen Kovac yang menyebabkan lapisan reagen yang ada di

atas agar deep menjadi berwarna merah ceri. Indol diekstrak dari medium

ke lapisan reagen oleh komponen butyl alcohol yang diasamkan dengan

asam klorida (HCl) dan membentuk kompleks dengan p-

dimetilaminobenzaldehid yang menghasilkan warna merah ceri. Kultur yang

menghasilkan lapisan reagen yang berwarna merah ceri setelah ditambah

dengan reagen Kovac mengindikasikan indol positif. Ketidakhadiran warna

merah ceri mengindikasikan bahwa substrat tryptophan tidak terhidrolisis

dan mengindikasikan reaksi indol negative.

f.Tes metil merah (MR)

Media yang digunakan : MR-VP broth

Komposisi media : - Peptone mixture (7 gr)

- Potassium phosphate (5 gr)

- Dextrose (5 gr)

Reagen yang diperlukan : Metyl red indicator

Lama inkubasi : 24 – 48 jam pada 370C

Glukosa heksosa adalah substrat utama yang dioksidasi oleh seluruh

organisme enteric untuk produksi energi. Produk akhir dari reaksi ini dapat

bervariasi tergantung reaksi enzimatik spesifik yang ada dalam bakteri. Pada

uji ini indicator methyl red mendeteksi keberadaan konsentrasi asam yang

besar pada hasil akhir dengan media MRVP Agar. Meskipun semua

mikroorganisme enteric memfermentasi glukosa dengan menghasilkan asam

organik, uji ini berguna dalam pemisahan E.coli dan E.aerogenes.

Kedua organisme ini menghasilkan produk akhir asam organik selama

masa inkubasi awal. Derajat keasaman yang rendah (pH = 4) distabilisasi

dan diatur oleh E.coli pada akhir masa inkubasi. Selama inkubasi

selanjutnya, E.aerogenes secara enzimatik mengubah asam ini ke hasil akhir

yang tidak asam seperti 2,3-butanadiol dan acetoin (asetilmetil-karbinol)

yang menghasilkan pH sekitar 6. Reaksinya sebagi berikut:

Glukosa + H2O + CO2 + H2 (pH 4.0)

Indikator metal red pada pH sekitar 4 akan berwarna merah yang

mengindikasikan bahwa hasil uji positif. Pada pH sekitar 6 masih tetap

mengindikasikan keberadaan asam tapi pada konsentrasi ion hydrogen yang

lebih rendah. Indikator berubah warna jadi kuning dan mengindikasikan

hasil uji yang negatif. Produksi dan deteksi produk akhir non asam dari

fermentasi glukosa E. areogenes diperkuat dengan uji Voges-Proskauer.

g.Tes Voges-Proskauer

Media yang digunakan : MR-VP broth

Komposisi media : - Peptone mixture (7 gr)

- Potassium phosphate (5 gr)

Uji + ditunjukkan dengan warna media yang menjadi merah.

Asam laktatAsam AsetatAsam format

- Dextrose (5 gr)

Reagen yang diperlukan : Barritt’s reagent A dan B

Lama inkubasi : 24 – 48 jam pada 370C

Uji Voges-Proskauer menentukan kemampuan beberapa organisme untuk

memproduksi produk akhir non asam atau netral seperti asetilmetil -karbinol

yang berasal dari metabolisme glukosa. Reagen yang digunakan dalam uji

ini adalah reagen Barrit yang mengandung campuran α-naphthol alkoholik

dan larutan 40% potassium hydroxide (KOH). Deteksi acetylmethylcarbinol

membutuhkan hasil akhir ini untuk dioksidasi menjadi senyawa diasetil.

Reaksi ini terjadi pada keberadaan katalis α-naphthol dan grup guanidine

yang ada pada peptone pada medium MRVP. Sebagai hasil, kompleks pink

terbentuk, sebagai warna mawar pada medium. Keberadaan warna mawar

tua pada kultur setelah penambahan reagen Barritt mengindikasikan

keberadaan acetylmethylcarbinol dan merupakan hasil positif, dan bila tidak

ada berarti hasilnya negatif.

h.Penggunaan Sitrat

Media yang digunakan : Simmons citrate agar slant

Komposisi media : - ammonium dihydrogen phosphate (1 gr)

- dipotassium hydrogen phospate (1 gr)

- sodium chloride (5 gr)

- sodium citrate (2 gr)

- magnesium sulfate (0,2 gr)

Kompleks berwarna

Pink

CH3

C

CH

CH3

O

OH+

40% KOH

Oksidasi

OHCH3

C

C

CH3

O

O

+C NH

NH2

NH-R

Asetilmetilkarbinol -naftol Diasetil Guanidin

Reaksi Asetilmetilkarbinol dengan reagen Barrit

Kompleks berwarna

Pink

CH3

C

CH

CH3

O

OH+

40% KOH

Oksidasi

OHCH3

C

C

CH3

O

O

+C NH

NH2

NH-R

Asetilmetilkarbinol -naftol Diasetil Guanidin

Reaksi Asetilmetilkarbinol dengan reagen Barrit

- bromthymol blue (0,08 gr)

- bacterological agar (15 gr)

Lama inkubasi : 24 – 48 jam pada 370C

Pada ketiadaan glukosa atau laktosa yang dapat difermentasi, beberapa

mikroorganisme menggunakan sitrat sebagai sumber karbon untuk produksi

energi mereka. Kemampuan ini tergantung pada keberadaan enzim sitrat

permease yang memfasilitasi transport sitrat dalam sel. Sitrat merupakan

senyawa intermediet utama dalam sel dan diproduksi dengan kondensasi

asetil aktif dengan asam oksalaasetat. Sitrat, dengan keberadaan enzim

sitrase, menghasilkan asam oksalaasetat dan asetat. Produk tersebut

kemudian secara enzimatis diubah menjadi asam piruvat dan

karbondioksida. Selama reaksi, medium menjadi alkalin-karbondioksida

yang dihasilkan berkombinasi dengan sodium dan air membentuk sodium

carbonate, sebuah produk alkalin. Kehadiran sodium carbonate mengubah

indicator bromthymol biru pada medium dari hijau menjadi biru tua Prussia.

