Post on 22-Jan-2023
PEMERIKSAAN
“Vibrio cholerae”Disusun untuk memenuhi tugas Mata Kuliah Laboratorium
Epidemiologi
Dosen pengampu : drg. Yunita Dyah Puspita Santik
Disusun Oleh :
KELOMPOK 8
1. Luluk Listiarini Riza (6411411198)
2. Ellya Ma’unah (6411411199)
3. Charisna Neilal Muna (6411411201)
4. Sundari Sukoco (6411411210)
5. Hamid Rifki Baharun (6411411257)
Rombel 01
JURUSAN ILMU KESEHATAN MASYARAKAT
FAKULTAS ILMU KEOLAHRAGAAN
UNIVERSITAS NEGERI SEMARANG
2014
Pemeriksaan Vibrio cholerae
Gambar Bakteri Vibrio Cholerae
Vibrio cholerae merupakan salah satu spesies dari
genus Vibrio yang merupakan famili Vibrionaceae. Genus
Vibrio terdiri lebih dari 30 spesiesyang biasanya
ditemukan pada lingkungan perairan. Vibrio yang
pathogen terhadap manusia adalah Vibrio cholerae,
Vibrio parahaemolyticus dan Vibrio vulnificus. Vibrio
cholerae merupakan penyebab penyakit Cholera yaitu
infeksi saluran usus yang bersifat akut dan disebabkan
oleh bakteri Vibrio cholerae. Bakteri ini masuk kedalam
tubuh host secara per oral umumnya melalui makanan atau
minuman yang tercemar. Cholera dapat menular sebagai
penyakit yang bersifat epidemik.
1. Tujuan
Prosedur ini digunakan untuk melakukan Pengujian
Vibrio cholerae pada produk perikanan dan produk makanan
yang berkaitan dengan hasil – hasil perikanan.
2. Acuan
Standar Nasional Indonesia (SNI) 01-2332.4-2006
3. Media dan Reagensia :
a.Alkaline Peptone water (APW)
b.Alkaline Peptone salt (APS)
c.Decarboxylase basal medium dengan penambahan suplemen
arginine, lysine dan ornithine secara individual
d.Kliger Iron Agar ( KIA)
e.Motility Test Medium (MTM), semisolid
f.MRV-VP Broth
g.Purple Broth Base (PBB) dengan penambahan suplemen
sucrose, lactose, cellobiose, arabinose, D-mannitol, D-mannose
secara individual
h.Of medium semisolid dengan penambahan suplemen glucose,
sucrose, lactose, cellobiose, arabinose, D-mannitol, D-mannose
secara individual
i.Triple Sugar Iron (TSI) agar
j.Thiosulfate-citrat-Bile-Salt-Sucrose (TCBS) agar
k.Trypticase (tryptic) Soy Broth (TSB)
l.Trypticase (tryptic) Soy Agar (TSA)
m.Tryptone Broth and Tryptone salt Broths (T1N0, T1N1, T1N3,
T1N6, T1N8, T1N10)
n.Urea Broth
o.Pereaksi Kovacs
p.Mineral atau parafin oil steril
q.O/129 (2,4-diamino-6,7-diisopropyl pteridine) disk, 10 µg
dan 150 µg
r.ONPG disk
s.Pereaksi oksidase
t.HCL 1 N
u.Physiological saline 0,85%
v.Phospate-buffered Saline (PBS)
w.NaCl 2 % dan 3 %
x.Larutan NaOH 1 N
y.Pereaksi VP
z.Pereaksi pewarnaan gram
aa. Baku pembanding Vibrio cholerae
bb. Anti serum Poly hikojima inaba – ogawa
4. Peralatan
a. Blender beserta jar yang dapat disterilisasi atau
stomacher beserta plastik steril.
