Post on 26-Dec-2015
Sindrom Metabolik
Muhammad Budi Syahputra
Usulan Penelitian
PROGRAM STUDI MAGISTER ILMU BIOMEDIKFAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA MEDAN
2014
Definisi adalah sekumpulan faktor-faktor risiko :
Sumber: Alberti ,et al 2004
Sindrom Metaboli
k
Hipertensi
Disglikemi
Obesitas
Trigliserida
↓𝐇𝐃𝐋
Kriteria diagnosa sindrom metabolik
Sumber: NCEP ATP III, IDF
Komponen kriteria diagnosis ATP III :3 komponen di bawah ini IDF
Obesitas abdominal/ sentral
Lingkar perut :Laki-laki: 102 cm Wanita : >88 cm
Lingkar perut :Laki-laki: ≥90 cm Wanita : ≥80 cm
Hiper-trigliseridemia
≥ 150 mg/dl (≥1,7 mmol/L) ≥ 150 mg/dl
HipertensiTD ≥ 130/≥85 mmHg atau
riwayat terapi anti hipertensif
TD sistolik ≥ 130 mmHgTD diastolik ≥ 85
mmHg
Kadar glukosa darah tinggi
≥ 110 mg/dl GDP ≥ 100mg/dl
Etiologi
Etiologi Sindrom Metabolik belum dapat diketahui secara pasti
Suatu hipotesis menyatakan
penyebab primer adalah resistensi insulin.
Faktor-faktor yang mempengaruhi sindrom metabolik
Lingkungan: - Pola makan
- Jenis makanan
Obesitas
Faktor genetik
5% - 70%
Faktor yang mempengaruhi sindrom metabolik
Sumber: Ezquerra EA, 2008
Manajemen sindrom metabolik
1. Penurunan berat badan
Merubah gaya hidup berat badan ideal
2. Latihan fisik
aktivitas enzim lipolisis kadar HDL kadar trigliserida
3. Diet
Rendah garam dan kaya sayur atau buah berserat.
Sumber: Wiliam , et al, 2002, Azadbakht et al., 2005
Medikamentosa
Obat DM tipe II- Golongan metformin- Golongan sulfoniluria
Obat Hipertensi- Golongan ACEI- Golongan ARB
Obat Dislipidemia- Statin
Sumber: PERKENI, 2006
Sumber: Gisnberg et al., 2003
Sumber: Olson et al., 2005
Obesitas Sentral
asam lemak bebas
sensitifitas insulin
Gliconeogenesis Glukosa pada sel
otot & sel β pankreas sekresi
insulin
mengeluarkan sitokin
(adipositokin) seperti angiotensin, TNF α, resistin dan
leptin
Perubahan Metabolik
Hipertensi dislipidemiaPeningkatan
respon inflamasi
koagulasi
Komplikasi • penyakit jantung korner
• gagal jantung
• stroke
• fibrilasi atrium
• tromboembolisme vena
• kematian mendadak
• penurunan fungsi kognitif
• Apakah ada hubungan antara polimorfisme TaqIA gen reseptor dopamin D2 dengan penderita sindrom metabolik dibandingkan non sindrom metabolik.
Rumusan Masalah
• Untuk mengetahui asosiasi antara polimorfisme TaqIA gen reseptor dopamin D2 pada pria dengan usia mulai dari 40 tahun yang sindrom metabolik dibandingkan dengan yang tidak sindrom metabolik
Tujuan Umum
Penelitian
Tujuan Khusus Penelitian
1• Melakukan pendataan simptom pada subjek
penelitian.
2
• Melakukan penilaian dengan menggunakan PCR gen reseptor dopamin D2 terhadap DNA yang telah diisolasi pada pria dengan usia mulai dari 40 tahun yang sindrom metabolik dengan yang tidak sindrom metabolik.
3• Menilai polimorfisme gen reseptor dopamin D2
dengan menggunakan enzim retriksi TaqIA.
4
• Menganalisa hubungan antara polimorfisme TaqIA gen reseptor dopamine D2 pada pria dengan usia mulai dari 40 tahun yang sindrom metabolik dengan yang tidak sindrom metabolik.
