Post on 14-Dec-2015
description
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Air adalah materi esensial di dalam kehidupan. Tidak satupun mahluk hidup di dunia
ini yang tidak memerlukan dan tidak mengandung air. Air minum untuk sebagian besar
daerah tempat tinggal dan kota diperoleh dari permukaan sungai, kali, dan danau. Persediaan
air alamiah semacam itu, terutama kali dan sungai, kemungkinan besar tercemar oleh sampah
domestik, pertanian, dan industri. Banyak penduduk kota tidak menyadari bahwa air yang
mereka pakai itu telah digunakan sebelumnya. Penggunaan air kembali air merupakan suatu
proses alamiah, sebagaimana diperlihatkan dalam siklus hidrologis. Tetapi di masa kini ada
pandangan baru mengenai penggunaan kembali air, meningkatnya jumlah penduduk, adanya
kebutuhan air dalam jumlah banyak untuk keperluan industri maupun untuk irigasi daerah
pertanian, telah menciptakan tuntutan baru terhadap sumber air yang tersedia. Sejalan dengan
hal tersebut, telah timbul minat terhadap pengembangan metode-metode yang dapat diterima
untuk membuat air “bekas pakai” menjadi aman dan sesuai untuk digunakan kembali.
Kontaminan yang mencemari air digolongkan ke dalam tiga kategori: kimiawi, fisik,
dan hayati. Kontaminan-kontaminan tertentu dalam setiap kategori ini dapat mempunyai
pengaruh nyata terhadap kualitas air. Dalam bab ini yang akan dibahas ialah kategori hayati.
Dalam bidang mikrobiologi pangan, dikenal istilah bakteri indikator sanitasi. Dalam
hal ini pengertian pangan adalah pangan seperti yang tercantum pada Undang-Undang
Pangan No. 7 tahun 1996 yang mencakup makanan dan minuman (termasuk air
minum). Bakteri indikator sanitasi adalah bakteri yang keberadaannya dalam pangan
menunjukkan bahwa air atau makanan tersebut pernah tercemar oleh kotoran manusia.
Mengapa demikian? Karena bakteri-bakteri indikator sanitasi tersebut pada umumnya adalah
bakteri yang lazim terdapat dan hidup pada usus manusia. Jadi adanya bakteri tersebut pada
air atau makanan menunjukkan bahwa dalam satu atau lebih tahap pengolahan air atau
makanan tersebut pernah mengalami kontak dengan kotoran yang berasal dari usus manusia
dan oleh karenanya mungkin mengandung bakteri patogen lainnya yang berbahaya.
Karena mempunyai potensi untuk berlaku sebagai pembawa mikroorganisme
patogenik, air dapat membahayakan kesehatan dan kehidupan.
Bakteri yang paling banyak digunakan sebagai indikator sanitasi adalah E.coli,
karena bakteri ini adalah bakteri komensal pada usus manusia, umumnya bukan patogen
penyebab penyakit sehingga pengujiannya tidak membahayakan dan relatif tahan hidup di air
sehingga dapat dianalisis keberadaannya di dalam air yang notabene bukan merupakan
medium yang ideal untuk pertumbuhan bakteri. Keberadaan E. Coli dalam air atau makanan
juga dianggap memiliki korelasi tinggi dengan ditemukannya patogen pada pangan.
Bakteri golongan coliform merupakan bakteri yang dapat hidup hanya pada usus
hewan mamalia termasuk manusia. Penyebaran kotoran baik manusian dan hewan yang tidak
terkontrol dalam lingkungan perairan dapat menyebabkan lingkungan perairan tercemar oleh
bakteri ini. Untuk mengetahui jumlah sel bakteri golongan coliform yang terdapat dalam
sampel air, dilakukan metode Jumlah Perkiraan Terdekat atau Most Probable Number, untuk
menentukan apakah air yang digunakan masih sesuai peruntukannya sebagai air minum atau
tidah.
Tulisan ini akan membahas tentang mengapa bakteri-bakteri tersebut diuji sebagai
indikator air minum dan apa arti keberadaan bakteri-bakteri tersebut di dalam air minum
maupun makanan
1.2 Perumusan Masalah
Berdasarkan Uraian diatas, maka perumusan masalah yang diangkat dalam karya tulis
ini sebagai berikut
1. Bagaimana bakteri Coliform dapat menjadi parameter biologi kualitas air?
2. Apa yang dimaksud metode MPN?
3. Bagaimana Prinsip Kerja MPN?
4. Apa Kekurangan dari Metode MPN?
1.3 Tujuan
Tujuan dari karya tulis ini adalah
1. Mengidentifikasi bakteri coliform dan dampaknya bagi kualitas air
2. Mengetahui apa yang dimaksud metode MPN
3. Mengetahui prinsip kerja MPN
4. Mengetahui kekurangan metode MPN
1.4 Manfaat Penelitian
1. Sebagai pengetahuan dampak dari bakteri coliform dan metode analisis yang
digunakan untuk menghitung bakteri coliform dalam air
2. Untuk menambah wawasan dan pengalaman bagi penulis terutama bidang
bakteriologi.
