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Farmacologia IRelatório da Aula Laboratorial
Avaliação de compostos comacção analgésica, anti-
inflamatória ecorticosteróide
Carla Oliveira Elsa Sousa Mariana Gonçalves Rui Liceia
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Coimbra
24 de Novembro de 2014
A dor é o sintoma que com maior frequência leva o paciente a
procurar o médico. Por vezes, é difícil aniquilar a sua causa patológica
o que impõe que se recorra a medidas terapêuticas que apenas visam
reduzir este sintoma. Os medicamentos que diminuem a dor pertencem a
vários grupos: os anestésicos gerais, os anestésicos locais e os
analgésicos. Iremos no entanto abordar apenas os analgésicos de acção
local e central.
Analgésicos centrais Os fármacos analgésicos de ação central caracterizados por
propriedade analgésica potente, efeito tranquilizante (sedativo) e
hipnótico, actuam inibindo os estímulos nervosos que chegam ao sistema
nervoso central. Essa inibição é dada quando o analgésico atinge o
centro modulador da dor diminuindo a perceção da sensação dolorosa
através da estimulação dos recetores opiáceos centrais. Agem portanto
a nível do SNC e destacam-se pela intensa analgesia associada à
depressão da consciência e das funções neurovegetativas. Por provocarem
o seu efeito por este mecanismo, estes fármacos designam-se opiáceos,
quando de origem natural, e opióides, quando de origem sintética ou
semissintética. A grande referência do grupo dos analgésicos centrais é
a morfina, alcaloide do ópio extraído de Papaver somniferu.
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Até o momento foram descritos os seguintes recetores opióides: μ
(MOP), κ (KOP), δ (DOP), σ (sigma) e (elipson) e estudos recentes
demonstraram que estes se encontram localizados na superfície das
membranas celulares, assumindo uma configuração transmembranar. Estes
recetores estão acoplados a um nucleotídeo guanílico ligado a uma
proteína reguladora, a proteína G, que medeia os efeitos celulares.
Efeitos mediados por activação dos diferentes tipos de receptoresopióides
DOP KOP MOP
· Analgesia por acção supramedular· Analgesia por acção medular· Dependência· Obstipação· Depressão respiratória
· Analgesia por acção medular· É controversa a existênciade efeitosanalgésicos por acção supramedular· Não parecem mediar efeitosde reforço em animais de experiênciae podem causar disforia em sereshumanos· Obstipação· Diurese por inibição da libertação da hormona antidiurética
· Analgesia por acçãosupramedular· Analgesia por acçãomedular· Depressão respiratória· Dependência· Obstipação
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A morfina estimula os recetores opiáceos por ser um agonista
exógeno preferencial dos recetores µ (MOP) e tem elevada afinidade para
os recetores κ (KOP) e δ (DOP), daí o seu amplo espectro de atividade
associado à distribuição destes recetores por todo o SNC, tecidos
periféricos e sistema imunitário. Os recetores opiáceos estimulados pela
morfina podem ser inibitórios e excitatórios, sendo que no Homem
predominam os primeiros.
Os recetores opióides, acoplados à proteína G, inibem a
adenilciclase, reduzindo assim o conteúdo intracelular de cAMP. Além
disso, facilitam a abertura dos canais de K+ (causando hiperpolarização)
e inibem a abertura dos canais de Ca2+ regulados pela voltagem (inibindo
a ação de transmissores). Esses efeitos sobre a membrana reduzem tanto a
excitabilidade neuronal quanto a libertação de transmissores (devido à
inibição da entrada de cálcio).
Inferimos assim que o efeito final da morfina ao nível cerebral é
sobretudo depressor e as suas ações centrais mais importantes são a
analgesia, a sedação, a depressão respiratória e a dependência.
Efeitos adversos
A morfina, por estimulação dos recetores μ, tem a capacidade de
desencadear dependência física. Esta dependência acontece com o uso não
médico ou com o uso em doses superiores às analgésicas mínimas
necessárias, porque quando se consome morfina, o cérebro deixa de
sintetizar os seus próprios opiáceos endógenos (endorfinas e
encefalinas), passando a morfina a assumir o papel destes. Existe também
dependência psíquica, isto é, desejo compulsivo e necessidade contínua
de tomar morfina, para que o indivíduo se sinta bem e normal. Outro
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efeito relevante é a depressão respiratória, detetável mesmo em doses
sub-analgésicas de morfina em indivíduos sãos e resulta de um efeito
direto sobre o centro respiratório bulbar, que se torna menos sensível a
estimulações fisiológicas. Em intoxicações agudas (overdose), constitui
a principal causa de morte.
