Farmacologia IRelatório da Aula Laboratorial

Avaliação de compostos comacção analgésica, anti-

inflamatória ecorticosteróide

Carla Oliveira Elsa Sousa Mariana Gonçalves Rui Liceia

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Coimbra

24 de Novembro de 2014

A dor é o sintoma que com maior frequência leva o paciente a

procurar o médico. Por vezes, é difícil aniquilar a sua causa patológica

o que impõe que se recorra a medidas terapêuticas que apenas visam

reduzir este sintoma. Os medicamentos que diminuem a dor pertencem a

vários grupos: os anestésicos gerais, os anestésicos locais e os

analgésicos. Iremos no entanto abordar apenas os analgésicos de acção

local e central.

Analgésicos centrais Os fármacos analgésicos de ação central caracterizados por

propriedade analgésica potente, efeito tranquilizante (sedativo) e

hipnótico, actuam inibindo os estímulos nervosos que chegam ao sistema

nervoso central. Essa inibição é dada quando o analgésico atinge o

centro modulador da dor diminuindo a perceção da sensação dolorosa

através da estimulação dos recetores opiáceos centrais. Agem portanto

a nível do SNC e destacam-se pela intensa analgesia associada à

depressão da consciência e das funções neurovegetativas. Por provocarem

o seu efeito por este mecanismo, estes fármacos designam-se opiáceos,

quando de origem natural, e opióides, quando de origem sintética ou

semissintética. A grande referência do grupo dos analgésicos centrais é

a morfina, alcaloide do ópio extraído de Papaver somniferu.

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Até o momento foram descritos os seguintes recetores opióides: μ

(MOP), κ (KOP), δ (DOP), σ (sigma) e (elipson) e estudos recentes

demonstraram que estes se encontram localizados na superfície das

membranas celulares, assumindo uma configuração transmembranar. Estes

recetores estão acoplados a um nucleotídeo guanílico ligado a uma

proteína reguladora, a proteína G, que medeia os efeitos celulares.

Efeitos mediados por activação dos diferentes tipos de receptoresopióides

DOP KOP MOP

· Analgesia por acção supramedular· Analgesia por acção medular· Dependência· Obstipação· Depressão respiratória

· Analgesia por acção medular· É controversa a existênciade efeitosanalgésicos por acção supramedular· Não parecem mediar efeitosde reforço em animais de experiênciae podem causar disforia em sereshumanos· Obstipação· Diurese por inibição da libertação da hormona antidiurética

· Analgesia por acçãosupramedular· Analgesia por acçãomedular· Depressão respiratória· Dependência· Obstipação

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A morfina estimula os recetores opiáceos por ser um agonista

exógeno preferencial dos recetores µ (MOP) e tem elevada afinidade para

os recetores κ (KOP) e δ (DOP), daí o seu amplo espectro de atividade

associado à distribuição destes recetores por todo o SNC, tecidos

periféricos e sistema imunitário. Os recetores opiáceos estimulados pela

morfina podem ser inibitórios e excitatórios, sendo que no Homem

predominam os primeiros.

Os recetores opióides, acoplados à proteína G, inibem a

adenilciclase, reduzindo assim o conteúdo intracelular de cAMP. Além

disso, facilitam a abertura dos canais de K+ (causando hiperpolarização)

e inibem a abertura dos canais de Ca2+ regulados pela voltagem (inibindo

a ação de transmissores). Esses efeitos sobre a membrana reduzem tanto a

excitabilidade neuronal quanto a libertação de transmissores (devido à

inibição da entrada de cálcio).

Inferimos assim que o efeito final da morfina ao nível cerebral é

sobretudo depressor e as suas ações centrais mais importantes são a

analgesia, a sedação, a depressão respiratória e a dependência.

Efeitos adversos

A morfina, por estimulação dos recetores μ, tem a capacidade de

desencadear dependência física. Esta dependência acontece com o uso não

médico ou com o uso em doses superiores às analgésicas mínimas

necessárias, porque quando se consome morfina, o cérebro deixa de

sintetizar os seus próprios opiáceos endógenos (endorfinas e

encefalinas), passando a morfina a assumir o papel destes. Existe também

dependência psíquica, isto é, desejo compulsivo e necessidade contínua

de tomar morfina, para que o indivíduo se sinta bem e normal. Outro

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efeito relevante é a depressão respiratória, detetável mesmo em doses

sub-analgésicas de morfina em indivíduos sãos e resulta de um efeito

direto sobre o centro respiratório bulbar, que se torna menos sensível a

estimulações fisiológicas. Em intoxicações agudas (overdose), constitui

a principal causa de morte.