Sitrat positif ditunjukkan pertumbuhan pada permukaan slant yang diikuti

warna biru, sedangkan negatif bila tanpa pertumbuhan dan medium tetap

berwarna hijau.

COOH

CH2

COOH

HO C COOH

CH2

Citrate

Citrase

Acetic acidPyruvic

acid

Excess carbon dioxide

+

Oxaloasetic acid

COOHCOOH

COOH

C O

CH2 COOH

CH3

COOH

COOH

C O

CH3

+ CO2

1.

CO2 + 2Na+ + H2O Na2CO3 Alkaline pH perubahan warna dari hijau

ke menjadi biru

2.

i.Aktifitas urease

Media yang digunakan : Urea broth

Komposisi media : - dipotassium phosphate (9,5 gr)

- phenol red (0,1 gr)

- monopotassium phosphate (9,1 gr)

- urea (20 gr)

- yeast extract (0,1 gr)

Lama inkubasi : 24 – 48 jam pada 370C

Urease yang diproduksi oleh beberapa mikroorganisme merupakan enzim

yang secara khusus membantu mengidentifikasi Proteus vulgaris. Walaupun

organisme lain mungkin menghasilkan urease, peran mereka pada substrat

lebih lambat jika dibandingkan dengan spesies Proteus. Oleh karena itu, tes

ini dapat dengan cepat membedakan anggota dari genus ini dari

mikroorganisme lain yang tidak memfermentasi laktosa.

Urease adalah enzim hydrolitik yang menyerang ikatan nitrogen n karbon

pada komponen amida misalnya urea dan membentuk alkaline yang produk

akhirnya adalah ammonia .

Adanya urease dapat dideteksi ketika organisme ditumbuhkan dalam urea

broth medium yang mengandung pH indicator phenol red. Ketika substrat

urea dipisahkan dari produknya,adanya ammonia membuat lingkungan

alkaline yang menyebabkan phenol red berubah menjadi deep pink. Hal ini

menunjukkan reaksi positif terhadap adanya urease. Kegagalan perubahan

warna menjadi deep pink membuktikan reaksi negatif.

j.Aktivitas katalase

Media yang digunakan :Nutrient Agar

Kompisisi Media : - Peptone from casein (10 gr)

- Meat extract (3 gr)

- Agar (12 gr)

Lama inkubasi : 24 – 48 jam pada 370C

Selama respirasi aerobik, mikroorganisme memproduksi hydrogen

peroksida dan dalam beberapa kasus, secara ekstrem menghasilkan toxic

superoxide. Diperkirakan substansi ini akan dihasilkan dari organisme yang

mati jika tidak mereka dapat didegradasi secara enzimatik. Substansi ini

diproduksi ketika bakteri aerob, facultative anaerob, dan mikroaerophile

menggunakan jalur respirasi aerobic,di mana oksigen merupakan akseptor

electron terakhir, selama proses degradasi karbohidrat untuk produksi

energi. Organisme yang mampu memproduksi katalase secara cepat

mendegradasi hydrogen peroksida berdasarkan reaksi berikut :

2H2O2 2H2O + O2 (g)

Organisme aerobic yang kekurangan katalase dapat mendegradasi toxic

superoxide secara khusus menggunakan enzim superoxide dismutase; hasil

akhir dari superoxide dismutase adalah H2O2, tetapi H2O2 kurang berbahaya

bagi sel bakteri jika dibandingkan dengan superoksida.

Ketidakmampuan strict anaerob untuk mensintesis katalase, peroxidase,

atau superoxide dismutase mungkin menjelaskan mengapa oksigen menjadi

beracun untuk mikroorganisme. Bila enzim – enzim di atas tidak ada maka

menyebabkan konsentrasi zat toksik dari H2O2 tidak dapat didegradasi ketika

organisme tersebut ditumbuhkan disertai adanya oksigen.

Produksi katalase dapat ditentukan dengan penambahan substrat H2O2

pada tryticase soy agar slant culture yang telah diinkubasi. Jika ada katalase,

seperti yang telah disebutkan pada reaksi kimia diindikasikan oleh

gelembung dari gas oksigen yang ‘terbebas’. Hal ini menunjukkan tes

Hidrogen Peroksida

AirOksigen

bebas

katalase positif; sedangkan tidak terbentuknya gelembung adalah tes

katalase negative.

l.Uji Bile Esculin

Media yang digunakan : Bile esculin agar

Lama inkubasi : 24 – 48 jam pada 370C

Media ini digunakan untuk mengidentifikasi group D streptococcus. Group

D streptococcus menunjukkan α atau -hemolysis pada blood agar plates.

Group ini meliputi enterococcus seperti Enterococcus faecalis, yang mungkin

menjadi penyebab infeksi pada urine. Selain itu, ada golongan

nonenterococci seperti S. Bovis, yang digunakan dalam pengobatan manusia

menggunakan laser. Enterococcus memiliki kemampuan antibiotik resisten

dan yang lebih jarang sebagai vancomycin.

Bile esculin test : Dengan adanya bile, Group D streptococci menghidrolisis

glycoside esculin menjadi 6,7-dihydroxy-coumarin yang bereaksi dengan iron

salt yang terkandung dalam medium. Hal ini menyebabkan timbulnya warna

cokelat – hitam pada medium setelah diinkubasi. Bila tidak terdapat warna

hitam tidak mengidentifikasi organisme Group D streptococci.

m.Uji 6.5% sodium chloride broth

Media yang digunakan : 6,5% NaCl Broth

Komposisi media : brain – heart infusion broth

NaCl 6,5%

Lama inkubasi : 24 – 48 jam pada 370C

Media ini digunakan untuk mengidentifikasi group D streptococcus. Group

D streptococcus menunjukkan α atau -hemolysis pada blood agar plates.