A nível cardiovascular, causa hipotensão arterial, por
vasodilatação periférica, que é provocada pela histamina endógena
libertada. A nível gastrointestinal, diminui a motilidade gástrica e
provoca obstipação, como resultado do seu efeito direto sobre o músculo
liso do intestino.
Devido as suas limitações houve necessidade de encontrar
analgésicos centrais com eficácia semelhante à morfina mas com menos
efeitos secundários. Por isso, têm sido produzidos elevado número de
analgésicos centrais de origem sintética (os principais são a
buprenorfina, fentanil, metadona, tramadol, sufentanil, meperidina,
entre outros) ou de origem semissintética (diacetilmorfina ou heroína,
di-hidrocodeína, oximorfona).
Componente Laboratorial
Para avaliar se um fármaco tem ou não actividade Analgésica Central
temos de criar um modelo de dor e experimentar se depois da
administração do farmaco os animais deixam de ter dor. Dependendo do
tipo de estimulo poderemos classificar a dor como central ou periférica.
A Dor Periférica é associada a um processo inflamatório e a Dor
Central associada a estímulos térmicos.
Assim com base nestes mesmos princípios podemos criar o nosso modelo
de dor: colocamos um ratinho numa placa quente e cronometramos o tempo
que demora a que ele retire as patas da superfície da placa (reflexo de
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flexão), depois administraremos via perionial a dose de morfina e
repetiremos a experiência.
No nosso modelo, cada modelo animal servirá de controlo de si mesmo,
ou seja, o que iremos analisar é diferença entre os tempos cronometrados
com e sem a administração de Morfina em cada um dos ratos.
Como se trata de um interesse meramente pedagógico iremos apenas
administrar Morfina nos nossos modelos para que possamos compreender o
que é expectável nas experiências com novos fármacos. Em contexto de
investigação ainda existiria outra parte da experiência em que seria
cronometrado o tempo antes e depois de ser administrado o fármaco em
estudo e até mesmo repetir o procedimento mas com outra dose diferente.
Por intermédio de manipulação estatística permitia-nos inferir se o
fármaco tem ou não mais potencial analgésico que a Morfina, analgésico
centrar referenciado, de efeito conhecido, funcionando assim como
controlo positivo no nosso modelo.
Utilizamos a dose de morfina de 10 mg/kg(massa do rato).
De modo a não causar danos nos animais estipulámos que o tempo
máximo de exposição ao estimulo térmico seria de 30s, caso este tempo
seja atingido o animal terá de ser retirado de imediato e o seu valor
estatístico não será válido.
Na Tabela 1 encontram-se registados os tempos cronometrados em cada
um dos oito ratos utilizados na experiência, antes e depois da
administração. Foi mantida a ordem de 1 para 8 nos ratos em ambas as
medições. Entre a primeira e segunda medição administrou-se a dose de
Morfina indicada pela dose a cima referida, calculada a partir da massa
de cada um dos ratos previamente pesados.
A vermelho encontra-se o valor de 30s, no entanto este mesmo valor
não pode ser considerado. Terá ocorrido um erro na observação ou até
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mesmo uma insensibilidade ou qualquer outro problema com o espécime que
o torna inviável para a experiência, no entanto ainda é apresentado no
Gráfico 1 apenas para temos a relação entre o comportamento dos anojais
antes e depois da administração de Morfina.
No Gráfico 1 encontram-se os valores expostos na Tabela 1 de modo a
comparar os valores obtidos dependentes da administração.