A nível cardiovascular, causa hipotensão arterial, por

vasodilatação periférica, que é provocada pela histamina endógena

libertada. A nível gastrointestinal, diminui a motilidade gástrica e

provoca obstipação, como resultado do seu efeito direto sobre o músculo

liso do intestino.

Devido as suas limitações houve necessidade de encontrar

analgésicos centrais com eficácia semelhante à morfina mas com menos

efeitos secundários. Por isso, têm sido produzidos elevado número de

analgésicos centrais de origem sintética (os principais são a

buprenorfina, fentanil, metadona, tramadol, sufentanil, meperidina,

entre outros) ou de origem semissintética (diacetilmorfina ou heroína,

di-hidrocodeína, oximorfona).

Componente Laboratorial

Para avaliar se um fármaco tem ou não actividade Analgésica Central

temos de criar um modelo de dor e experimentar se depois da

administração do farmaco os animais deixam de ter dor. Dependendo do

tipo de estimulo poderemos classificar a dor como central ou periférica.

A Dor Periférica é associada a um processo inflamatório e a Dor

Central associada a estímulos térmicos.

Assim com base nestes mesmos princípios podemos criar o nosso modelo

de dor: colocamos um ratinho numa placa quente e cronometramos o tempo

que demora a que ele retire as patas da superfície da placa (reflexo de

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flexão), depois administraremos via perionial a dose de morfina e

repetiremos a experiência.

No nosso modelo, cada modelo animal servirá de controlo de si mesmo,

ou seja, o que iremos analisar é diferença entre os tempos cronometrados

com e sem a administração de Morfina em cada um dos ratos.

Como se trata de um interesse meramente pedagógico iremos apenas

administrar Morfina nos nossos modelos para que possamos compreender o

que é expectável nas experiências com novos fármacos. Em contexto de

investigação ainda existiria outra parte da experiência em que seria

cronometrado o tempo antes e depois de ser administrado o fármaco em

estudo e até mesmo repetir o procedimento mas com outra dose diferente.

Por intermédio de manipulação estatística permitia-nos inferir se o

fármaco tem ou não mais potencial analgésico que a Morfina, analgésico

centrar referenciado, de efeito conhecido, funcionando assim como

controlo positivo no nosso modelo.

Utilizamos a dose de morfina de 10 mg/kg(massa do rato).

De modo a não causar danos nos animais estipulámos que o tempo

máximo de exposição ao estimulo térmico seria de 30s, caso este tempo

seja atingido o animal terá de ser retirado de imediato e o seu valor

estatístico não será válido.

Na Tabela 1 encontram-se registados os tempos cronometrados em cada

um dos oito ratos utilizados na experiência, antes e depois da

administração. Foi mantida a ordem de 1 para 8 nos ratos em ambas as

medições. Entre a primeira e segunda medição administrou-se a dose de

Morfina indicada pela dose a cima referida, calculada a partir da massa

de cada um dos ratos previamente pesados.

A vermelho encontra-se o valor de 30s, no entanto este mesmo valor

não pode ser considerado. Terá ocorrido um erro na observação ou até

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mesmo uma insensibilidade ou qualquer outro problema com o espécime que

o torna inviável para a experiência, no entanto ainda é apresentado no

Gráfico 1 apenas para temos a relação entre o comportamento dos anojais

antes e depois da administração de Morfina.

No Gráfico 1 encontram-se os valores expostos na Tabela 1 de modo a

comparar os valores obtidos dependentes da administração.

