LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI

PEWARNAAN SEDERHANA

Senin, 3 Maret 2015

Kelompok III

Senin, Pukul 13.00 – 16.00 WIB

Nama NPM

Sheila Pratiwi 260110130150

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS PADJADJARAN

2015

Nilai TTD

(Dhiya) (Emanuel) (Puspagita)

Pewarnaan Sederhana

I. Tujuan

Mengamati ukuran, bentuk dan struktur-struktur tertentu dari bakteri, dengan

menggunakan satu macam zat pewarna

II. Prinsip

1. Ikatan ion

Pewarnaan bakteri didasarkan atas adanya ikatan ion antara komponen

seluler dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarnaan yang disebut

kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada

komponen seluler maupun pada pewarnaan. Berdsarkan adanya muatan ini

maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa.

2. Pewarnaan sederhana

Pewarnaan sederhana didasarkan pada zat warna yang digunakan hanya

terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut yang merupakan

suatu cara yang cepat untuk melihat morfologi bakteri secara umum.

3. Teknik aseptis

Teknik aseptis adalah proses tanpa kontaminasi untuk menjamin preparasi

bebas dari mikroba kontaminan. Teknik aseptic digunakan sepanjang

percobaan berlangsung baik alat, bahan, lingkungan sekitar maupun

praktikan. Untuk alat dan bahan dapat diterapkan metode sterilisasi.

III. Teori Dasar

Bakteri merupakan organisme prokariot. Umumnya ukuran bakteri sangat

kecil, bentuk tubuh bakteri baru dapat dilihat dengan menggunakan

mikroskop dengan pembesaran 1.000 X atau lebih (Waluyo, 2004).

Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan

sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana. Istilah

”pewarna sederhana” dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya

digunakan satu macam zat warna saja (Gupte, 1990).

Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana

karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat

warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin

(komponen kromoforiknya bermuatan positif) (Mirojiah, 2014).

Pada umumnya, olesan bakteri terwarnai mengungkapkan ukuran, bentuk,

susunan dan adanya struktur internal seperti spora dan butiran zat pewarna

khusus diperlukan untuk melihat bentuk kapsul ataupun flagella, dan hal-hal

terperinci tertentu di dalam sel. Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion

positif dan ion negatif, yang salah satu diantaranya berwarna (Volk dan

Whleer, 1998)

Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur

warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup.

Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan

asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat

yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri

tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies

(Dwidjoseputro, 1989).

Prinsip dasar dari pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara komponen

selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut

kromogen. Ikatan ion dapat terjadi karena adanya muatan listrik baik pada

komponen seluler maupun pada pewarna. Terdapat tiga mcam metode

pewarnaan yaitu pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial dan pewarnaan

gram. Pewarnaan sederhana menggunakan pewarna tunggal, pewarnaan

diferensial memakai serangkaian larutan pewarna atau reagen. Pewarnaan

gram merupakan metode pewarnaan yang paling umum digunakan untuk

mewarnai sel bakteri (Umsl, 2008).

Banyak senyawa organik berwarna (zat warna) digunakan untuk mewarnai

mikroorganisme untuk pemeriksaan mikroskopik dan telah dikembangkan

untuk:

- Mengamati dengan baik morfologi mikroorganisme secara kasar.

- Mengidentifikasi bagian-bagian struktural sel mikroorganisme.

- Membantu mengidentifikasi atau membedakan organisme yang serupa.

Langkah-langkah utama dalam persiapan spesimen untuk pemeriksaan

mikroskopik adalah: (Pelczar, 1986)

- Penempatan olesan atau lapisan spesimen pada kaca objek. Fiksasi olesan

pada kaca objek.

- Aplikasi pewarna tunggal (pewarnaan sederhana) atau serangkaian larutan

pewarna atau reagen (pewarnaan diferensial) (Pelczar, 1986)

Pewarnaan atau pengecatan terhadap mikroba, banyak dilakukan baik secara

langsung (bersama bahan yang ada) ataupun secara tidak langsung (melalui

biakan murni). Tujuan dari pewarnaan tersebut adalah pewarnaan untuk:

(Suriawiria, 1985)

- Mempermudah melihat bentuk jasad baik bakteri, ragi ataupun fungi.