3. Sebagai bahan acuan karya tulis selanjutnya pada objek yang sama.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Bakteri coliform
Bakteri coliform sebagai suatu kelompok dicirikan sebagai bakteri berbentuk batang
gram negative, tidak membentuk spora, aerobic, dan anaerobic fakultatif yang
memfermentasi laktosa dengan menghasilkan asam dan gas dalam waktu 48 jam pada suhu
35o C (Pelczar.et.al.,1988).
Coliform digunakan untuk menunjukkan kualitas air minum. Sejumlah besar bakteri
yang berbeda, termasuk: E-coli ,Enterobacter, Klebsiella, Serratia,Citrobacter
dan Proteus termasuk dalam kelompok Coliform total. Kelompok Coliform tinja itu
berdasarkan kelompok dari coliform total dan memiliki bakteri lebih sedikit.
Coliform tidak berubah warna atau rasa dari air. Satu-satunya cara untuk mengetahui
jika mereka hadir di dalam air adalah tes laboratorium. Mereka semua dapat dihancurkan oleh
air mendidih.
Istilah “mikroorganisme indikator” sebagaimana digunakan dalam analisis air
mengacu pada sejenis mikroorganisme yang kehadirannya di dalam air merupakan bukti
bahwa air tersebut terpolusi oleh bahan tinja dari manusia atau hewan berdarah panas.
Artinya terdapat peluang bagi berbagai macam organisme patogenik yang secara berkala
terdapat dalam saluran pencernaan, untuk masuk kedalam air tersebut.
Beberapa ciri penting suatu organisme indikator ialah:
1. Terdapat dalam air tercemar dan tidak ada dalam air yang tidak tercemar.
2. Terdalam dalam air bila ada pathogen
3. Jumlah mikroorganisme indikator berkolerasi dengan kadar polusi.
4. Mempunyai kemampuan bertahan hidup yang lebih besar daripada pathogen.
5. Mempunyai sifat yang seragam dan mantap.
6. Tidak berbahaya bagi manusia dan hewan.
7. Terdapat dalam jumlah yang lebih banyak daripada pathogen.
8. Mudah dideteksi dengan teknik-teknik laboratorium yang sederhana.
Terdapat 3 jenis bakteri yang dapat digunakan untuk menunjukkan adanya masalah
sanitasi yaitu Escherichia coli , kelompok Streptococcus ( Enterococcus ) fekal
dan Clostridium perfringens .
Diantara organisme-organisme yang dipelajari, yang hampir memenuhi semua
persyaratan suatu organism indicator yang ideal ialah Escherichia coli dan kelompok
bakteri coli lainnya. Bakteri-bakteri tersebut dianggap sebagai indikato polusi tinja yang
dapat diandalkan (Pelczar.et.al.,1988). Bakteri ini adalah bakteri komensal pada usus
manusia, umumnya bukan patogen penyebab penyakit sehingga pengujiannya tidak
membahayakan dan relatif tahan hidup di air sehingga dapat dianalisis keberadaannya di
dalam air yang notabene bukan merupakan medium yang ideal untuk pertumbuhan bakteri.
Keberadaan E. coli dalam air atau makanan juga dianggap memiliki korelasi tinggi dengan
ditemukannya patogen pada pangan.
E.coli adalah genus dan spesies dari kelompok Coliform tinja. E.coli hadir di usus
hewan berdarah panas dan manusia. Keberadaan E. coli dalam air minum di hampir semua
kasus menandakan polusi kotoran segar. Sebagian besar E.coli strain tidak berbahaya,
(kecuali strain E. coli 0157: H7) tetapi kehadiran E.coli dalam air menunjukkan probabilitas
tinggi mikroorganisme penyebab penyakit.