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Tabela 1Ratos t - Antes da

Administração (s)t - Depois da

Administração (s)

Rato 1 3 16,6

Rato 2 3,5 29

Rato 3 3,7 24,73

Rato 4 2,9 20,26

Rato 5 3,55 23,26

Rato 6 2,31 26,01

Rato 7 3,43 30Rato 8 2,57 16,58

Ra Ra Ra Ra Ra Ra Ra Ra0

7.5

15

22.5

30

37.5Gráfico 1

Antes Depois

Temp

o (s

)

Como podemos analisar todos os ratos tornaram-se mais “resistentes”

ao estímulo térmico reagindo ao mesmo mais tarde, o que demonstra

bastante bem o efeito da Morfina como analgésico central.

No Gráfico 2 podemos analisar os tempos médios da experimentação,

Antes e Depois da Morfina se encontrar em circulação, mais uma vez

ilustrando que todos os ratos suportaram o estimulo térmico mais tempo.

Uma das causas inerentes ao erro e ao elevado desvio padrão,

especialmente a segunda coluna (depois da administração da Morfina)

deve-se sem duvida à inexperiência dos observadores que não conseguiam

identificar com clareza os movimentos referentes à dor.

Como podemos ver comprova-se que a morfina actua como um analgésico

central uma vez que o tempo de resistência ao estimulo térmico aumentou.

Dependendo dos resultados do mesmo ensaio, mas com o fármaco em estudo,

poderemos relacionar a percentagem analgésica de um fármaco (em

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Antes Depois0

7.5

15

22.5

30

3

22

Gráfico 2Desvio Padrão Média

Temp

o (s

)

comparação com a morfina) avaliando assim se ele tem ou não interesse

Farmacológico.

Anti-inflamatórios não esteróides

Os anti-inflamatórios não esteróides (AINEs) são um grupo de

fármacos que atuam principalmente sobre as prostaglandinas, que são

mediadores químicos que participam na inflamação, e como tal, na dor e

na febre. A inflamação é uma resposta localizada ou sistêmica a

determinados estímulos nocivos. Após lesão inicial ou estímulo, ocorre a

liberação de mediadores pró-inflamatórios, tais como histamina,

serotonina, prostaglandinas, bradicininas, entre outros. Uma das causas

mais importante é o aumento da produção de prostaglandinas (PGs)

sintetizadas pelas enzimas ciclooxigenases (COX), após estimulo

inflamatório no tecido. Os AINEs inibem a síntese de prostaglandinas,

em doses baixas, no entanto, não interferem com os leucotrienos (outros

derivados do ácido araquidónico). A sua acção primária está relacionada

com a sua habilidade de inibir a enzima COX de ácidos gordos, inibindo

desta forma a produção de prostaglandinas e tromboxanos. Há duas

isoformas comuns desta enzima COX-1 e COX-2.

A COX-1 é uma enzima constitutiva expressa na maioria dos tecidos,

inclusive nas plaquetas do sangue. Tem um papel importante relativamente

a funções de ‘manutençao’ do organismo estando envolvida na homeostase

dos tecidos, e é responsável pela produção de prostaglandinas com

funções por exemplo de citoproteção gástrica, agregação plaquetária,

autorregulação do fluxo sanguíneo renal, e no inicio do parto.

Relativamente á COX-2 já é induzida nas células inflamatórias quando

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sofrem lesão ou infecção, ou quando são ativadas, por exemplo, pelas

citocinas inflamatórias – IL1 e TNF-α. A isoforma COX-2 é sobretudo

responsável pela produção dos mediadores prostanoides da inflamação.

A COX-1 e 2 são similares quanto à estrutura tridimensional e

atividade enzimática. São proteínas hemodiméricas, compostas de três

domínios independentes – domínio do fator de crescimento epidérmico e

dois domínios funcionais, o de ligação à membrana e o catalítico.

Comparando o sitio ativo da COX-1 ao da COX-2, mais especificamente,

onde ocorre interação com o ácido araquidônico, as enzimas se

diferenciam por apenas dois resíduos de aminoácidos, tem-se a

substituição do aminoácido isoleucina (Ile), nas posições 434 e 523

presentes na COX-1, pelo aminoácido valina (Val) na COX-2. O

reconhecimento das diferenças morfológicas entre as duas isoformas da

enzima ciclooxigenase (COX-1 e COX-2), permitiu prever a possibilidade

de se desenvolver inibidores seletivos da COX-2, conhecidos como

coxibes, como estratégia para obter-se efeito anti-inflamatório

desprovido de efeitos colaterais ao nível gastrointestinal, além da

ocorrência de efeitos adversos ao nível renal e cardiovascular.