- Memperjelas ukuran dan bentuk jasad

- Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalam jasad.

- Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik

dan kimia yang ada akan dapat diketahui (Suriawiria, 1985)

IV. Alat dan Bahan

1. Air suling dalam botol semprot

2. Alkohol

3. Bak Pewarna

4. Kaca Objek

5. Kertas Saring

6. Minyak Imersi

7. Mikroskop Majemuk

8. Ose

9. Pembakar Spirtus

10. Sampel air liur

11. Zat warna CGV dan metilen blue

V. Prosedur

Olesan bakteri dari air liur dibuat di atas kaca objek yang bersih dan

bebas lemak. Setelah dingin, preparat diletakkan di atas bak warna dan

digenangi dengan metilen blue, lalu didiamkan selama 2 menit. Lalu,

zat warna berlebih dituangkan dan preparat dibilas dengan air. Preparat

dikeringkan dengan kertas saring kemudian preparat ditetesi minyak

imersi dan diperiksa di bawah mikroskop dan digambarkan hasilnya.

Prosedur diulang dengan membuat preparat baru dengan sampel yang

sama dengan zat warna lain yaitu CGV.

VI. Hasil Pengamatan

VII. Pembahasan

Praktikum kali ini adalah menganai pewarnaan sederhana. Pewarnaan sederhana

adalah teknik pewarnaan sel bakteri di mana zat warna yang digunakan hanya satu

zat warna dan pewarnaan ini hanya terbatas untuk identifikasi morfologi bakteri

saja. Zat warna yang biasa digunakan dalam teknik pewarnaan sederhana ini

antara lain Carbol Gentian Violet, Safranin, metilen blue, fuchsin, dan masih

banyak zat warna lainnya.

Sampel yang digunakan untuk praktikum kali ini adalah sampel dari air liur

seorang praktikan yang menjadi relawan di tiap kelompok. Prosedur diawali

dengan mengambil kaca objek dalam desiinfektan dan membersihkannya dengan

alkohol untuk meyakinkan bahwa kaca objek telah benar – benar bersih dan bebas

dari lemak. Lemak yang mungkin ada pada kaca objek bisa dilarutkan dengan

alkohol. Tahapan dilanjutkan mengambil sampel air liur yang berada dalam

cawan petri dengan ose yang harus dipijarkan terlebih dahulu. Pemijaran ose

tersebut berfungsi untuk mensterilisasi ose agar bebas dari kontaminan..

Pengambilan sampel dengan ose dilakukan di dekat api, begitupun dengan

pembukaan cawan petri saat pengambilan sampel. Hal ini dimaksudkan agar tidak

ada kontaminan yang masuk ke dalam sampel karena akan mengganggu hasil

pengamatan. Setelah ose berpijar, ose didinginkan di dekat api lalu sampel

diambil dengan ose dan diusapkan pada kaca objek yang telah bersih dan bebas

dari lemak. Ose kembali dipijarkan pada api sebelum disimpan kembali agar ose

tetap dalam keadaan steril. Setelah berhasil membuat usapan, kaca objek dengan

bakteri yang berada di dalam air liur difiksasi dengan cara dilewatkan di atas api.

Hal ini dimaksudkan agar bakteri tetap melekat di tempatnya (di atas kaca objek)

walaupun akan ada proses pewarnaan ataupun pembersihan zat warna dengan

aquades. Proses fiksasi ini hanya sekedar melewatkan preparat di atas api, bukan

memanaskannya karena bakteri bisa mati jika suhu terlalu panas. Daerah usapan

ditandai agar kita tahu di mana letak daerah usapan bakteri yang kita buat.