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Tabela 1Ratos t - Antes da
Administração (s)t - Depois da
Administração (s)
Rato 1 3 16,6
Rato 2 3,5 29
Rato 3 3,7 24,73
Rato 4 2,9 20,26
Rato 5 3,55 23,26
Rato 6 2,31 26,01
Rato 7 3,43 30Rato 8 2,57 16,58
Ra Ra Ra Ra Ra Ra Ra Ra0
7.5
15
22.5
30
37.5Gráfico 1
Antes Depois
Temp
o (s
)
Como podemos analisar todos os ratos tornaram-se mais “resistentes”
ao estímulo térmico reagindo ao mesmo mais tarde, o que demonstra
bastante bem o efeito da Morfina como analgésico central.
No Gráfico 2 podemos analisar os tempos médios da experimentação,
Antes e Depois da Morfina se encontrar em circulação, mais uma vez
ilustrando que todos os ratos suportaram o estimulo térmico mais tempo.
Uma das causas inerentes ao erro e ao elevado desvio padrão,
especialmente a segunda coluna (depois da administração da Morfina)
deve-se sem duvida à inexperiência dos observadores que não conseguiam
identificar com clareza os movimentos referentes à dor.
Como podemos ver comprova-se que a morfina actua como um analgésico
central uma vez que o tempo de resistência ao estimulo térmico aumentou.
Dependendo dos resultados do mesmo ensaio, mas com o fármaco em estudo,
poderemos relacionar a percentagem analgésica de um fármaco (em
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Antes Depois0
7.5
15
22.5
30
3
22
Gráfico 2Desvio Padrão Média
Temp
o (s
)
comparação com a morfina) avaliando assim se ele tem ou não interesse
Farmacológico.
Anti-inflamatórios não esteróides
Os anti-inflamatórios não esteróides (AINEs) são um grupo de
fármacos que atuam principalmente sobre as prostaglandinas, que são
mediadores químicos que participam na inflamação, e como tal, na dor e
na febre. A inflamação é uma resposta localizada ou sistêmica a
determinados estímulos nocivos. Após lesão inicial ou estímulo, ocorre a
liberação de mediadores pró-inflamatórios, tais como histamina,
serotonina, prostaglandinas, bradicininas, entre outros. Uma das causas
mais importante é o aumento da produção de prostaglandinas (PGs)
sintetizadas pelas enzimas ciclooxigenases (COX), após estimulo
inflamatório no tecido. Os AINEs inibem a síntese de prostaglandinas,
em doses baixas, no entanto, não interferem com os leucotrienos (outros
derivados do ácido araquidónico). A sua acção primária está relacionada
com a sua habilidade de inibir a enzima COX de ácidos gordos, inibindo
desta forma a produção de prostaglandinas e tromboxanos. Há duas
isoformas comuns desta enzima COX-1 e COX-2.
A COX-1 é uma enzima constitutiva expressa na maioria dos tecidos,
inclusive nas plaquetas do sangue. Tem um papel importante relativamente
a funções de ‘manutençao’ do organismo estando envolvida na homeostase
dos tecidos, e é responsável pela produção de prostaglandinas com
funções por exemplo de citoproteção gástrica, agregação plaquetária,
autorregulação do fluxo sanguíneo renal, e no inicio do parto.
Relativamente á COX-2 já é induzida nas células inflamatórias quando
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sofrem lesão ou infecção, ou quando são ativadas, por exemplo, pelas
citocinas inflamatórias – IL1 e TNF-α. A isoforma COX-2 é sobretudo
responsável pela produção dos mediadores prostanoides da inflamação.
A COX-1 e 2 são similares quanto à estrutura tridimensional e
atividade enzimática. São proteínas hemodiméricas, compostas de três
domínios independentes – domínio do fator de crescimento epidérmico e
dois domínios funcionais, o de ligação à membrana e o catalítico.
Comparando o sitio ativo da COX-1 ao da COX-2, mais especificamente,
onde ocorre interação com o ácido araquidônico, as enzimas se
diferenciam por apenas dois resíduos de aminoácidos, tem-se a
substituição do aminoácido isoleucina (Ile), nas posições 434 e 523
presentes na COX-1, pelo aminoácido valina (Val) na COX-2. O
reconhecimento das diferenças morfológicas entre as duas isoformas da
enzima ciclooxigenase (COX-1 e COX-2), permitiu prever a possibilidade
de se desenvolver inibidores seletivos da COX-2, conhecidos como
coxibes, como estratégia para obter-se efeito anti-inflamatório
desprovido de efeitos colaterais ao nível gastrointestinal, além da
ocorrência de efeitos adversos ao nível renal e cardiovascular.