Hipotesis
• Tidak ada hubungan polimorfisme TaqIA gen reseptor dopamin D2 pada pria dengan usia mulai dari 40 tahun dengan sindrom metabolik.
Ho
• Adanya hubungan polimorfisme TaqIA gen reseptor dopamin D2 pada Pria dengan usia mulai dari 40 tahun dengan sindrom metabolik.
Ha
Manfaat Penelitia
n
Sebagai dasar penelitian
selanjutnya pada sindrom
metabolik.
Membantu memahami
aspek genetik penyebab sindrom
metabolik Menambah pengetahuan
dan pengalaman peneliti pada
sindrom metabolik
Dopamin
Dopamin memiliki rumus kimia C6H3(OH)2-CH2-CH2-NH2. Nama kimianya adalah "3,4-dihydroxyphenethylamine " dan singkatan adalah "DA"
Sumber: Mandal, 2012
Metabolisme Dopamin
Kelompok Reseptor Dopamin
D1-Like Receptor Family
D1
D5
D2-Like Receptor Family
D2
D3
D4Sumber: Mandal A, 2012
Distribusi reseptor subtipe dopamin
Sumber: Abdulnour S, 2012
Reseptor Dopamin Kelompok D1-like
A. Reseptor Dopamin D1
•Terdapat di Nigrostiatal, mesolimbic dan mesokortikal area
•Stimulasi cAMP dengan mengaktifasi G simulator
•Pada sistem saraf pusat : gerakan volunter, pengaturan perilaku makan, mempengaruhi, reward, tidur, perhatian, perilaku reproduksi, pengendalian impuls, memori kerja
Sumber: Strange, 2008
B. Reseptor Dopamin D5 Stimulasi pembentukan cAMP dengan
mengaktifasi protein G simulator Terdapat di korteks prefrontal, korteks
Premotor, korteks cingulated, korteks entorhinal, substantia nigra, hipotalamus, hippocampus, dan dentate gyrus; ginjal, kelenjar adrenal, ganglia simpatik, saluran pencernaan, pembuluh darah, jantung
Reseptor Dopamin Kelompok D2-like
A. Reseptor Dopamin D2 Terdapat di daerah caudate-putamen, nucleus accumbens,
olfactory tubercule, substantia nigra and ventral tegmental ; pada tingkat yang lebih rendah di septum, hypothalamus, dan cortex; kidney, kelenjar adrenal, sympathetic ganglia, saluran pencernaan, pembuluh darah dan jantung.
Menghambat pembentukan cAMP dengan mengaktivasi protein G inhibitor
Terlibat dalam mekanisme memori, reward dan mekanisme penguatan; pengatur gerakan, reseptor presynaptic menghambat gerak, reseptor postsynaptic mengaktifkan gerakan; pengaturan fungsi ginjal, tekanan darah, vasodilatasi, dan motilitas saluran pencernaan
B. Reseptor Dopamin D3
Konsentrasi di nucleus akumbens disamping ada didaerah lainnya seperti olfactory tubercle.
Pada sistem limbik fungsinya menerima masukan dopamin dari daerah tegmental ventral yang berhubungan dengan kognitif, emosional dan fungsi endokrin; regulasi gerakan; modulasi fungsi kognitif
C. Reseptor Dopamin D4
Terdapat di frontal korteks, disamping itu ada pada daerah lainnya seperti di amigdala, hippocampus, hipotalamus, globus pallidus, substantia nigra pars reticulata, dan thalamus; ginjal, kelenjar adrenal, ganglia simpatik, saluran pencernaan, pembuluh darah, jantung
Fungsinya mengaktivasi protein G inhibitor, fungsi reseptor dopamin D4 terlibat pada fungsi kognitif, pengaturan fungsi ginjal, tekanan darah, vasodilatasi, dan motilitas saluran pencernaan
Metabolisme dan Pengambilan Dopamin Kembali
Sumber: Mandal A, 2012
Hubungan dopamin dengan sindrom metabolikKesediaan DRD2 berhubungan dengan aktifitas metabolisme pada bagian prefrontal otak. Bagian-bagian otak ini terlibat dalam regulasi konsumsi makanan pada orang-orang dengan obesitas.