Selanjutnya, kaca objek yang telah difiksasi ditetesi dengan zat warna di atas bak

pewarna agar zat warna yang berlebih nantinya dialirkan ke bak warna dan tidak

mengotori daerah kerja lainnya. Zat warna yang digunakan praktikan pertama kali

oleh praktikan adalah metilen blue. Metilen blue diteteskan di daerah usapan

bakteri lalu didiamkan selama 2 menit. Setelah sekitar 2 menit, zat warna berlebih

dibuang dan kaca objek kemudian dialiri aquades untuk membersihkan sisa zat

warna. Preparat kemudian dikeringkan dengan kertas saring secara perlahan agar

bakteri tidak kemudian menempel di kertas saring. Sesudah kering kemudian

preparat ditetesi dengan minyak imersi untuk memudahkan pengamatan pada

mikroskop majemuk. Preparat lalu diamati dengan mikroskop.

Praktikan menggunakan perbesaran 10x pada mikroskop dan menemukan bentuk

bakteri sebagai berikut:

Pewarnaan sederhana hanya menggunakan satu pewarna saja dan karena itu

pewarnaan sederhana hanya terbatas pada pengamatan morfologi bakteri, bukan

untuk mengidentifikasi bakteri secara spesifik. Perlu teknik pewarnaan diferensial

untuk mengindentifikasi bakteri secara spesifik.

Pada pengamatan, ditemukan bakteri berbentuk coccus dan sedikit berbentuk

batang. Praktikan tidak dapat menyimpulkan bakteri apa yang ditemukan dari

hasil pengamatan karena belum dipastikan apakah bakteri tersebut adalah bakteri

gram positif atau negatif, memiliki kapsul atau tidak.

Berikutnya, praktikan kembali membuat preparat dari sampel air liur yang sama

namun kali ini dengan zat warna yang berbeda. Kaca objek dibersihkan dengan air

dan kembali dibersihkan dengan alkohol untuk menghilangkan seluruh zat warna

beserta bakteri dan juga memastikan bahwa kaca objek sudah bebas dari lemak.

Sampel air liur kemudian diambil dengan ose yang telah lebih dahulu dipijarkan

dan didinginkan dekat api. Daerah apusan yang dbuat di kaca objek kemudian

ditandai agar kita tahu daerah pengamatan bakteri nantnya. Tahapan procedural

masih sama setelah itu, yaitu melewatkan preparat di atas api yang fungsinya

adalah melekatkan bakteri tanpa merusak struktur selnya. Kali ini zat warna yang

digunakan adalah Carbol Gentian Violet atau yang lebih dikenal dengan singkatan

CGV. Sama halnya dengan pewarnaan sebelumnya, zat warna ditetesi pada

daerah apusan dan didiamkan. Hanya saja, waktu untuk mendiamkannya lebih

singkat yaitu hanya 30 detik; lebih singkat dibandingkan dengan pewarnaan

menggunakan metilen blue. Sisa zat warna dibiarkan mengalir ke bak pewarna.

Preparat kemudian dialirkan aquades untuk menghilangkan sisa zat warna dan

dikeringkan menggunakan kertas saring secara perlahan. Preparat yang telah

kering kemudian ditetesi minyak imersi dan diamati di bawah mikroskop.

Pengamatan dilakukan masih dengan perbesaran 10x. Dengan pewarnaan

menggunakan Carbol Gentian Violet ini hanya ditemukan bakteri berbentuk

coccus saja, tidak ditemukan bakteri berbentuk basil seperti yang ditmukan pada

percobaan sebelumnya. Hal ini mungkin disebabkan karena faktor bakteri yang

tidak merata pada sampel air liur atau bakteri mungkin terbawa saat pencucian

dengan air. Faktor lain yang mungkin tidak memaksimalkan pengamatan bakteri

yang praktikan lakukan adalah kurang optimalnya fiksasi sehingga masih ada

bakteri yang belum lekat, ataupun zat warna yang masih berlebih sehingga

mempersulit praktikan untuk mengamati morfologi dari bakteri yang ada.

VIII. Simpulan

Praktikan mampu mengamati ukuran, bentuk dan struktur-struktur tertentu dari

bakteri, dengan menggunakan satu macam zat pewarna. Pewarna yang digunakan

adalah metilen blue untuk percobaan pertama dan CGV untuk percobaan kedua.

IX. Daftar Pustaka

Dwidjoseputro, D., 1989. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang : Djambatan.