b. Cawan petri ukuran 15 mm x 100 mm
c. Tabung reaksi ukuran 16 mm x 125 mm dan 13 mm x
100 mm
d. Tabung bertutup ukuran 16 mm x 150 mm
e. Timbangan analitik dengan ketelitian 0,01 g dan
0,0001 g
f. Inkubator 36 °C ± 1 °C
g. Waterbath 42 °C ± 0,2 °C
h. Autoclave 121 °C.
i. Jarum inokulasi dan jarum ose
j. Bunsen
k. pH meter
l. Peralatan sterilisasi filter
m. Oven
n. Pipet atau pippetor 1 ml, 5 ml dan 10 ml.
o. Mikroskop
p. Hot plate dilengkapi dengan magnetic stirer.
q. Alat pengocok (Voltex mixer )
No Nama Alat Gambar
1. Tabung reaksi
6. Jarum ose
7. Mikroskop
5. Kondisi Pengujian
Selama melakukan pengujian, terapkan teknis aseptis
dan lakukan pengujian diruang atau laminar air flow yang
terkontrol. Media TCBS agar yang digunakan harus
dalam keadaan kering.
6. Pengambilan contoh
a.Ikan Jaringan daging, saluran pencernaan dan
insang.
b.Crustacea Jika memungkinkan seluruh tubuh atau
hanya bagian tengah termasuk insang dan saluran
pencernaan.
c.Kekerangan Daging kerang termasuk cairan dalam
cangkang.
7. Prosedur
7.1 Persiapan contoh
a. Produk perikanan selain kekerangan.
Timbang secara aseptis 25 g sesuai butir
7.2.2.1 dan 7.2.2.2., kemudian tambahkan 225 ml
larutan Alkaline Pepton Water, Homogenasi selama 2
menit – 3 menit. Homogenat ini merupakan larutan
dengan pengenceran 1 : 10.
b. Produk kekerangan
Timbang secara aseptis 50 g sesuai butir
7.2.2.3., kemudian tambahkan 450 ml larutan
Alkaline Pepton Water, Homogenasi selama 2 menit – 3
menit. Homogenat ini merupakan larutan dengan
pengenceran 1 : 10.
7.2 Isolasi Vibrio cholerae
a.Tanpa mengocok tabung
Ambil 1 ose dari setiap tabung yang positif
(keruh) pada setiap pengenceran sedalam 1 cm
dari permukaan cairan dan goreskan kedalam TCBS
agar. Inkubasikan TCBS agar pada suhu 36 oC ± 1oC selama 18 jam – 24 jam.
b.Amati keberadaan Vibrio cholerae pada TCBS agar.
Koloni Vibrio cholerae besar, permukaan halus. Agak
datar, bagian tengah uram dan bagian pinggir
terang, berwarna kuning (sukrosa positif).
Gambar Koloni Vibrio cholerae pada media TCBS
7.3 Pemurnian
Secara hati – hati ambil 3 koloni terduga atau
lebih dari setiap TCBS agar, goreskan kedalam T1N1
agar atau TSA + 1,5 % NaCl (Total Mengandung NaCl
2 %). Inkubasikan selama 18 jam – 24 jam pada
suhu 36 oC ± 1 oC.
Gambar Media TSA slant
7.4 Uji biokimia pendahuluan
a.Uji Oksidase
Goreskan 1 ose dari T1N1 agar atau TSA + NaCl
1,5 % atau medium lain yang tidak
memfermentasikan karbohidrat kedalam cawan
petri yang berisi TSA agar. Inkubasikan pada
suhu 36 oC ± 1 oC selama 18 jam – 24 jam.