Obesitas dan adiksi memiliki masalah yang sama yaitu ketidakmampuan untuk menahan perilaku padahal penderita tahu itu akan membawa dampak negatif.
Sumber: Volkow et al., 2008
Polimorfisme Gen Reseptor Dopamin D2 dan reward deficiency sindrom
Kelainan pada system dopamin yang dapat menyebabkan seseorang tidak mampu untuk membuat keputusan yang baik dalam mengkonsumsi makanan yang diakibatkan kelainan regulasi dopamin pada orbitofrontal cortex, cingulate gyrus dan dorsolateral prefrontal cortex.
Kelainan ini dikenal dengan istilah “Reward Deficiency Syndrome”.
Sumber: Bowwirat et al., 2005
Reward deficiency syndrome
adalah ketidakmampuan untuk merasa puas yang ditandai dengan emosi yang tidak stabil, kecemasan, hipersensitivitas dan iritabilitas. Kelainan ini disebabkan ketidakmampuan senyawa-senyawa pemberi rasa senang dan kepuasan seperti serotonin, dopamin, norephinephrin dan gamma amino butyric acid (GABA) untuk bekerjasama menghasilkan rasa puasSumber:
Bowwirat et al., 2005
Reward deficiency syndrome
Metode Penelitian
penelitian deskriftif analitik → desain cross sectional
Isolasi DNA, amplifikasi DNA dan digesti enzim restriksi → di Laboratorium Terpadu Fakultas
Kedokteran Universitas Sumatera Utara, Medan
Jenis penelitian
Tempat penelitian
Bulan September-November 2014Waktu penelitian
penelitian
Pria 40 tahun yang memeriksa kesehatan di laboratorium klinik Spectrum Medan dan telah
diberi informasi
Populasi penelitian
Metode Penelitian
Besar sampel (Zx+Zβ)sn1=n2=2
(x1-x2)
n = besar sampelZx = nilai distribusi normal baku (tabel 2) pada α tertentu = 1,645 (α = 0,05)Zβ = Nilai distribusi normal baku (tabel 2) pada β tertentu = 0,842 (β = 0,2 satu arah) s = simpang baku baku kelompok testosteron = 139x1x2 = Perbedaan klinis yang diinginkan = 100 n = 23,9 - 24
Bila melihat tabel Cohen’s effect size, dengan perbedaan klinis (d) sebesar 80% dan nilai β = 0,2, maka akan didapat besar n adalah sebesar 26. Maka dari itu penelitian ini menggunakan n1=n2= 26 subjek
56,58
2
Variabel penelitian Variabel bebas: Polimorfisme TaqIA Gen dopamin reseptor 2 (DRD2)Variabel terikat: Sindrom Metabolik
Kriteria inklusi
1. Usia ≥ 40 tahun ; pria2. Lingkar pinggang ≥ 90 cm3. Kadar Trigliserida ≥ 150 mg/dl atau dalam pengobatan terhadap trigliserida tinggi4. Kadar HDL < 40 mg/dl atau dalam pengobatan HDL yang rendah5. Tekanan darah sistolik ≥ 130 mmHg atau diatolik ≥ 85 mmHg atau dalam sedang
pengobatan Hipertensi6. Kadar glukosa darah puasa ≥ 100 mg/dl atau sedang dalam pengobatan terhadap
hiperglikemi
Kriteria eksklusi
1. Menderita penyakit jantung, keganasan, prostat, hepatitis, merokok, alkoholik.
2. Sedang dalam menggunakan suplemen testosteron atau estradiol3. Sedang dalam pengobatan dalam aromaterase inhibitor
Definisi Operasional
No Variabel Definisi Operasional Skala
1 Sindrom Metabolik Menurut National Cholesterol Education Program
Adult Treatment Panel III (ATP III)
Ordinal
2 DRD2 TaqIA mutan Single nucleotide Polymorphism (SNP) berupa
subtitusi thymine (T) pada alel DRD2*A1 gen DRD2
Varian genotip heterozigot (T/C)
Varian genotip homozigot (T/T)
Nominal
4 DRD2 TaqIA wild
type
Kondisi normal dimana tidak ada polimorfisme pada
pada alel DRD2*A1 gen DRD2.