Gupte. 1990. Teknik dan Metode Dasar Dalam Mikrobiologi. Malang : UMM

Press

Mirojiah, Mety. 2014. Pengecatan Mikroba: Pengecatan Sederhana, Gram, dan

Kapsul.http://mety-mirojiah-fst12.web.unair.ac.id/artikel_detail-91780-

Umum-Pengecatan-mikroba-pengecatan-sederhana,-gram-dan-kapsul.html.

Diakses pada tanggal 7 Maret 2015

Pelczar, M. W., 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi 1. Jakarta : UI Press

Suriawiria, U., 1985. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Jakarta : Gramedia

Umsl.2008. Staining Bacteria. www.umsl.edu/~microbes/pdf/stainingbacteria.pdf.

Diakses pada tanggal 7 Maret 2015

Volk & Wheeler. 1993. Mikrobiologi Dasar. Jakarta : Penerbit Erlangga

Waluyo, L . 2004 . Mikrobiologi Umum . Malang : Universitas Muhammadiyah

Malang Press

LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI

PEWARNAAN GRAM

Senin, 3 Maret 2015

Kelompok III

Senin, Pukul 13.00 – 16.00 WIB

Nama NPM

Sheila Pratiwi 260110130150

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS PADJADJARAN

2015

Nilai TTD

(Dhiya) (Emanuel) (Puspagita)

Pewarnaan Gram

I. Tujuan

1. Menganuti dua kelompok bakteri yaitu Gram positif dan Gram

negatif, dengan menggunakan prosedur pewarnaan Gram

2. Memahami setiap langkah dan reaksi-reaksi kimia yang terjadi

dalam prosedur tersebut.

II. Prinsip

1. Absorpsi

Absorpsi merupakan proses penyerapan suatu zat. Dalam hal ini

penyerapan yang dimaksud adalah kemampuan sel bakteri dalam

menyerap dan menjerap zat warna.

2. Pewarnaan Diferensial

Pewarnaan diferensial merupakan pewarnaan secara bertahap

dengan menggunakan pewarna tandingan untuk menentukan jenis

gram dari suatu bakteri.

3. Ikatan Ion

Pewarnaan bakteri didasarkan atas adanya ikatan ion antara

komponen seluler dari bakteri dengan senyawa aktif dari

pewarnaan yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena

adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada

pewarnaan. Berdsarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan

pewarna asam dan pewarna basa.

4. Teknik Aseptis

Teknik aseptis adalah proses tanpa kontaminasi untuk menjamin

preparasi bebas dari mikroba kontaminan. Teknik aseptic

digunakan sepanjang percobaan berlangsung baik alat, bahan,

lingkungan sekitar maupun praktikan. Untuk alat dan bahan dapat

diterapkan metode sterilisasi.

III. Teori Dasar

Sel bakteri memiliki panjang yang beragam, sel beberapa spesies dapat

berukuran 100 kali lebih panjang daripada sel spesies yang lain. Bakteri

merupakan makhluk hidup dengan ukuran antara 0,1 sampai 0,3 µm. Bentuk

bakteri bermacam – macam yaitu elips, bulat, batang dan spiral. Bakteri lebih

sering diamati dalam olesan terwarnai dengan suatu zat pewarna kimia agar

mudah diamati atau dilihat dengan jelas dalam hal ukuran, bentuk, susunan

dan keadaan struktur internal dan butiran. Sel sel individu bakteri dapat

berbentuk seperti bola/elips, batang (silindris), atau spiral (heliks) (Pelczar &

Chan, 2007).

Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana

karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat

warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin

(komponen kromoforiknya bermuatan positif) (Mirojiah, 2014).