Teteskan 2 – 3 tetes pereaksi oksidase pada
koloni bakteri dan amati reaksinya. Reaksi
positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna
biru tua pada koloni. Uji oksidase dapat
dilakukan dengan menggunakan kertas oksidase
dengan cara menggoreskan koloni dari T1N1 agar
atau TSA + NaCl 1,5 % keatas permukaan kertas
oksidase menggunakan tusuk gigi (jangan
menggunakan ose yang terbuat dari nikel atau
krom). Reaksi positif ditunjukkan dengan
terbentuknya warna biru tua secara cepat.
b.Uji sensitifitas terhadap 0/129 vibriostat
Goreskan 1 ose dengan cepat dari T1N1 agar atau
TSA + NaCl 1,5 % kedalam cawan Petri yang
berisi TSA dengan rapat. Letakkan disk 0/129 10
µg dan 150 µg pada goresan yang paling rapat
dan inkubasikan pada suhu 36 oC ± 1 oC selama 18
jam – 24 jam. Amati pertumbuhan disekitar disk .
Reaksi sensitif ditunjukkan dengan terbentuknya
zona disekitar disk (S), sedangkan reaksi
resisten ditandai dengan adanya pertumbuhan
disekeliling disk (R). Vibrio cholerae sensitive
terhadap 0/129 µg dan 150 µg.
Gambar Uji sensitifitas
c.Triple Sugar Iron (TSI) Agar dan Kligger Iron Agar
(KIA)
Inokulasikan koloni dari T1N1 agar atau TSA +
NaCl 1,5 % dengan cara menggoreskan agar miring
dan menusuk agar tegak media TSI agar dan KIA.
Inkubasikan pada suhu 36 oC ± 1 oC selama 18 jam
– 24 jam. Vibrio cholerae menghasilkan asam (warna
kuning) pada agar miring, asam (warna kuning)
pada agar tegak dan tidak mengasilkan gas serta
H2S. Reaksi Vibrio spp dalam beberapa media agar
miring yang berbeda dapat dilihat pada tabel 1.
Reaksi Vibrio cholera: TSI (Asam/Asam=A/A) dan
KIA (Alkaline/Asam=K/A)
(Asam=kuning & Alkaline=merah)
Tabel 1. Reaksi Vibrio spp dalam beberapa media
agar yang berbeda
Bakteri KIA TSI
Agar
Miring
Agar
Tegak
Agar
Miring
Agar
Tegak
v. cholerae K AA (K
jarang)A
v. mimicus K AK (A
jarang)A
v.
parahaemolyti
K A K A
cus
v.
alginolytusK A A A
v. vulnificusK atau
AA
K (A
jarang)A
a.hidrophillaK atau
AA K atau A A
p.shigoleidesK atau
AA K atau A A
d.Uji ONPG
Untuk uji ONPG gunakan kultur dari TSI atau
media lain yang mengandung lactose. Inokulasikan 1
ose kultur dari TSI kedalam tabung yang berisi
0,5 ml larutan psysiological saline. Masukkan disk ONPG
lalu inkubasikan pada suhu 36 oC ± 1 oC selama
20 menit sampai dengan 1 jam. Reaksi positif
ditunjukkan dengan terbentuknya warna kuning
pada media dalam tabung.
Reaksi ONPG negatif (kiri) dan Positif (kanan)
e.Uji Oksidatif – fermentatif ( OF )
Inokulasikan 2 tabung kedalam media OF yang
telah ditambahkan glukosa 1 % dengan kultur
dari T1N1 agar atau TSA + NaCl 1,5 % tambahkan
mineral oil steril setinggi 1 cm – 2 cm kedalam
salah satu tabung. Inkubasikan pada suhu 36 oC
± 1 oC selama 1 hari – 2 hari. Reaksi oksidatif
ditunjukkan dengan terbentuknya warna kunimg
(reaksi asam) pada tabung yang tidak
ditambahkan dengan mineral oil, sedangkan
reaksi fermentative ditunjukkan dengan
terbentuknya warna kuning pada tabung yang
ditambahkan mineral oil. Asam mengubah media
dari warna hijau menjadi kuning.