Mikroorganisme selain bakteri coli yang dianggap sebagai bakteri pengganggu dalam
air karena menimbulkan rasa, bau, dan warna selain itu dapat membentuk endapan
persenyawaan tak dapat larut di dalam pipa-pipa sehingga mengurangi atau menyumbat
aliran air. Aksi merusak pada beberapa mikroorganisme adalah sebagai berikut:
a. Bakteri pembuat lender: menghasilkan keadaan air yang berlendir
b. Bakteri besi: mengubah persenyawaan besi yang dapat larut menjadi bentuk yang tak
dapat larut yang akan menghambat aliran air dalam pipa
c. Bakteri sulfur: membentuk asam sulfat dengan hydrogen sulfide, yang dapat membuat air
menjadi sangat asam san berbau tidak enak.
d. Algae: menyebabkan kekeruhan, perubahan warna, serta baud an rasa tidak enak
(pelczar.et.al.,1988)
2.2 Metode Analisis Bakteri Coliform
Perhitungan jumlah mikroba dapat dilakukan dengan perhitunganlangsung maupun
tidak langsung. Perhitungan secara langsung dapat mengetahui beberapa jumlah
mikroorganisme pada suatu bahan pada suatu saat tertentu tanpa memberikan perlakuan
terlebih dahulu, sedangkan jumlah organisme yangdiketahui dari cara tidak langsung terlebih
dahulu harus memberikan perlakuan tertentu sebelum dilakukan perhitungan. Perhitungan
secara langsung, dapat dilakukan dengan beberapa cara antara lain adalah dengan membuat
preparat darisuatu bahan ( preparat sederhana diwarnai atau tidak diwarnai ) dan
penggunaanruang hitung (counting chamber ). Sedangkan perhitungan cara tidak langsung
hanya untuk mengetahui jumlah mikroorganisme pada suatu bahan yang masihhidup saja
(viabel count). Dalam pelaksanaannya, ada beberapa cara yaitu : perhitungan pada cawan
petri (total plate count /TPC), perhitungan melalui pengenceran, perhitungan jumlah terkecil
atau terdekat (MPN methode), dankalorimeter (cara kekeruhan atau turbidimetri)
(Dwidjoseputro, 1994).
Perhitungan secara tidak langsung ada beberapa cara yaitu : perhitungan pada cawan
petri (total plate count / TPC), perhitungan melalui pengenceran, perhitungan jumlah terkecil
atau terdekat (MPN methode), dan kalorimeter (cara kekeruhan atau turbidimetri). Metode
MPN terdiri dari tiga tahap, yaitu uji pendugaan (presumtive test), uji konfirmasi (confirmed
test), dan uji kelengkapan (completed test). Dalam uji tahap pertama, keberadaan coliform
masih dalam tingkat probabilitas rendah; masih dalam dugaan. Uji ini mendeteksi sifat
fermentatif coliform dalam sampel. Metode perhitungan MPN sering digunakan dalam
pengamatan untuk menghitung jumlah bakteri yang terdapat di dalam tanah seperti
Nitrosomonas dan Nitrobacter. Kedua jenis bakteri ini memegang peranan penting dalam
meningkatkan pertumbuhan dan produksi tanaman, sehubungan dengan kemampuannya
dalam mengikat N2 dari udara dan mengubah ammonium menjadi nitrat (Lim, 1998).
Metode MPN biasanya biasanya dilakukan untuk menghitung jumlah mikroba di dalam
contoh yang berbentuk cair, meskipun dapat pula digunakan untuk contoh berbentuk padat.
Perhitungan jumlah suatu bakteri dapat melalui berbagai macam uji seperti uji kualitatif
koliform yang secara lengkap terdiri dari tiga tahap yaitu uji penduga (uji kuantitatif, bisa
dengan metode MPN), uji penguat dan uji pelengkap. Waktu, mutu sampel, biaya, tujuan
analisis merupakan beberapa faktor penentu dalam uji kualitatif koliform. Bakteri koliform
dapat dihitung dengan menggunakan metode cawan petri (metode perhitungan secara tidak
langsung yang didasarkan pada anggapan bahwa setiap sel yang dapat hidup akan
berkembang menjadi satu koloni yang merupakan suatu indeks bagi jumlah organisme yang
dapat hidup yang terdapat pada sampel (Plummer, 1987).
Output metode MPN adalah nilai MPN. Nilai MPN adalah perkiraan jumlah unit
tumbuh (growth unit) atau unit pembentuk koloni (colony forming unit) dalam sampel.
Namun, pada umumnya nilai MPN juda diartikan sebagai perkiraan jumlah individu bakteri.
Satuan yang digunakan, umumnya per 100 mL atau per gram. Metode MPN memiliki limit
kepercayaan 95 persen sehingga pada setiap nilai MPN, terdapat jangkauan nilai MPN
terendah dan nilai MPN tertinggi (Lim, 1998).