Group ini meliputi enterococcus seperti Enterococcus faecalis, yang mungkin

menjadi penyebab infeksi pada urine. Selain itu, ada golongan

nonenterococci seperti S. Bovis, yang digunakan dalam pengobatan manusia

menggunakan laser. Enterococcus memiliki kemampuan antibiotik resisten

dan yang lebih jarang sebagai vancomycin.

6.5% sodium chloride broth : Group D enterococci dapat diidentifikasi

dengan kemampuannya tumbuh pada medium ini jika dibandingkan dengan

non enterococci.

n.Aktivitas hemolytic

Media yang digunakan : blood agar base

Komposisi media : - proteose peptone (15 gr)

- liver digest (2,5 gr)

- yeast extract (5 gr)

- NaCl (5 gr)

- Agar (12 gr)

- Darah steril (5%)

Lama inkubasi : 24 – 48 jam pada 370C

Aktivitas hemolytic ini adalah salah satu cara untuk mengidentifikasi

adanya streptococci. Dari hasil penelitian, ada 3 tipe reaksi hemolytic pada

blood agar yaitu:

- () Alpha-hemolysis merupakan bentuk hemolisis yang tidak sempurna.

Ditandai dengan adanya zona berwarna hijau di sekitar koloni. -hemolytic

streptococci, Streptococcus viridans merupakan bakteri yang tidak patogen.

Sedangkan yang lain, memiliki kemampuan untuk menyebabkan infeksi

pada manusia seperti subacute endocarditis dan gagal jantung.

- () Beta-hemolysis merupakan penghancuran sel darah merah dengan

sempurna. Ditandai dengan terbentuknya zona bening sekitar 2 - 4 kali

diameter koloni. Streptococcus mampu memproduksi -hemolysins dan

bersimbiosis dengan bakteri patogen.

- () Gamma-hemolysis diindikasikan dengan tidak adanya hemolysis di

sekitar koloni. Sebagian besar, -hemolytic streptococci bersifat avirulent.

o. Uji Bile Solubility

Media yang digunakan : Bile solubility

Reagen yang digunakan : Na-deoksikolat

Lama inkubasi : 24 – 48 jam pada 370C

Adanya surface-active agents seperti bile dan bile salts (sodium

desoxycholate atau sodium dodecyl sulfate), menyebabkan dinding sel

pneumococcus mengalami lisis. Selain -hemolytic streptococci tidak akan

mengalami lisis oleh agen tadi dan tidak larut dalam bile. Setelah

diinkubasi, biakan yang larut dalam bile akan tampak jernih sedangkan yang

tidak larut dalam bile akan tampak keruh.

p. Uji Pigmen

Media yang digunakan : Nutrient Agar

Kompisisi Media : - Peptone from casein (10 gr)

- Meat extract (3 gr)

- Agar (12 gr)

Lama inkubasi : 24 – 48 jam pada 370C

Pada uji pigmen ini,apabila pada medium nutrient agar tidak terlihat warna

selain warna koloni, maka hal itu menandakan bahwa uji pigmen negatif.

Sedangan bila ditemukan warna yang lain berarti menandakan bahwa uji

pigment positif.

Selain dilakukan pewarnaan gram dan uji – uji biokimia, ada juga yang

membutuhkan pewarnaan spora untuk mengidentifikasi lebih lajut. Berikut

adalah penjelasan tentang pewarnaan spora.

Pewarnaan spora

Peralatan yang diperlukan : Bunsen, hotplate, staining tray, inoculating

loop, glass slides, bibulous paper, lens paper

dan mikroskop

Reagen yang dibutuhkan : Malachite green dan safranin

Lama inkubasi untuk biakan : 48 - 72 jam pada media agar slant

Endospora merupakan

struktur yang bersifat resisten,

dorman, dan berfungsi untuk

melindungi bakteri dari

lingkungan yang tidak

menguntungkan. Struktur ini

tidak dapat diwarnai dengan

metode pewarnan sederhana

maupun gram. Metode yang umum digunakan adalah Scaeffer-Fulton

endospore stain. Metode ini menggunakan malakit hijau sebagai pewarna

primer (primer stain) dan safranin sebagai caounterstain.Gambar tentang

berbagai bentuk spora sebagai berikut :

A: oval, terminal

B: rectangular, terminal

C: rectangular, subterminal

D: rectangular, central

E: circular, terminal

F: circular, central

G: inflated spore

Pedoman yang digunakan oleh praktikan dalam mengidentifikasi spesies

suatu sampel adalah pohon filogenik. Hal ini disebabkan masing- masing

spesies memiliki jalur yang berbeda dalam proses

pengidentifikasiannya.Berikut skema pohon filogenik :

Penjelasan tentang pohon filogenik sebagai berikut :

Setelah praktikan dapat mengidentifikasi bakteri berdasarkan pewarnaan

gram dan morfologi bakteri, maka dapat disimpulkan sebagai berikut :

1a.Bakteri Gram positif dan bentuk morfologinya cocci

Beberapa bakteri yang mungkin terdapat dalam sampel adalah Micrococcus

spp, Staphylococcus spp dan Streptococcus spp. Untuk mengetahui lebih

detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan uji biokimia yaitu uji

katalase.

1b.Bakteri Gram positif dan bentuk morfologinya Bacilli

Beberapa bakteri yang mungkin terdapat dalam sampel adalah

Corynebacterium spp. dan Lactobacillus spp.Untuk mengetahui lebih detail

tentang spesies sampel kita, maka dilakukan pewarnaan spora.