Uji OF: 2 tabung kiri positif (kuning) dan 2
tabung kanan negatif (hijau)
f.Pewarnaan gram
Lanjutan pengujian apabila pada uji biokimia
pendahuluan diatas ditemukan reaksi Vibrio cholerae
. Kultur diambil agar miring atau TSA miring +
NaCl 1,5 % yang telah diinkubasi selama 24 jam.
Bakteri Vibrio cholerae termasuk gram – negatif,
berbentuk batang pendek atau koma.
7.5 Uji Biokimia Lanjutan
Lanjutkan pengujian apabila pada uji biokimia
pendahuluan diatas ditemukan reaksi Vibrio cholerae
yang khas. Goreskan kembali kultur dari T1N1 agar
atau TSA + NaCl 1,5 % ke TSA dan TSB. Inkubasikan
pada suhu 36 oC ± 1 oC selama 18 jam – 24 jam.
a. Uji Hidrolisis Urea.
Inokulasikan 1 ose dari TSA + NaCl 1,5 %
kedalam media urea. Inkubasikan pada suhu 36 oC
± 1 oC selama 18 jam. Reaksi positif
ditunjukkan dengan perubahan warna media dari
orange menjadi merah muda. Vibrio cholerae tidak
mempunyai kemampuan dalam menghidrolisis urea
(reaksi negatif).
Urea broth (negatif)
b. Uji Arginin dihydrolase, Lysin dekarboksilase dan
ornithin dekarboksilase.
Inokulasikan kultur dari TSA + NaCl 1,5 %
kedalam tabung media dasar dekarboksilase yang
masing – masing mengandung arginin, Lysine,
ornithin serta kedalam 1 tabung kontrol media
dasar dekarboksilase yang tidak mengandung asam
amino. Tambahkan masing – masing tabung dengan
mineral oil steril setinggi 1 cm – 2 cm.
Inkubasikan pada suhu 36 oC ± 1 oC selama 4
hari. Lakukan pengamatan setiap hari. Reaksi
dekarboksilase terhadap asam amino menghasilkan pH
alkaline dan mengubah media menjadi ungu cerah
(reaksi positif). Sedangkan reaksi fermentasi
glucose menghasilkan asam dan mengubah media
menjadi warna kuning (reaksi negatif). Tabung
control yang tidak mengandung asam amino
berubah menjadi kuning Vibrio cholerae menghasilkan
reaksi arginin dihydrolase negative, Lysine dan
ornithin positif dan orithin decarboxylase
positif.
Dari Kiri ke Kanan: Arginine(-), Lysine(+),
Ornithin(+), Sucrose(+), Lactose(-),
Arabinose(-), Mannose(-) , Mannitol(+)
c. Uji Toleransi terhadap garam
Inokulasikan kultur dari TSB kedalam 3 tabung
yang masing – masing mengandung tryptone broth
1 % yang ditambahkan NaCl 0 % ; 1 % dan 3 %
(T1N0,T1N3). Inkubasikan pada suhu 36 oC ± 1 oC
selama 18 jam – 24 jam. Reaksi positif ditandai
dengan terjadinya keruhan yang menunjukkan
pertumbuhan. Vibrio cholerae dalam media T1N0
dan T1N3 (table 2).
d. Uji pertumbuhan pada suhu 42 oC
Inokulasikan 1 ose dari TSB yang telah
diinkubasikan selama 24 jam kedalam TSB yang
telah dihangatkan dalam waterbath 42 oC.
Inkubasikan pada suhu 42 oC dalam waterbath
selama 24 jam. Reaksi positif ditandai dengan
terjadinya kekeruhan yang menunjukkan adanya
pertumbuhan. Vibrio cholerae mengasilkan reaksi
variable.
e. Uji voges-proskauer
Inokulasikan 1 ose dari TSA+ NaCl 1,5 % kedalam
MRV – VP broth inkubasikan pada suhu 36 oC ± 1oC selama 2 hari. Pindahkan 1 ml dari setiap
MRV – VP broth yang menunjukkan pertumbuhan
kedalam tabung reaksi ukuran 13 mm x 100 mm
steril. Tambahkan 0,6 ml larutan alphanaphtol
dan 0,2 ml KOH 40 % lalu kocok. Tambahkan
sedikit kristal keratin untuk mempercepat
reaksi. Kocok kembali dan diamkan selama 2 jam.