Fig.1 – diferenças nos sítios de ligação

dos AINEs nas duas isoformas. O sitio de

ligação da COX-2 caracteriza-se por um

‘bolso lateral’ que pode acomodar grupos

volumosos, tais como o grupamento

sulfoamida do celecoxibe, o que impede o

seu acesso ao sitio COX-1.

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Indica çõ es Terap ê uticas

Os AINES apresentam propriedades antiinflamatórias, analgésicas e

antipiréticas. São as drogas de primeira escolha no tratamento de

doenças reumáticas e não-reumáticas como, artrite reumatóide,

osteoartrite e artrite psoriática, assim como em causos de traumas e

contusões e ainda nos pós-operatórios. É o principal tratamento para a

dor leve e moderada devido as suas propriedades analgésicas prolongadas

e diminuem a temperatura corporal elevada sem provocar dependência

química.

Mecanismo de Ac çã o

Os efeitos terapêuticos e colaterais dos AINES provêm essencialmente

da inibição da enzima COX, reduzindo assim, a síntese das

prostaglandinas e diminuindo a intensidade do processo inflamatório. De

acordo com as funções fisiológicas das isoformas da COX, postulou-se que

AINES inibidores específicos da COX-2 impediriam o processo inflamatório

sem causar os efeitos colaterais gástricos resultantes da inibição da

COX-1. Em geral, os AINES inibem de forma variável as duas isoformas da

COX em suas dosagens terapêuticas. Eles também antagonizam os receptores

de prostaglandinas, reduzem a permeabilidade capilar, diminuindo o edema

e vermelhidão, e inibem a liberação de PGE1 o que leva a redução do

estado febril.

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Como resultado deste mecanismo de acção surgem alguns efeitos

secundários associados à diminuição de prostaglandinas:

• gástricas (PGI2) leva a uma maior susceptibilidade da mucosa,

podendo surgir lesões gastroduodenais (daí ser recomendado a sua

toma após as refeições);

• vasculares (PGI2) responsável pelo aumento da resistência vascular

periférica, potenciando episódios de hipertensão (interacção

farmacodinâmica com os anti-hipertensores), devido a uma

desprotecção dos vasos;

• a nível uterino o que leva a paralisia; na medula renal (PGE2)

leva à diminuição da excreção de Na+ (hipertensão) e H2O

(insuficiência cardíaca);

• no córtex renal (E2 e I2) leva ao aparecimento de edemas,

hipercaliémia e insuficiência renal aguda.

• O aumento dos leucotrienos induz uma broncoconstrição (não sendo

recomendados em asmáticos) e aumento da hipersensibilidade;

• a diminuição dos tromboxanos conduz a uma acção anti-agregante

plaquetar que, em alguns casos como no do ácido acetilsalicílico

(devido à inibição irreversível da COX), pode ser aproveitada como

efeito terapêutico.

Efeitos Adversos

A principal limitação no uso dos AINES são os seus efeitos

gastrointestinais que estão entre os mais graves, incluindo náuseas, dor

abdominal e úlcera gástrica. Os AINES inibidores seletivos de COX-2

parecem minimizar esses efeitos. Estes não oferecem efeitos

cardioprotetores, e podem agravar problemas renais em paciente idosos,

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com insuficiência cardíaca, diabéticos, cirróticos, dentre outros.

Alguns AINES têm sido associados a efeitos de hepatotoxicidade. O uso

dos AINES está relacionado a uma elevação da pressão sanguínea, sendo

esse efeito mais evidenciado em pacientes que fazem uso de drogas anti-

hipertensivas.

Actividade Laboratorial

Conforme referido na vertente experimental dos Analgésicos Centrais,

a Dor Periférica provém, geralmente de processos inflamatórios. Desta

forma os anti-inflamatórios podem intervir neste processo e dessa forma

aliviar a dor.

Novamente para este processo necessitamos de um modelo de dor para

testar o nosso fármaco. Desta vez como controlo positivo iremos utilizar

o Diclofenac, um Anti-inflamatório não esteróide com efeito testado e

comprovado. Neste teste iremos utilizar um espécime como controlo

negativo, no qual será causada a Inflamação e não será administrado o

Diclofenac.