1c.Bakteri Gram negatif dan bentuk morfologinya cocci

Beberapa bakteri yang mungkin terdapat dalam sampel adalah Branhamella

spp, Moraxella spp, dan Neisseria spp.Untuk mengetahui lebih detail

tentang spesies sampel kita, maka dilakukan uji biokimia yaitu uji glukosa.

1d.Bakteri Gram negatif dan bentuk morfologinya Bacilli

Beberapa bakteri yang mungkin terdapat dalam sampel adalah Citrobacter

spp, Enterobacter spp., Escherichia spp., Klebsiella spp., Proteus spp., dan

Pseudomonas spp.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel

kita, maka dilakukan uji biokimia yaitu uji laktosa.

Bakteri Gram positif dan bentuk morfologinya cocci

Uji Katalase

2a. Bila uji katalase menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang ada

dalam sampel adalah Micrococcus spp. dan Staphylococcus spp. Untuk

mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan uji

mannitol.

2b. Bila uji katalase menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri yang ada

dalam sampel adalah Streptococcus spp.. Untuk mengetahui lebih detail

tentang spesies sampel kita, maka dilakukan uji bile esculin.

Uji Mannittol

3a. Bila uji Mannitol menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang ada

dalam sampel adalah Staphylococcus aureus.

3b. Bila uji Mannitol menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri yang

ada dalam sampel adalah S. Saprophyticus, S.epidermis, M.luteus,

M.varians. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka

dilakukan Uji Pigment.

Uji Bile Esculin

3c. Bila uji Bile Esculin menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang

ada dalam sampel adalah E. Faecalis dan S.bovis. Untuk mengetahui lebih

detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan uji pada 6.5% NaCl

Broth.

3d. Bila uji Bile Esculin menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri yang

ada dalam sampel adalah S.pneumoniae, S.mitis dan S.pyogenes. Untuk

mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji

Hemolysis.

Uji Pigment

4a. Bila uji Pigment menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang ada

dalam sampel adalah M.luteus dan M. varians. Untuk mengetahui lebih

detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji Fermentasi Glukosa.

4b. Bila uji Pigment menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri yang ada

dalam sampel adalah S. Saprophyticus dan S.epidermis. Untuk mengetahui

lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji Fermentasi

Fruktosa.

Uji pada 6.5% NaCl Broth

4c. Bila uji pada 6.5% NaCl Broth menunjukkan positif maka kemungkinan

bakteri yang ada dalam sampel adalah E. Faecalis.

4d. Bila uji pada 6.5% NaCl Broth menunjukkan negatif maka kemungkinan

bakteri yang ada dalam sampel adalah S.bovis.

Uji Hemolysis

4e. Bila uji Hemolysis menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang

ada dalam sampel adalah alpha hemolysis yaitu S.pneumoniae dan S.mitis.

Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan

Uji Bile Solubility.

4f. Bila uji Hemolysis menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri yang

ada dalam sampel adalah S.pyogenes.

Uji Fermentasi Glukosa

5a. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan positif maka kemungkinan

bakteri yang ada dalam sampel adalah M. varians.

5b.Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan negatif maka kemungkinan

bakteri yang ada dalam sampel adalah M. luteus.

Uji Fermentasi Fruktosa

5c. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan positif maka kemungkinan

bakteri yang ada dalam sampel adalah S. epidermis.

5d.Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan negatif maka kemungkinan

bakteri yang ada dalam sampel adalah S. saprophyticus.

Uji Bile Solubility

5e. Bila uji Bile Solubility menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri

yang ada dalam sampel adalah S.pneumoniae.

5b.Bila uji Bile Solubility menunjukkan negatif maka kemungkinan bakteri

yang ada dalam sampel adalah S. mitis.

Bakteri Gram positif dan bentuk morfologinya Bacilli

2a Bila terdapat spora dalam sampel, maka kemungkinan bakteri yang ada

dalam sampel adalah Bacillus spp.. Untuk mengetahui lebih detail tentang

spesies sampel kita, maka dilakukan uji mannitol.

2b. Bila tidak ditemukan adanya spora, maka kemungkinan bakteri yang ada

dalam sampel adalah Corynebacterium spp. dan Lactobacillus spp. Untuk

mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan uji

katalase.

Uji mannitol

3a. Bila uji mannitol menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang ada

dalam sampel adalah B. Megaterium dan B.subtilis. Untuk mengetahui lebih

detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji Voges-Proskauer.

3b. Bila uji mannitol menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri yang ada

dalam sampel adalah B. cercus.

Uji katalase

3c. Bila uji katalase menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang ada

dalam sampel adalah Corynebacterium spp. Untuk mengetahui lebih detail

tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji Reduksi Nitrat.

3d. Bila uji katalase menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri yang ada

dalam sampel adalah Lactobaciillus spp. Untuk mengetahui lebih detail

tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji Fermentasi Glukosa.

. Uji Voges-Proskauer

4a. Bila uji mannitol menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang ada

dalam sampel adalah B.subtilis.

4b. Bila uji mannitol menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang ada

dalam sampel adalah B. Megaterium.

Uji Reduksi Nitrat

4c. Bila uji katalase menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang ada

dalam sampel adalah C. xerosis.

4d. Bila uji katalase menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang ada

dalam sampel adalah C. Kutscheri.

Uji Fermentasi Glukosa

4e. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan positif (terbentuk asam dan gas),

maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah L.fermentum.

4f. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan negatif (hanya terbentuk asam),

maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah L. casei dan L.

delbrueckii Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka

dilakukan Uji Fermentasi Mannitol.

Uji Fermentasi Mannitol.

5a. Bila uji Fermentasi Mannitol menunjukkan positif, maka kemungkinan

bakteri yang ada dalam sampel adalah L. casei

5b. Bila uji Fermentasi Mannitol menunjukkan negatif, maka kemungkinan

bakteri yang ada dalam sampel adalah L. delbrueckii.