Varian genotip homozigot (C/C)
Nominal
Pelaksanaan penelitian Isolasi DNA
(Telah dilakukan sebelumnya)
Bahan & alat
1. Sarung tangan2. Pipet automatic 1000μL, 100μL3. Tabung Eppendorf 1.5 ml4. Sentrifus5. Vortex6. Tips steril berbagai ukuran7. Stopwatch 8. Kulkas9. Kertas label10. Pena tahan air11. Kit ekstraksi DNA (the the Wizard®
Genomic DNA purification Kit (Promega Corporation USA)
Cara KerjaIsolasi DNA
Label dan kode tabung Ependorf untuk sampel darah.
Darah EDTA disentrifus pada 3000 rpm selama 15 menit.
Pisahkan plasmanya, lalu ambil 300µL leukosit dan masukkan kedalam tabung Eppendorf 1,5 ml kemudian ditambah 900µL EL Buffer dan campur dengan cara
dibolak-balik secara perlahan.
Inkubasi selama 10 menit didalam kulkas lalu disentrifus pada kecepatan 13.000 rpm selama 3 menit.
Buang supernatan dengan hati-hati agar endapan tidak ikut terbuang dan tahapan 2-4 diulangi sampai 3x dan terlihat warna supernatan menjadi jernih dan endapan
berwarna putih
Cara KerjaIsolasi DNA
Setelah diperoleh endapan yang berwarna putih atau supernatan yang jernih, buang supernatan dan endapan divortex selama 20 detik.
Tambahkan 300µL Nuclei Lysis Solution dan campurkan dengan cara dibolak-balik.
Tambahkan 100µL Protein Precipitation, dan vortex selama 20 detik.
Campuran tersebut disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit.
Pindahkan supernatan kedalam tabung Eppendorf yang berisi 300µL isopropanolol, lalu dibolak-balik sampai terlihat benang-benang DNA.
Campuran disentrifugasi kembali pada kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit.
Buang supernatan dan tambahkan larutan etanol 70%.
Sentrifugasi kembali pada kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit.
Setelah proses sentrifugasi selesai, etanol diaspirasikan menggunakan pipet dan dikeringkan selama 1 jam.
Setelah kering, tambahkan 100µL DNA Rehidration Solution dan inkubasi pada suhu 4°C selama 1 malam. DNA dapat disimpan di freezer pada suhu -20°Csampai
proses PCR-RFLP dilaksanakan.
Cara KerjaIsolasi DNA
Pelaksanaan penelitian
Amplifikasi isolat DNA→Polymerase Chain Reaction
Alat & bahan 1. Mesin PCR/ Thermal Cycler 2. Mikropipet 3. Tabung PCR4. Tabung Eppendorf 1.5ml5. Tip steril berbgai ukuran6. mesin sentrifugassi7. PCR mix [Go Taq® Green Master Mix
(Promega,USA)] 8. DNA sampel 9. Primer forward MP3: 5’-
ACCCTTCCTGAGTGTCATCA (Macrogen)
10. Primer reverse MP3: 5’-ACGGCTGGCCAAGTTGTCTA (Macrogen)
11. kertas label & pena
Cara KerjaPCR
Label tabung PCR sesuai dengan kode
nomor sampel.
Buat campuran Master Mix untuk reaksi PCR dengan total volume 23 µL untuk
setiap sampel DNA yang terdiri dari 12,5µL Master Mix, 1µL masing-masing forward dan reverse primer, dan 8,5µL
nuclease free water.
Tambahkan 2µL isolat DNA sampel
pada campuran Master Mix dan
masukkan kedalam mesin PCR
(Thermal Cycler).