Iremos induzir nos ratos uma Inflamação Química, administrando Ácido

Acético via Peritonial, causando uma inflamação a nivel intestinal.

Devido à inflamação e a dor a ela associada os ratos iram contorcer-se,

assim iremos contar o numero de contorções que decorrem no intervalo de

5-30min depois da administração do fármaco. Foram utilizados 2 animais

por cada grupo de 8 observadores que contavam o número de contorções. A

Tabela 2 ilustra os resultados obtidos.

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Mais uma vez o interesse desta mesma experiência é meramente

pedagógico e será de identificar comportamentos dos animais em teste. Em

investigação de novos fármacos teríamos de utilizar em cada dos dos

passos não 2 animais mas sim 6-8 animais. Além disso teríamos outro

grupo de animais aos quais iriam ser administrado o composto teste numa

determinada dose para depois o seu valor ser comparado em dados

estatísticos se tem ou não poder anti-inflamatório e nomeadamente

relação com a actividade Anti-inflamatória do Diclofenac.

Outro dos fatores de erro é os animais não serem todos iguais e

claro que o mesmo acontece com a equipa de investigação. O grupo 1 e o

grupo 2 eram constituídos por 8 pessoas inexperientes e que ainda por

cima não acompanharam as experiências um do outro, dai os seu resultados

tão dispares.

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Tabela 2

Observadores Ác. Acético(Controlo 1)

Ác. Acético(Controlo 2)

Ác. Acético +Diclofenac - 1

Ác. Acético +Diclofenac - 2

Observador 1 38 115 31 27

Observador 2 32 115 30 26

Observador 3 28 107 25 30

Observador 4 25 98 26 31

Observador 5 35 115 - 32

Observador 6 27 108 22 28

Observador 7 29 107 21 27

Observador 8 26 - 21 31

No Gráfico 3 apresenta os valores médios referentes a cada um dos

dois grupos o animal controlo negativo e o animal teste.

É visível que em ambos os casos houve uma redução do número de

contorções com a administração do Diclofenac, no entanto os valos do

controlo são tão dispares que este ensaio perdeu o seu interesse

estatístico e teria que ser repetido. Podemos no entanto dizer que é

inequívoca a forma como um Anti-Inflamatório pode aliviar dor derivada

da inflamação.

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Controlo 1 Diclofnac 1 Controlo 2 Diclofnac 20

30

60

90

120

150

3025

109

29

Gráfico 3Desvio Padrão Média

Nº d

e Co

ntor

ções

Corticosteroide

Os corticosteroides (ou corticoides) endógenos são hormonas

esteroides sintetizadas pelas suprarrenais. Dependendo da zona da

suprarrenal são sintetizadas diferentes hormonas, com funções

diferentes, sendo que é no córtex deste órgão (mais propriamente na zona

glomerular e fascicular) que se sintetizam os corticoides, de dois

tipos: mineralocorticóides (p. ex. aldosterona; zona glomerular) e

glucocorticoides (p.ex. cortisol; zona fascicular). Os

mineralocorticoides exercem, principalmente, atividade na retenção de

sódio nos rins, controlando os níveis de eletrólitos no organismo. Já os

glucocorticoides, como é o caso do cortisol, intervêm no metabolismo de

hidratos de carbono, gorduras e proteínas, bem como na resposta

inflamatória, inibindo a síntese de substracto (ácido araquidónico) da

enzima COX e suprimindo o recrutamento de células do sistema

imunológico, sendo as função anti-inflamatória e imunossupressora as que

interessam ao nosso estudo.

Assim são produzidos fármacos (corticoesteróides exógenos) com o

objectivo de mimetizar a ação das hormonas corticosteroides endógenas,

quer as mineralocorticoides, quer as glucocorticoides. No entanto, e

para o nosso estudo daremos especial relevo aos glucocorticoides.

Mecanismo de Ac çã o

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O mecanismo de acção a seguir apresentado é o dos glucocorticoides,

uma vez que são estes que tem uma ação anti-inflamatória e

imunossupressora, sendo estas ações as explicadas.