Bakteri Gram negatif dan bentuk morfologinya cocci

Uji Fermentasi Glukosa

2a. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan positif, maka kemungkinan

bakteri yang ada dalam sampel adalah Neisseria spp .Untuk mengetahui

lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji Reduksi Nitrat .

2b. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan negatif, maka kemungkinan

bakteri yang ada dalam sampel adalah Branhamella spp dan Moraxella

spp.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka

dilakukan Uji Reduksi Nitrat.

Uji Reduksi Nitrat

3a. Bila uji Reduksi Nitrat menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri

yang ada dalam sampel adalah N. mucosa .

3b. Bila uji Reduksi Nitrat menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri

yang ada dalam sampel adalah N.sicca .

3c. Bila uji Reduksi Nitrat menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri

yang ada dalam sampel adalah B.catarrhalis

3d. Bila uji Reduksi Nitrat menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri

yang ada dalam sampel adalah M. bovis

Bakteri Gram negatif dan bentuk morfologinya Bacilli

Uji Fermenatasi Laktosa

2a. Bila uji Fermentasi Laktosa menunjukkan positif, maka kemungkinan

bakteri yang ada dalam sampel adalah Citrobacter spp, Enterobacter spp.,

Escherichia spp. dan Klebsiella spp.Untuk mengetahui lebih detail tentang

spesies sampel kita, maka dilakukan Uji Produksi Indole .

2b. Bila uji Fermentasi Laktosa menunjukkan negatif, maka kemungkinan

bakteri yang ada dalam sampel adalah Proteus spp., dan Pseudomonas

spp.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka

dilakukan Uji Fermentasi Glukosa

Uji Produksi Indole

3a. Bila uji produksi indol menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri

yang ada dalam sampel adalah C. Intermedius dan E. coli.Untuk mengetahui

lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji Penggunaan

Citrate .

3b.Bila uji produksi indol menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri

yang ada dalam sampel adalah C. freundii, Enterobacter spp., Escherichia

spp. dan Klebsiella spp.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies

sampel kita, maka dilakukan Uji Metyl Red .

Uji Fermentasi Glukosa

3c.Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan positif, maka kemungkinan

bakteri yang ada dalam sampel adalah Proteus spp.Untuk mengetahui lebih

detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji Produksi Indole.

3d.Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan negatif, maka kemungkinan

bakteri yang ada dalam sampel adalah Pseudomonas spp.Untuk mengetahui

lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji Reduksi

Nitrate.

Uji Penggunaan Citrate

4a. Bila uji Penggunaan Citrate menunjukkan positif, maka kemungkinan

bakteri yang ada dalam sampel adalah C. Intermedius

4b. Bila uji Penggunaan Citrate menunjukkan negatif, maka kemungkinan

bakteri yang ada dalam sampel adalah E. coli.

Uji Metyl Red

4c. Bila uji Metyl Red menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang

ada dalam sampel adalah C. freundii dan K.ozaenae..Untuk mengetahui

lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji Produksi H2S.

( I )

4d. Bila uji Metyl Red menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri yang

ada dalam sampel adalah E. Aerogenes dan K. Pneumoniae.Untuk

mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji

aktivitas urease. ( I )

Uji Produksi Indole

4e. Bila uji Produksi Indole menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri

yang ada dalam sampel adalah P. vulgaris dan P.rettgeri.Untuk mengetahui

lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji Produksi H2S.

( II )

4f. Bila uji Produksi Indole menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri

yang ada dalam sampel adalah P. mirabilis dan P. inconstans.Untuk

mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji

aktivitas urease . ( II )

Uji Reduksi Nitrate

4g.Bila uji Reduksi Nitrate menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri

yang ada dalam sampel adalah P.aeruginosa dan P.fluorescens.Untuk

mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji

Litmus Milk.

4h.Bila uji Reduksi Nitrate menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri

yang ada dalam sampel adalah P.mallei.

Uji Produksi H2S( I )

5a. Bila uji Produksi H2S menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang

ada dalam sampel adalah C. freundii

5b. Bila uji Produksi H2S menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri

yang ada dalam sampel adalah K.ozaenae..

Uji aktivitas urease( I )

5c. Bila uji aktivitas urease menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri

yang ada dalam sampel adalah K. Pneumoniae.

5d. Bila uji aktivitas urease menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri

yang ada dalam sampel adalah E. Aerogenes.

Uji Produksi H2S( II )

5e. Bila uji Produksi Indole menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri

yang ada dalam sampel adalah P. vulgaris.

5f. Bila uji Produksi Indole menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri

yang ada dalam sampel adalah P.rettgeri.

Uji aktivitas urease( II )

5g. Bila uji aktivitas urease menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri

yang ada dalam sampel adalah P. mirabilis.

5h. Bila uji aktivitas urease menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri

yang ada dalam sampel adalah P. inconstans.

Uji Litmus Milk

5i.Bila uji Litmus Milk menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang

ada dalam sampel adalah P.aeruginosa yang mengalami peptonization

5j.Bila uji Litmus Milk menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang

ada dalam sampel adalah P.fluorescens yang mengalami reaksi alkaline.

III. Alat dan Bahan :

1.Alat :

- Tabung

- Cawan petri

- Objek glass

- Jarum ose

- Erlemeyer

- Beker glass

- Pipet

- Hotplate stirrer

- Lampu spiritus

2.Bahan :

- Sampel bakteri (Sampel 1, 2, 3) - Phenol Red Lactose Broth

- Crystal violet (Gram I) - Phenol Red Dextrose Broth

- Safranin (Gram IV) - Phenol Red Sucrose Broth

- Etanol 95% (Gram III) - Medium SIM Agar

- Gram’s iodine (Gram II) - MRVP Broth

- Barrit A dan Barrit B - Simmon’s Citrate Agar

- Reagen kovac’s - Urea Broth

- H2O2 3% - Starch Agar

- Medium TSA - Nutrien Gelatin Broth

- Medium Litmus Milk - Nitrate Broth

IV. Cara Kerja :

1.Pewarnaan Gram:

a.Menetesi preparat olesan bakteri yang telah difiksasi dengan beberapa tetes

larutan karbolgentian violet (Gram I), membiarkan selama 3 menit. Membilas

dengan air.

b.Menetesi preparat dengan larutan lugol (Gram II) beberapa tetes.