Pewarnaan gram ditemukan pada tahun 1884 oleh seorang dokter kebangsaan

Denmark Christian Gram (membuat zat pewarna khusus) pewarna tersebut

merupakan pewarna differensial karena dapat membagi bakteri menjadi dua

kelompok fisiologi, yang akan memudahkan untuk identifikasi. Prosedur

pertama dari pewarnaan gram ini adalah memberi pewarna kristal violet,

setelah 1 menit dibilas dan kemudian akan diberikan pewarna yodium, setelah

satu menit dibilas dan kemudian akan diberi laputan alkohol 95% selama 30

detik, kemudian dibilas dan diberi pewarna safranin atau bismarck (untuk buta

warna merah) selama 1 menit. Zat pewarna kristal violet dan yodium akan

membentuk senyawa yang kompleks. Beberapa bakteri akan melepaskan zat

pewarna dengan mudah apabila dicuci dan beberapa bakteri yang lain zat

pewarna akan bertahan walaupun dicuci dengan alkohol 95%. Bakteri gram

positif akan terwarna ungu (kristal violet) dan bakteri gram negatif akan

terwarna merah (safranin) (Umsl, 2008).

Proses pewarnaan gram ini memerlukan 4 jenis reagen. Bakteri terbagi atas

dua kelompok berdasarkan pewarnaan ini, yaitu bakteri gram positif dan

bakteri gram negatif. Perbedaan ini berdasarkan warna yang dapat

dipertahankan bakteri. Reagen pertama disebut warna dasar, berupa pewarna

basa, jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas. Reagen kedua disebut

bahan pencuci warna (decolorizing agent). Tercuci tidaknya warna dasar

tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat

mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen

dinding sel tidak kuat mengikat warna dasar, maka warna akan tercuci.

Reagen terakhir adalah warna pembanding, bila warna tidak tercuci maka

warna pembanding akan terlihat, yang terlihat pada hasil akhir tetap warna

dasar. Larutan yang biasa dipakai adalah ungu kristal, lartan iodium, alkohol

dan safranin (Tracy, 2005).

Pewarnaan terhadap bakteri yang paling sering dilakukan adalah pewarnaan

Gram dan Ziehl‐Nelsen. Pewarnaan tersebut untuk mengetahui morfologi,

struktur, dan karakteristik bakteri. Pewarnaan Gram dapat mengidentifikasi

penyakit infeksi. Prosedur pewarnaan Gram dimulai dengan pemberian kristal

violet, setelah itu ditambahkan larutan iodium maka semua bakteri akan

berwarna biru. Setelah itu ditambah alkohol. Bakteri Gram positif membentuk

kompleks Kristal iodine yang berwarna biru. Setelah di tambahkan safranin,

bakteri Gram positif akan berwarna ungu. Contoh bakteri Gram positif adalah

Streptococcus, Bacillus, Stapilococcus, Clostridia, Corynebacterium

dhypteriae, Peptococcus, Peptostreptococcus, dll. Sedangkan bakteri Gram

negatif akan terdekolorisasi oleh alcohol dan pemberian safranin akan

memberikan warna merah pada bakteri Gram negatif. Contoh bakteri Gram

negative adalah Neisseria, Klebesiella, Vellonella, Shigella, Salmonella,

Hemophillus, dll (Cappuccino & Sherman, 1983).

Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur

warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup.

Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan

asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat

yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri

tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies

(Dwidjoseputro, 1989).

Prinsip dasar dari pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara komponen

selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut

kromogen. Ikatan ion dapat terjadi karena adanya muatan listrik baik pada

komponen seluler maupun pada pewarna. Terdapat tiga mcam metode

pewarnaan yaitu pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial dan pewarnaan

gram. Pewarnaan sederhana menggunakan pewarna tunggal, pewarnaan

diferensial memakai serangkaian larutan pewarna atau reagen. Pewarnaan

gram merupakan metode pewarnaan yang paling umum digunakan untuk

mewarnai sel bakteri (Umsl, 2008).