Fig.1 – diferenças nos sítios de ligação
dos AINEs nas duas isoformas. O sitio de
ligação da COX-2 caracteriza-se por um
‘bolso lateral’ que pode acomodar grupos
volumosos, tais como o grupamento
sulfoamida do celecoxibe, o que impede o
seu acesso ao sitio COX-1.
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Indica çõ es Terap ê uticas
Os AINES apresentam propriedades antiinflamatórias, analgésicas e
antipiréticas. São as drogas de primeira escolha no tratamento de
doenças reumáticas e não-reumáticas como, artrite reumatóide,
osteoartrite e artrite psoriática, assim como em causos de traumas e
contusões e ainda nos pós-operatórios. É o principal tratamento para a
dor leve e moderada devido as suas propriedades analgésicas prolongadas
e diminuem a temperatura corporal elevada sem provocar dependência
química.
Mecanismo de Ac çã o
Os efeitos terapêuticos e colaterais dos AINES provêm essencialmente
da inibição da enzima COX, reduzindo assim, a síntese das
prostaglandinas e diminuindo a intensidade do processo inflamatório. De
acordo com as funções fisiológicas das isoformas da COX, postulou-se que
AINES inibidores específicos da COX-2 impediriam o processo inflamatório
sem causar os efeitos colaterais gástricos resultantes da inibição da
COX-1. Em geral, os AINES inibem de forma variável as duas isoformas da
COX em suas dosagens terapêuticas. Eles também antagonizam os receptores
de prostaglandinas, reduzem a permeabilidade capilar, diminuindo o edema
e vermelhidão, e inibem a liberação de PGE1 o que leva a redução do
estado febril.
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Como resultado deste mecanismo de acção surgem alguns efeitos
secundários associados à diminuição de prostaglandinas:
• gástricas (PGI2) leva a uma maior susceptibilidade da mucosa,
podendo surgir lesões gastroduodenais (daí ser recomendado a sua
toma após as refeições);
• vasculares (PGI2) responsável pelo aumento da resistência vascular
periférica, potenciando episódios de hipertensão (interacção
farmacodinâmica com os anti-hipertensores), devido a uma
desprotecção dos vasos;
• a nível uterino o que leva a paralisia; na medula renal (PGE2)
leva à diminuição da excreção de Na+ (hipertensão) e H2O
(insuficiência cardíaca);
• no córtex renal (E2 e I2) leva ao aparecimento de edemas,
hipercaliémia e insuficiência renal aguda.
• O aumento dos leucotrienos induz uma broncoconstrição (não sendo
recomendados em asmáticos) e aumento da hipersensibilidade;
• a diminuição dos tromboxanos conduz a uma acção anti-agregante
plaquetar que, em alguns casos como no do ácido acetilsalicílico
(devido à inibição irreversível da COX), pode ser aproveitada como
efeito terapêutico.
Efeitos Adversos
A principal limitação no uso dos AINES são os seus efeitos
gastrointestinais que estão entre os mais graves, incluindo náuseas, dor
abdominal e úlcera gástrica. Os AINES inibidores seletivos de COX-2
parecem minimizar esses efeitos. Estes não oferecem efeitos
cardioprotetores, e podem agravar problemas renais em paciente idosos,
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com insuficiência cardíaca, diabéticos, cirróticos, dentre outros.
Alguns AINES têm sido associados a efeitos de hepatotoxicidade. O uso
dos AINES está relacionado a uma elevação da pressão sanguínea, sendo
esse efeito mais evidenciado em pacientes que fazem uso de drogas anti-
hipertensivas.
Actividade Laboratorial
Conforme referido na vertente experimental dos Analgésicos Centrais,
a Dor Periférica provém, geralmente de processos inflamatórios. Desta
forma os anti-inflamatórios podem intervir neste processo e dessa forma
aliviar a dor.
Novamente para este processo necessitamos de um modelo de dor para
testar o nosso fármaco. Desta vez como controlo positivo iremos utilizar
o Diclofenac, um Anti-inflamatório não esteróide com efeito testado e
comprovado. Neste teste iremos utilizar um espécime como controlo
negativo, no qual será causada a Inflamação e não será administrado o
Diclofenac.