Membiarkan selama 1 menit.

c. Membilas dengan air.

d. Mencuci dengan larutan Gram III (alkohol 96%) dengan cara

memiringkan preparat kemudian menetesi perlahan- lahan dengan Gram

III hingga tidak ada pewarna yang terlunturkan.

e. Membilas preparat secara hati-hati dnegan air

f. Menetesi preparat dengan larutan fuchsin (Gram IV) beberapa tetes.

Mendiamkan selama 3 menit.

g. Membilas preparat dengan air. Kemudian mengeringkan di udara atau

dengan cara menyerap kelebihan air dengan tissue.

h. Mengamati preparat di mikroskop dan mencatat hasilnya.

2. Pembuatan Media untuk Stock Culture(Peremajaan)

TSA slant (40 gr/L)

-Menimbang TSA kemudian melarutkannya ke dalam aquades

-Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer

-Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian

diautoclave.

-Memiringkan tabung agar terbentuk media slant

3.Pembuatan Media untuk Uji Biokimia

a.Litmus Milk (100 gr/L)

Cara pembuatan media :

-Menimbang litmus milk kemudian melarutkannya ke dalam aquadest

-Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer

-Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian

diautoclave.

Langkah inokulasi ke media :

1.Menyiapkan tabung reaksi yang berisi Litmus Milk Broth

2.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis, menanam pada

media tersebut.

3.Menginkubasi selama 24 – 48 jam pada suhu 370C.

b.Phenol Red Lactose Broth (20 gr/L)

-Menimbang phenol red lactose broth kemudian melarutkannya ke dalam

aquadest

-Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer

-Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian

diautoclave.

c.Phenol Red Fructose Broth (20 gr/L)

-Menimbang phenol red fructose broth kemudian melarutkannya ke dalam

aquadest

-Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer

-Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian

diautoclave.

d.Phenol Red Glucose Broth (20 gr/L)

-Menimbang phenol red glucose broth kemudian melarutkannya ke dalam

aquadest

-Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer

-Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian

diautoclave

e.Phenol Red Mannitol Broth (20 gr/L)

-Menimbang phenol red mannitol broth kemudian melarutkannya ke dalam

aquadest

-Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer

-Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian

diautoclave

Langkah inokulasi ke media fermentasi :

1.Menyiapkan tabung reaksi yang berisi media dengan berbagai macam

karbohidrat : phenol red lactose broth, phenol red sucrose broth, dan phenol

red dextrose broth.

2.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis, menanam pada

media – media pada bagian 1.

3.Menginkubasi selama 24 - 48 jam pada suhu 370C.

e.SIM Agar Deep Tube (30 gr/L)

-Menimbang SIM medium kemudian melarutkannya ke dalam aquadest

-Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer

-Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian

diautoclave.

Langkah inokulasi pada media :

1.Menyiapkan tabung reaksi yang berisi SIM agar deep tubes

2.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis, menanam pada

media SIM dengan menusukkan ke dalam agar.

3.Menginkubasi selama 24 – 48 jam pada suhu 370C.

4.Untuk tes produksi Indol ditambahkan reagen Kovac 3-5 tetes pada medium

yang telah diinkubasi.

f.Simmon Citrate Agar Slant (22,5 gr/L)

-Menimbang SCA kemudian melarutkannya ke dalam aquadest

-Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer

-Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian

diautoclave.

-Memiringkan tabung agar terbentuk media slant

Langkah inokulasi pada media :

1.Menyiapkan tabung reaksi yang berisi Simmons citrate agar slants

2.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis, menanam pada

media tersebut dengan cara menggores zig-zag pada bagian yang miring.

3.Menginkubasi selama 24 – 48 jam pada suhu 370C

g.Urea Broth (38,5 gr/L)

-Menimbang urea broth kemudian melarutkannya ke dalam aquadest

-Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer

-Mensterilkan campuran dengan memfiltrasinya

-Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung

Langkah inokulasi pada media :

1.Menyiapkan tabung reaksi yang berisi Urea Broth

2.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis, menanam pada

media tersebut.

3.Menginkubasi selama 24 – 48 jam pada suhu 370C

h.Tryptycase Soy Agar (TSA) Plate (40 gr/L)

-Menimbang medium TSA kemudian melarutkannya ke dalam aquadest

-Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer kemudian diautoclave

-Memasukkan campuran ke dalam cawan petri steril dan membiarkannya

memadat.

Langkah inokulasi pada medium :

1.Menyiapkan plate berisi TSA

2.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis, menanam pada media

tersebut dengan men-strict medium

3.Menginkubasi selama 24-48 jam pada suhu 370C

i.Nutrient Agar

-Menimbang Nutrient Agar kemudian melarutkannya ke dalam aquadest

-Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer kemudian diautoclave

-Memasukkan campuran ke dalam cawan petri steril dan membiarkannya

memadat.

Langkah inokulasi pada medium :

1.Menyiapkan tabung reaksi yang berisi Nutrient Agar slant

2.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis, menanam pada

media tersebut dengan cara menggores zig-zag pada bagian yang miring.

3.Menginkubasi selama 24 – 48 jam pada suhu 370C

4.Untuk membuktikan adanya aktivitas katalase ditambahkan reagen H2O2 3%

pada medium yang tlah diinkubasi.