Gen DRD2 DNA sampel diamplifikasi →mesin PCR (Thermal Cycler) dengan suhu denaturasi inisial 95°C (5’) →32 siklus denaturasi pada
94°C (60’) →annealing 57°(45detik) →elongasi 72°C (45 detik) →tahap akhir pada72°C selama 10 menit. (Xiao, 2013)
hasil elektroforesis pada agarose 1,5% akan terlihat fragmen DNA sebesar 310bp. (Behravan, 2007)
Pelaksanaan penelitian
Digesti amplifikat DNA dengan Enzim Restriksi
Alat & bahan
1. Enzim TaqIA (New England, Biolabs® Inc) 1000 unit
2. NE Buffer3. Nuclease Free Water4. PCR product5. Tabung Eppendorf 1.5ml6. Mikropipet 7. Inkubator 8. Stopwatch 9. Kertas label & pena
Cara KerjaRestriksi Enzim
Label tabung PCR sesuai kode nomor sampel.
Buat campuran reaksi RFLP dengan total volume 10µL untuk setiap sampel yang terdiri dari 5µL PCR product, 0,2µL (4 unit) Enzim TaqIA sebanyak, 1µL NE Buffer dan 3,8 µL nuclease
free water.
Inkubasi selama 120 menit pada suhu 37°C didalam inkubator.
elekroforesis (agarose 1,5%) → terlihat 2 band pada homozigot Wildtype (TaqIA C/C) dengan ukuran 180bp dan 130 bp,3 band pada heterozigot mutan (TaqIA T/C) dengan ukuran 310bp,
180bp, dan 130bp, serta 1 band pada homozigot mutan (TaqIA T/T) ukuran 310bp. (Behravan, 2007)
Pelaksanaan penelitian
Visualisasi Hasil Restriksi dengan Elektroforesa Gel
Agarosa
Bahan & alat 1.Agarose, LE, Analytical Grade (Promega®) 100g2. Buffer Tris EDTA 1X3. Flask Beaker 250 ml4. Magnetic Hot Stirrer5. Timbangan digital6. Ethidium Bromide7. Alumunium foil8. Gel Casting Tray9. Gel Comb10. Gel Documentation11. 1kb DNA Ladder
Cara kerjaElektroforese Gel Agarose
Membuat gel : timbang 1,5gr agarose (100ml buffer Tris EDTA 1x.
Panaskan & aduk diatas magnetic hot stirrer
→mendidih &berwarna jernih.
Matikan pemanasnya, dan ditambahkan
ethidium bromide, dan diaduk kembali.
Cairan dituang ke Casting Tray dengan
Gel Comb dan biarkan sampai
mengeras.
Setelah gel mengeras, cabut Gel Comb perlahan-lahan.
Pipet 7µL DNA Ladder, produk PCR
dan Produk RFLP kedalam sumur-
sumur gel.
Catatan posisi sampel pada sumur-sumur
gel.
Jalankan elektroforesis selama
90 menit dengan tegangan 70 Volt.
Pindahkan gel kedalam Gel Documentation untuk analisa dan dokumentasi
hasil elektroforesis.
Kerangka operasional
26 individu dengan diagnosa sindrom metabolik
Pengumpulan data demografis pasien
Penyusunan DNA pasien & kontrol yang sudah ada
Genotyping DRD2 TaqIA
Wild type TaqIA C/C Mutan Mutan TaqIA T/T
Faktor resiko sindrom metabolik
Hubunganpolimorfisme DRD2 TaqIA dengan Sindrom metabolik
Analisis Data
Data akan dianalisa secara statistik →SPSS
Distribusi genotip & frekuensi alel akan diuji signifikansinya →X2-
test.
Distribusi genotip & frekuensi alel individu dengan skizofrenia dan
kontrol akan dianalisa menggunakan HWD
Perbedaan fitur klinis skizofrenia dan polimorfisme gen DRD2 TaqIA
akan diuji signifikansinya → X2-test (jenis kelamin) dan two-tailed Student’s test (usia, skor PANSS)
dengan menggunakan p<0.05 sebagai batas signifikan.