IV. Alat dan Bahan

1. Air suling dalam botol semprot

2. Alkohol

3. Bak Pewarna

4. Bakteri E.coli dan S. aureus

5. Kaca Objek

6. Kertas Saring

7. Minyak Imersi

8. Mikroskop Majemuk

9. Ose

10. Pembakar Spirtus

11. Sampel air liur

12. Zat warna CGV, lugol, dan fuchsin

V. Prosedur

Kaca objek bersih disiapkan dan dibuat olesan bakteri yang telah

disiapkan. Kaca objek lalu diletakkan di atas rak kawat di atas bak

pewarna dan digenangi Carbol Gentian Violet selama kurang lebih

satu menit lalu zat warna berlebih dibuang dan dibilas dengan air

suling. Olesan bakteri kembalii digenangi lugol selama 2 menit lalu zat

warna berlebih dibuang dan dibilas kembali dengan air suling. Olesan

kemudian dicuci dengan alkohol sampai zat warna larut lalu dibilas

dengan air suling. Olesan kemudian digenangi dengan pewarna

tandingan fuksin selama 30 detik dan zat warna berlebih dibuang,

dibilas dengan air suling. Preparat dikeringkan dengan kertas saring

dan ditetesi sedikit minyak imersi lalu diperiksa di bawah mikroskop

VI. Hasil Pengamatan

VII. Pembahasan

Praktikum kali ini adalah menganai pewarnaan gram. Pewarnaan gram adalah

teknik pewarnaan sel bakteri di mana lebih dari satu zat warna yang digunakan.

Teknik pewarnaan ini dapat mengidentifikasi morfologi dan jenis gram dari suatu

bakteri. Zat warna yang biasa digunakan dalam teknik pewarnaan sederhana ini

antara lain Carbol Gentian Violet yang dikomplekskan dengan lugol dan fuchsin

atau safranin sebagai zat warna tandingan.

Sampel yang digunakan untuk praktikum kali ini adalah sampel bakteri

Escherichia coli dan Staphylococcus aureus. Prosedur diawali dengan mengambil

kaca objek dalam desinfektan dan membersihkannya dengan alkohol untuk

meyakinkan bahwa kaca objek telah benar – benar bersih dan bebas dari lemak.

Lemak yang mungkin ada pada kaca objek bisa dilarutkan dengan alkohol.

Tahapan dilanjutkan mengambil sampel yang berada dalam tabung reaksi dengan

ose yang harus dipijarkan terlebih dahulu. Pemijaran ose tersebut berfungsi untuk

mensterilisasi ose agar bebas dari kontaminan. Pengambilan sampel dengan ose

dilakukan di dekat api, begitupun dengan pembukaan tabung reaksi saat

pengambilan sampel. Hal ini dimaksudkan agar tidak ada kontaminan yang masuk

ke dalam sampel karena akan mengganggu hasil pengamatan. Setelah ose berpijar,

ose didinginkan di dekat api lalu sampel diambil dengan ose dan diusapkan pada

kaca objek yang telah bersih dan bebas dari lemak. Ose kembali dipijarkan pada

api sebelum disimpan kembali agar ose tetap dalam keadaan steril. Setelah

berhasil membuat usapan, kaca objek dengan bakteri difiksasi dengan cara

dilewatkan di atas api. Hal ini dimaksudkan agar bakteri tetap melekat di

tempatnya (di atas kaca objek) walaupun akan ada proses pewarnaan ataupun

pembersihan zat warna dengan aquades. Proses fiksasi ini hanya sekedar

melewatkan preparat di atas api, bukan memanaskannya karena bakteri bisa mati

jika suhu terlalu panas. Daerah usapan ditandai agar kita tahu di mana letak

daerah usapan bakteri yang kita buat.

Selanjutnya, kaca objek yang telah difiksasi ditetesi dengan zat warna di atas bak

pewarna agar zat warna yang berlebih nantinya dialirkan ke bak warna dan tidak

mengotori daerah kerja lainnya. Zat warna yang digunakan praktikan pertama kali

oleh praktikan adalah Crystal Gentian Violet atau yang lebih dikenal dengan

sebutan CGV. CGV sebagai zat warna dasar diteteskan di daerah usapan bakteri

lalu didiamkan selama 1 menit. Setelah sekitar 1 menit, zat warna berlebih

dibuang dan kaca objek kemudian dialiri aquades untuk membersihkan sisa zat

warna. Kemudian preparat ditetesi dengan lugol sebagai zat pemantek atau

mordant dan didiamkan sekitar 2 menit. Setelah itu akan ditambahkan alkohol

sebagai decolorizing agent. Dalam tahapan ini, bakteri gram positif akan

mengalami denaturasi selama pemberian alkohol. Hal ini akan mengecilkan

pori‐pori sehingga menghasilkan kompleks kristal iodium dari CGV dan lugol.

Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang kuat dan lapisan peptidoglikan

sebanyak 30 lapisan sehingga permeabilitas dinding selnya menjadi berkurang.

Teori Salton menjelaskan bahwa ada konsentrasi lipid yang tinggi pada dinding

sel bakteri gram negatif. Sehingga jika lipid dilarutkan dalam pemberian alkohol,

maka pori‐pori akan membesar dan tidak mengikat pewarna. Hal ini menyebabkan

bakteri gram negatif menjadi tidak berwarna dalam tahap ini. Bakteri gram negatif

hanya memiliki 1‐2 lapisan peptidoglikan sehingga memiliki permeabilitas

dinding sel yang lebih besar.

Setelah pencucian dengan alkohol, preparat digenangi zat warna pembanding

yaitu fuchsin. Seperti yang telah dijelaskan sebelumnya, karena pada saat

dekolorisasi pori-pori sel bakteri gram negatif terbuka dan zat warna pertama telah

luntur, zat warna pembanding akan masuk dan mewarnai sel bakteri gram negatif

sehingga bakteri yang tadinya sempat berwarna biru akan tergantikan dengan

warna kemerahan (sesuai dengan warna fuchsin). Sel bakteri gram positif

mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan

bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek.

Preparat kemudian dibilas dengan aquades lalu diamati dengan mikroskop.

Praktikan menggunakan perbesaran 10x pada mikroskop dan menemukan bentuk

bakteri sebagai berikut:

Pada pengamatan, ditemukan bakteri berbentuk coccus dan sedikit berbentuk

batang. Bakteri yang berbentuk coccus berwarna biru yang dapat disimpulkan

bahwa bakteri tersebut adalah bakteri gram positif dan praktikan memperkirakan

bahwa bakteri tersebut adalah bakteri Staphylococcus aureus. Sedangkan untuk

bakteri yang berbentuk basil/batang, praktikan menemukan bakteri batang yang

terwarnai dengan zat warna tandingan yaitu fuchsin yang menandakan bahwa

bakteri tersebut merupakan bakteri gram negatif. Praktikan menyimpulkan bahwa

bakteri gram negatif tersebut adalah Escherichia coli.

Kemungkinan adanya kesalahan dalam pengamatan gram bakteri ini disebabkan

oleh fiksasi yang berlebihan yang mungkin bisa memecahkan dinding sel gram

positif sehingga melepaskan pewarna primer dan menerima pewarna tandingan,

atau mungkin pencucian menggunakan aquades yang terlalu deras dapat

menghilangkan warna yang seharusnya menjadi ciri untuk identifikasi bakteri.

VIII. Simpulan

1. Praktikan mampu menganuti dua kelompok bakteri yaitu Gram positif dan

Gram negatif, dengan menggunakan prosedur pewarnaan Gram

2. Praktikan mampu memahami setiap langkah dan reaksi-reaksi kimia yang

terjadi dalam prosedur tersebut

Daftar Pustaka

Cappuccino, J. G. & Natalie. S. 1983. Microbiology A Laboratory Manual. New

York : Addison Wesley Publishing Company

Dwidjoseputro, D., 1989. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang : Djambatan.

Mirojiah, Mety. 2014. Pengecatan Mikroba: Pengecatan Sederhana, Gram, dan

Kapsul.http://mety-mirojiah-fst12.web.unair.ac.id/artikel_detail-91780-

Umum-Pengecatan-mikroba-pengecatan-sederhana,-gram-dan-kapsul.html.

Diakses pada tanggal 7 Maret 2015

Pelczar, M. J., Chan, E.C.S. 2007. Elements of Microbiology. New York : Mc

Graw Hill Book Company

Tracy.2005.GramStaining.www.tracy.k12.ca.us/thsadvbio/pdfs/gram%20stain.pdf

. Diakses pada tanggal 7 Maret 2015

Umsl.2008. Staining Bacteria. www.umsl.edu/~microbes/pdf/stainingbacteria.pdf.

Diakses pada tanggal 7 Maret 2015