V. Hasil Percobaan :

1.Pewarnaan gram

1a.Pewarnaan gram E.coli

1b.Pewarnaan gram Staphylococcus epidermis

1c.Pewarnaan gram Proteus mirabilis

2.Uji Biokimia

2.Uji Biokimia

2a.Uji Biokimia E.coli

-Uji Laktosa

-Uji Indol

-Uji Citrat

b.Uji Biokimia Staphylococcus epidermis

-Uji Katalase

-Uji Mannitol

-Uji Pigment

-Uji Fruktosa

c.Uji Biokimia Proteus mirabilis

-Uji Laktosa

-Uji Glukosa

-Uji Indole

-Uji Urea

3. Tabel Hasil Percobaan

3a. Tabel Hasil Percobaan E.coli

Macam Uji Hasil Uji

Pewarnaan Gram negative

Morfologi coccobacill

Fermentasi Laktosa +

Produksi Indol (SIM medium) +

Penggunaan sitrat -

3b. Tabel Hasil Percobaan Staphylococcus epidermis

Macam Uji Hasil Uji

Pewarnaan Gram positif

Morfologi coccus

Aktivitas katalase +

Fermentasi mannnitol -

Pigment -

Fermentasi Fruktosa +

3c. Tabel Hasil Percobaan Proteus mirabilis

Macam Uji Hasil Uji

Pewarnaan Gram negative

Morfologi bacill

Fermentasi laktosa -

Fermentasi glukosa +

Produksi Indol (SIM medium) -

Aktivitas Urease +

VI.Pembahasan

1.Sampel A

1a.Pewarnaan Gram & Morfologi

Hasil uji morfologi pada sampel A menunjukkan bahwa bakteri pada

sampel A termasuk ke dalam golongan bakteri gram negatif dengan bentuk

coccobacill. Bakteri tersebut berwarna merah setelah diwarnai dengan

pewarnaan gram. Hal ini disebabkan oleh, lapisan lipopolisakarida pada bakteri

ini lebih sedikit sehingga pewarna gram I yang ada pada dinding selnya akan

luntur bersama dengan lapisan lipopolisakaridanya ketika dicucci dengan gram

III (alkohol) sehingga yang tersisa hanya warna merah dari safranin yang

merupakan pewarna tandingan. Oleh karena itu, dari hasil pewarnaan gram dan

morfologi dapat disimpulkan bahwa bakteri sampel A merupakan bakteri gram

negatif dan bentuknya coccobacill sehingga untuk uji berikutnya yang harus

dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji fermentasi laktosa.

1b.Uji Fermentasi Laktosa

Uji Fermentasi Laktosa ini dilakukan pada medium phenol red lactosa

broth.Pada uji ini, bakteri sampel A tidak dapat memfermentasi laktosa. Hasil

uji negatif ini ditunjukkan oleh warna media yang tetap merah (tidak berubah

menjadi kuning) dan tidak ada gas di dalam tabung durham terbalik. Oleh

karena itu, untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon

filogenik adalah uji Produksi Indol.

1c.Uji Produksi Indol

Uji Produksi Indol ini dilakukan pada medium SIM dengan bantuan

penambahan reagen Kovac akan terlihat cincin pink pada medium. Pada uji ini,

bakteri sampel A menunjukkan hasil positif yaitu terbetuk cincin pink setelah

penambahan reagen Kovac. Hal ini berarti bakteri sampel A memiliki enzim

triptofanase untuk memecah triptofan sesuai dengan reaksi berikut :

.

Oleh karena itu, untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan

pohon filogenik adalah uji penggunaan citrat.

1d.Uji Penggunaan Citrat

Uji penggunaan sitrat menggunakan medium Simmon’s Citrate Agar yang

mengandung sitrat sebagai satu – satunya sumber karbon. Pada uji ini, bakteri

sampel A menunjukkan hasil negatif yang ditandai dengan tidak berubahnya

warna medium dari hijau menjadi biru. Hal ini berarti bakteri sampel A tidak

memiliki enzim citrase untuk mengubah sitrat menjadi oksaloasetat dan asam

asetat yang selanjutnya akan dirubah menjadi asam piruvat dan CO2 . Oleh

karena itu, dapat disimpulkan berdasrkan pohon filogenik bahwa bakteri

sampel A adalah E.coli.

2.Sampel B

2a.Pewarnaan Gram & Morfologi

Hasil uji morfologi pada sampel B menunjukkan bahwa bakteri pada sampel

B termasuk ke dalam golongan bakteri gram positif dengan bentuk coccus.

Bakteri tersebut berwarna biru-ungu setelah diwarnai dengan pewarnaan gram.

Hal ini disebabkan oleh, lapisan lipopolisakarida pada bakteri ini cukup tebal

sehingga pewarna gram I yang ada pada dinding selnya tidak bisa luntur ketika

dicuci dengan gram III (alkohol) sehingga yang tersisa adalah warna biru-ungu

oleh reagen kristal-violet. Oleh karena itu, dari hasil pewarnaan gram dan

morfologi dapat disimpulkan bahwa bakteri sampel B merupakan bakteri gram

positif dan bentuknya coccus sehingga untuk uji berikutnya yang harus

dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji aktivitas katalase.

2b.Uji Aktivitas Katalase

Uji aktifitas katalase dilakukan dengan menggunakan medium TSA dan

selanjutnya dilakukan penambahan reagen berupa H2O2 3%. Bakteri sampel B

menunjukkan hasil positif pada uji ini yang artinya bakteri sampel B memiliki

enzim katalase. Hasil positif tersebut ditunjukkan dengan adanya gelembung –

gelembung gas pada permukaan koloni ketika ditetesi dengan H2O2 3%. Hal ini

berarti bakteri sampel B dapat memecah hidrogen peroksida menjadi air dan

karbondioksida sesuai reaksi berikut

Oleh karena itu, untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan

pohon filogenik adalah uji fermentasi mannitol.