O efeito anti-inflamatório deve-se à actuação dos corticosteroides

por duas formas: redução do grau de acetilação do DNA e redução da

concentração de NFKβ (factor de transcrição).

O grau de acetilação do DNA controla o enrolamento desta molécula,

pelo que a desacetilação/acetilação faz com que DNA se ligue mais ou

menos (respectivamente) às histonas. Assim, os corticosteroides ao

permitirem uma redução do grau de acetilação permitem uma maior ligação

às histonas e por consequência um maior enrolamento da molécula de DNA,

pelo que diminui a transcrição de genes codificadores das proteínas

mediadoras de inflamação.

Para além disso reduzem a concentração de um factor de transcrição,

o NFKβ, que controla principalmente a transcrição de genes de mediadores

inflamatórios. Este factor de transcrição é um complexo constituído por

subunidades citosólicas, que quando está activo migra para núcleo. A

activação resulta da fosforilação de IKB (proteína). Ao inibir-se

fosforilação da mesma, o factor não vai para o núcleo e por consequência

há uma diminuição de proteínas inflamatórias, pois diminui a transcrição

dos seus genes.

Já o efeito imunossupressor deve-se à inibição do recrutamento de

células do sistema imunológico, como os linfócitos, monócitos,

basófilos, mastócitos e eosinófilos ao local da inflamação, diminuindo

também a concentração de anti-corpos, citocinas e quimiocinas

inflamatórias, bem como outros mediadores de inflamação.

Indica çõ es Terap ê uticas

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Uso em quadro inflamatório, sendo mais potentes que os AINE’s, bem

como em situações de supressão imunitária (doença auto-imune ou

transplantação) ou ainda em casos de alterações da função suprarrenal,

diagnóstico ou eliminação da maturação pulmonar do feto.

Efeitos Adversos

Os principais efeitos indesejáveis dos glucorticoides resultam da

sua ação hormonal, produzindo quadro clínico de Síndrome de Cushing

iatrogénico (geralmente aparece devido ao uso crónico de cortisona ou

hidrocortisona).

Esta síndrome resulta num contorno arredondado do rosto, ocorrência

de tumefação, deposição de gordura ou insónias. Uma vez que os

glucocorticoides intervêm no metabolismo celular, aumentando os níveis

de glucose séricas ocorre um aumento de apetite. Por sua vez, com o

tempo é necessário insulina. Ocorre também um aumento de peso corporal,

deposição de gordura visceral, atrofia muscular, adelgaçamento da pele,

hiperglicemia, osteoporose e por fim diabetes.

Actividade Laboratorial

Para avaliar a Actividade dos Corticosteroides analisamos um video

na Aula Laboratorial.

Há duas formas de causar a inflamação consoante o tipo de inflamação

que queremos. No caso da inflamação aguda basta ou utilizar um ácido

forte ou mesmo até um traumatismo para provocar a inflamação e depois

monitoriza-se o aumento do volume da zona inflamada com e sem

administração de fármaco, recorrendo-se a um recipiente com água em

vasos comunicantes. Na inflamação crônica é necessária a incisão de

algodão estéril de modo a que o corpo do animal inflame. O animal é

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mantido em separado durante uma semana e é administrado o fármaco. No

final do tempo necessário é retirado o granoloma e é analisado o seu

volume comparando-se novamente o volume da inflamação para definir a

actividade do fármaco em estudo.

Bibliografia

Livros:

Rang & Dale; Farmacologia; Editora Elsevier (2012); 7ª edição; Rio de Janeiro.

Katzung, Bertrang G. (2003); Farmacologia Básica e Clínica; Editora Guanabare Koogan; 8ª edição; Brasil.

Guimarães, Serafim; Moura, Daniel; Silva, Patrício Soares da; Terapêutica Medicamentosa e suas Bases Farmacológicas; Porto-Editora; 5ª edição; Porto.

Sites:

http://www.scielo.br/pdf/rba/v52n4/v52n4a14.pdf

http://pt.scribd.com/doc/44310094/ANALGESICOS-OPIOIDES

http://www.spcneuro.com.br/cariboost_files/

2_Mario_FARMACOLOGIA_20DA_20DOR_2016.pdf

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