Iremos induzir nos ratos uma Inflamação Química, administrando Ácido
Acético via Peritonial, causando uma inflamação a nivel intestinal.
Devido à inflamação e a dor a ela associada os ratos iram contorcer-se,
assim iremos contar o numero de contorções que decorrem no intervalo de
5-30min depois da administração do fármaco. Foram utilizados 2 animais
por cada grupo de 8 observadores que contavam o número de contorções. A
Tabela 2 ilustra os resultados obtidos.
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Mais uma vez o interesse desta mesma experiência é meramente
pedagógico e será de identificar comportamentos dos animais em teste. Em
investigação de novos fármacos teríamos de utilizar em cada dos dos
passos não 2 animais mas sim 6-8 animais. Além disso teríamos outro
grupo de animais aos quais iriam ser administrado o composto teste numa
determinada dose para depois o seu valor ser comparado em dados
estatísticos se tem ou não poder anti-inflamatório e nomeadamente
relação com a actividade Anti-inflamatória do Diclofenac.
Outro dos fatores de erro é os animais não serem todos iguais e
claro que o mesmo acontece com a equipa de investigação. O grupo 1 e o
grupo 2 eram constituídos por 8 pessoas inexperientes e que ainda por
cima não acompanharam as experiências um do outro, dai os seu resultados
tão dispares.
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Tabela 2
Observadores Ác. Acético(Controlo 1)
Ác. Acético(Controlo 2)
Ác. Acético +Diclofenac - 1
Ác. Acético +Diclofenac - 2
Observador 1 38 115 31 27
Observador 2 32 115 30 26
Observador 3 28 107 25 30
Observador 4 25 98 26 31
Observador 5 35 115 - 32
Observador 6 27 108 22 28
Observador 7 29 107 21 27
Observador 8 26 - 21 31
No Gráfico 3 apresenta os valores médios referentes a cada um dos
dois grupos o animal controlo negativo e o animal teste.
É visível que em ambos os casos houve uma redução do número de
contorções com a administração do Diclofenac, no entanto os valos do
controlo são tão dispares que este ensaio perdeu o seu interesse
estatístico e teria que ser repetido. Podemos no entanto dizer que é
inequívoca a forma como um Anti-Inflamatório pode aliviar dor derivada
da inflamação.
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Controlo 1 Diclofnac 1 Controlo 2 Diclofnac 20
30
60
90
120
150
3025
109
29
Gráfico 3Desvio Padrão Média
Nº d
e Co
ntor
ções
Corticosteroide
Os corticosteroides (ou corticoides) endógenos são hormonas
esteroides sintetizadas pelas suprarrenais. Dependendo da zona da
suprarrenal são sintetizadas diferentes hormonas, com funções
diferentes, sendo que é no córtex deste órgão (mais propriamente na zona
glomerular e fascicular) que se sintetizam os corticoides, de dois
tipos: mineralocorticóides (p. ex. aldosterona; zona glomerular) e
glucocorticoides (p.ex. cortisol; zona fascicular). Os
mineralocorticoides exercem, principalmente, atividade na retenção de
sódio nos rins, controlando os níveis de eletrólitos no organismo. Já os
glucocorticoides, como é o caso do cortisol, intervêm no metabolismo de
hidratos de carbono, gorduras e proteínas, bem como na resposta
inflamatória, inibindo a síntese de substracto (ácido araquidónico) da
enzima COX e suprimindo o recrutamento de células do sistema
imunológico, sendo as função anti-inflamatória e imunossupressora as que
interessam ao nosso estudo.
Assim são produzidos fármacos (corticoesteróides exógenos) com o
objectivo de mimetizar a ação das hormonas corticosteroides endógenas,
quer as mineralocorticoides, quer as glucocorticoides. No entanto, e
para o nosso estudo daremos especial relevo aos glucocorticoides.
Mecanismo de Ac çã o
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O mecanismo de acção a seguir apresentado é o dos glucocorticoides,
uma vez que são estes que tem uma ação anti-inflamatória e
imunossupressora, sendo estas ações as explicadas.