2c.Uji Fermentasi Mannitol

Uji Fermentasi Mannitol ini dilakukan pada medium phenol red mannitol

broth.Pada uji ini, bakteri sampel B tidak dapat memfermentasi mannitol. Hasil

uji negatif ini ditunjukkan oleh warna media yang tetap merah (tidak berubah

menjadi kuning) dan tidak ada gas di dalam tabung durham terbalik. Oleh

karena itu, untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon

filogenik adalah uji pigment.

2d.Uji Pigment

Uji Pigment ini dilakukan pada medium nutrient agar.Pada uji ini, bakteri

sampel B tidak menampakkan warna yang lain selain warna koloni yaitu putih

mengkilap. Hal itu berarti hasil uji pigment adalah negatif.Oleh karena itu,

untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah

uji fermentasi fruktosa

2e.Uji Fermentasi Fruktosa

Uji Fermentasi Fruktosa ini dilakukan pada medium phenol red fructosa

broth. Pada uji ini, bakteri sampel B dapat memfermentasi fruktosa sehingga

hasilnya positif. Hasil uji positif pada fermentasi laktosa ditandai dengan

berubahnya warna medium menjadi kuning yang disebabkan oleh adanya

produk akhir fermentasi yang bersifat asam, dan juga adanya gas.Oleh karena

itu, dapat disimpulkan berdasarkan pohon filogenik bahwa bakteri sampel B

adalah Staphylococcus epidermis.

3.Sampel C

3a.Pewarnaan Gram & Morfologi

Hasil uji morfologi pada sampel C menunjukkan bahwa bakteri pada sampel

C termasuk ke dalam golongan bakteri gram negatif dengan bentuk bacill.

Bakteri tersebut berwarna merah setelah diwarnai dengan pewarnaan gram. Hal

ini disebabkan oleh, lapisan lipopolisakarida pada bakteri ini lebih sedikit

sehingga pewarna gram I yang ada pada dinding selnya akan luntur bersama

dengan lapisan lipopolisakaridanya ketika dicucci dengan gram III (alkohol)

sehingga yang tersisa hanya warna merah dari safranin yang merupakan

pewarna tandingan. Oleh karena itu, dari hasil pewarnaan gram dan morfologi

dapat disimpulkan bahwa bakteri sampel C merupakan bakteri gram negatif dan

bentuknya bacill sehingga untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai

dengan pohon filogenik adalah uji fermentasi laktosa.

3b.Uji Fermentasi Laktosa

Uji Fermentasi Laktosa ini dilakukan pada medium phenol red lactosa broth.

Pada uji ini, bakteri sampel C tidak dapat memfermentasi laktosa. Hasil uji

negatif ini ditunjukkan oleh warna media yang tetap merah (tidak berubah

menjadi kuning) dan tidak ada gas di dalam tabung durham terbalik. Oleh

karena itu, untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon

filogenik adalah uji fermentasi glukosa.

3c.Uji Fermentasi Glukosa

Uji Fermentasi Glukosa ini dilakukan pada medium phenol red glukosa

broth. Pada uji ini, bakteri sampel C dapat memfermentasi glukkosa sehingga

hasilnya positif. Hasil uji positif pada fermentasi laktosa ditandai dengan

berubahnya warna medium menjadi kuning yang disebabkan oleh adanya

produk akhir fermentasi yang bersifat asam, dan juga adanya gas. Oleh karena

itu, untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik

adalah uji Produksi Indol.

3d.Uji Produksi Indol

Uji Produksi Indol ini dilakukan pada medium SIM dengan bantuan

penambahan reagen Kovac akan terlihat cincin pink pada medium, bila hasilnya

positif. Akan tetapi, pada bakteri sampel C tidak menunjukkan terbentuknya

cicncin pink setelah penambahan reagen Kovac sehingga hasilnya negatif.Hal

ini berarti bakteri sampel A tidak memiliki enzim triptofanase untuk memecah

triptofan. Oleh karena itu, untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai

dengan pohon filogenik adalah uji aktivitas urease.

3e.Uji aktivitas urease.

Uji aktivitas urease. ini dilakukan pada medium urea broth yang

mengandung pH indicator phenol red. Pada uji ini, bakteri sampel C berubah

warna menjad deep pink yang menandakan bahwa uji aktivitas urease

positif.Hal ini menandakan bahwa Ketika substrat urea dipisahkan dari

produknya,adanya ammonia membuat lingkungan alkaline yang menyebabkan

phenol red berubah menjadi deep pink. Hal ini menunjukkan reaksi positif

terhadap adanya urease. Kegagalan perubahan warna menjadi deep pink

membuktikan reaksi negatif. Reaksinya sebagai berikut :

Oleh karena itu, dapat disimpulkan berdasarkan pohon filogenik bahwa

bakteri sampel C adalah Proteus mirabilis.

VII. Kesimpulan :

Dalam melakukan identifikasi spesies dilakukan uji morfologi dan uji

biokimia. Selain itu, yang menjadi pedoman utama dalam pengidentifkasian

spesies adalah penggunaan pohon filogenik. Hal in disebabkan karena masing

– masing spesies memiliki jalur yang berbeda baik dalam pewarnaan

gram/morfologi atau metabolismenya. Oleh karena itu,sampel kami berurutan

dari adalah Escherichia coli, Staphylococcus epidermis dan Proteus mirabilis.

VIII. Daftar Pustaka

Tortora, Gerard J, Berdell R. Funke, Christine L.Case, Microbiology-An Introduction, Benjamin Cummings, San Francisco, 2001.

Cappuccino, James G, Natalie Sherman, “Microbiology – A Laboratory Manual”, seventh edition, Benjamin Cummings, San Francisco, 2005.

http://www.siue.edu/~cbwilso/250cho.htm

http://www.slic2.wsu.edu:82/hurlbert/micro101/pages/101lab9.html