Reaksi positif ditandai dengan terbentuknya
warna merah muda sampai warna merah mirah
delima (ruby) pada media Vibrio cholerae
menghasilkan reaksi variable.
f. Uji Fermentasi karbohidarat
Inokulasikan 1 ose dari TSA+ NaCl 1,5 % kedalam
masing – masing satu tabung purple broth base yang
mengandung sucrose, lactose, D-mannitol, mannose,
arabinosa atau cellobiose. Tambahkan masing – masing
tabung dengan mineral oil steril setinggi 1 cm
– 2 cm. inkubasikan pada suhu 36 oC ± 1 oC
selama 4 hari – 5 hari dan lakukan pengamatan
setia hari. Reaksi positif fermentasi
karbohidrat menghasilkan asam dan mengubah
media menjadi kuning ( table 2).
7.6 Uji Serologi
Ambil 1 ose kultur dari T1N1 agar atau TSA+ NaCl
1,5 % yang telah diinkubasikan selama 16 jam – 24
jam dan letakkan diatas gelas preparat. Tetesi
dengan larutan saline 0,85 % dan emulsikan.
Letakkan 1 tetes antiserum poly hikojima inaba – ogawa
disamping suspensi koloni.
Campurkan antiserum sedikit demi sedikit dengan
suspensi koloni sampai tercampur sempurna.
Lakukan kontrol dengan menggunakan larutan saline
dan antiserum.
Goyangkan campuran tersebut kekiri dan kekanan
dan amati reaksi penggumpalan pada latar belakang
yang gelap sebagai berikut :
Positif apabila terjadi penggumpalan pada larutan
kultur dan tidak terjadi penggumpalan pada
larutan control.
Negatif apabila tidak terjadi penggumpulan baik
pada larutan kultur maupun larutan control.
8. Interpretasi Hasil
No Jenis Uji Interpretasi Hasil
1 Morfologi Gram – negatif, bentuk batangatau koma
2 TSI Agar miring: asam (kuning)Agar tegak: asam (kuning)
3Oksidatif /fermentatif (mediaOF)
Oksidatif positif danfermentatif positif
4 Oksidase Positif
5 ArgininDehidrolase Negatif
6 LysineDecarboxylase Positif
7 VP Variabel
8 Pertumbuhan padasuhu 42oC Positif
9 Halophilik T1N0; positif; T1N3; positif,T1N6; negatif
10 Fermentasi Sucrose Positif
11 FermentasiArabinose Negatif
12 ONPG Positif
13 Sensitifitasterhadap 0/129
Sensitif (S) terhadap 10 µgdan 150 µg
9. Pelaporan Hasil
Laporkan ada atau tidak Vibrio cholerae berdasarkan uji
biokimia dan serologi.
DAFTAR PUSTAKA
Brooks GF dkk. 1996. Mikrobiologi Kedokteran. Edisi 20. EGC
Chin J.2006. Manual Pemberantasan Penyakit Menular. Edisi17. Infomedika
Shulman ST dkk. 1994. Dasar Biologis & Klinis Penyakit Infeksi.Edisi 4. Gadjah Mada University Press
Staff pengajar FK UI. 1993. Mikrobiologi Kedokteran.Binarupa Aksara
http://elib.fk.uwks.ac.id/asset/archieve/jurnal/Vol%20Edisi%20Khusus%20Desember%202010/CHOLERA.pdf
http://www.cdc.gov/cholera/pdf/laboratory-methods-for-the-diagnosis-of-vibrio-cholerae-chapter-6.pdf
http://repository.usu.ac.id/bitstream/123456789/3576/1/05010682.pdf