O efeito anti-inflamatório deve-se à actuação dos corticosteroides
por duas formas: redução do grau de acetilação do DNA e redução da
concentração de NFKβ (factor de transcrição).
O grau de acetilação do DNA controla o enrolamento desta molécula,
pelo que a desacetilação/acetilação faz com que DNA se ligue mais ou
menos (respectivamente) às histonas. Assim, os corticosteroides ao
permitirem uma redução do grau de acetilação permitem uma maior ligação
às histonas e por consequência um maior enrolamento da molécula de DNA,
pelo que diminui a transcrição de genes codificadores das proteínas
mediadoras de inflamação.
Para além disso reduzem a concentração de um factor de transcrição,
o NFKβ, que controla principalmente a transcrição de genes de mediadores
inflamatórios. Este factor de transcrição é um complexo constituído por
subunidades citosólicas, que quando está activo migra para núcleo. A
activação resulta da fosforilação de IKB (proteína). Ao inibir-se
fosforilação da mesma, o factor não vai para o núcleo e por consequência
há uma diminuição de proteínas inflamatórias, pois diminui a transcrição
dos seus genes.
Já o efeito imunossupressor deve-se à inibição do recrutamento de
células do sistema imunológico, como os linfócitos, monócitos,
basófilos, mastócitos e eosinófilos ao local da inflamação, diminuindo
também a concentração de anti-corpos, citocinas e quimiocinas
inflamatórias, bem como outros mediadores de inflamação.
Indica çõ es Terap ê uticas
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Uso em quadro inflamatório, sendo mais potentes que os AINE’s, bem
como em situações de supressão imunitária (doença auto-imune ou
transplantação) ou ainda em casos de alterações da função suprarrenal,
diagnóstico ou eliminação da maturação pulmonar do feto.
Efeitos Adversos
Os principais efeitos indesejáveis dos glucorticoides resultam da
sua ação hormonal, produzindo quadro clínico de Síndrome de Cushing
iatrogénico (geralmente aparece devido ao uso crónico de cortisona ou
hidrocortisona).
Esta síndrome resulta num contorno arredondado do rosto, ocorrência
de tumefação, deposição de gordura ou insónias. Uma vez que os
glucocorticoides intervêm no metabolismo celular, aumentando os níveis
de glucose séricas ocorre um aumento de apetite. Por sua vez, com o
tempo é necessário insulina. Ocorre também um aumento de peso corporal,
deposição de gordura visceral, atrofia muscular, adelgaçamento da pele,
hiperglicemia, osteoporose e por fim diabetes.
Actividade Laboratorial
Para avaliar a Actividade dos Corticosteroides analisamos um video
na Aula Laboratorial.
Há duas formas de causar a inflamação consoante o tipo de inflamação
que queremos. No caso da inflamação aguda basta ou utilizar um ácido
forte ou mesmo até um traumatismo para provocar a inflamação e depois
monitoriza-se o aumento do volume da zona inflamada com e sem
administração de fármaco, recorrendo-se a um recipiente com água em
vasos comunicantes. Na inflamação crônica é necessária a incisão de
algodão estéril de modo a que o corpo do animal inflame. O animal é
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mantido em separado durante uma semana e é administrado o fármaco. No
final do tempo necessário é retirado o granoloma e é analisado o seu
volume comparando-se novamente o volume da inflamação para definir a
actividade do fármaco em estudo.
Bibliografia
Livros:
Rang & Dale; Farmacologia; Editora Elsevier (2012); 7ª edição; Rio de Janeiro.
Katzung, Bertrang G. (2003); Farmacologia Básica e Clínica; Editora Guanabare Koogan; 8ª edição; Brasil.
Guimarães, Serafim; Moura, Daniel; Silva, Patrício Soares da; Terapêutica Medicamentosa e suas Bases Farmacológicas; Porto-Editora; 5ª edição; Porto.
Sites:
http://www.scielo.br/pdf/rba/v52n4/v52n4a14.pdf
http://pt.scribd.com/doc/44310094/ANALGESICOS-OPIOIDES
http://www.spcneuro.com.br/cariboost_files/
2_Mario_FARMACOLOGIA_20DA_20DOR_2016.pdf
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