Menurut Plummer (1987), ada beberapa cara yang dapat digunakan untuk menghitung
atau mengukur jumlah jasad renik di dalam suatu suspensi atau bahan, yang dapat dibedakan
atas beberapa kelompok yaitu:
a. Perhitungan jumlah sel
1. Hitungan mikroskopik
2. Hitungan cawan
3. MPN (Most Probable Number)
b. Perhitungan massa sel secara langsung
1. Volumetrik
2. Gravimetrik
3. Kekeruhan (turbidimetri)
c. Perhitungan massa sel secara tidak langsung
1. Analisis komponen sel
2. Analisis produk katabolisme
3. Analisis konsumsi nutrient
Metode MPN biasanya dilakukan untuk menghitung jumlah mikroba di dalam
contoh yang berbentuk cair, meskipun dapat pula digunakan untuk contoh berbentuk padat
dengan terlebih dahulu membuat suspensi 1:10 dari contoh tersebut. Metode MPN digunakan
medium cair di dalam tabung reaksi, dimana perhitungannya dilakukan berdasarkan jumlah
tabung yang positif yaitu yang ditumbuhi oleh jasad renik setelah inkubasi pada suhu dan
waktu tertentu. Pengamatan tabung yang positif dapat dilihat dengan mengamati timbulnya
kekeruhan atau terbentuknya gas di dalam tabung kecil (tabung Durham) yang diletakkan
pada posisi terbalik, yaitu untuk jasad renik pembentuk gas (Fardiaz, 1993).
Untuk metode MPN (most probable number) digunakan medium cair dalam wadah
berupa tabung reaksi, perhitungan di lakukan berdasarkan jumlah tabung yang positif yaitu
tabung yang mengalami perubahan pada mediumnya baik itu berupa perubahan warna atau
terbentuknya gelembung gas pada dasar tabung durham. Pada metode perhitungan MPN ini
digunakan bentuk tiga seri pengenceran, yang pertama 10-1, 10-2, dan 10-3. Kemudian dari
hasil perubahan tersebut dicari nilai MPN nya pada tabel nilai MPN, dan untuk jumlah
bakterinya maka digunakan rumus (Gobel, 2008).
Metode MPN merupakan uji deretan tabung yang menyuburkan pertumbuhan
koliform sehingga diperoleh nilai untuk menduga jumlah koliform dalam sampel yang diuji.
Uji positif akan menghasilkan angka indeks. Angka ini disesuaikan dengan tabel MPN untuk
menentukan jumlah koliform dalam sampel (Pakadang, S, 2010).
Bakteri koliform adalah bakteri indikator keberadaan bakteri patogenik lain dengan
kata lain merupakan bakteri indikator sebagai tanda bahwa adanya pencemaran bakteri
patogen. Penentuan koliform fecal menjadi indikator pencemaran dikarenakan jumlah
koloninya pasti berkorelasi positif dengan keberadaan bakteri patogen. Keuntungan
mendeteksi koliform adalah jauh lebih murah, cepat, dan sederhana daripada mendeteksi
bakteri patogenik lain. Koliform merupakan suatu grup bakteri yang digunakan sebagai
indikator adanya pencemaran dan kondisi sanitasi yang tidak baik terhadap air, makanan,
susu dan produk-produk susu. Pada saat perhitungan koloni, apabila jumlah koloni yang di
temukan kurang dari standart yang telah di tetapkan, maka suatu sampel bisa di katakan
murni (Umbreit, 1960).
Beberapa jenis bakteri selain coliform juga memiliki sifat fermentatif, sehingga
diperlukan uji konfirmasi untuk mengetes kembali kebenaran adanya coliform dengan
bantuan medium selektif diferensial. Uji kelengkapan kembali meyakinkan hasil tes uji
konfirmasi dengan mendeteksi sifat fermentatif dan pengamatan mikroskop terhadap ciri-ciri
coliform: berbentuk batang, gram negatif, tidak-berspora. Bakteri coliform adalah golongan
bakteri intestinal, yaitu hidup dalam saluran pencernaan manusia. Bakteri coliform adalah
bakteri indicator keberadaan bakteri patogenik lainnya. Lebih tepatnya, sebenarnya bakteri
coliform fecal adalah bakteri indicator adanya pencemaran bakteri pathogen. Penentuan
coliform fekal menjadi indikator pencemaran dikarenakan jumlah koloninya pasti berkorelasi
positif dengan keberadaan bakteri pathogen. Selain itu, mendeteksi coliform jauh lebih
murah, cepat dan sederhana daripada mndeteksi bakteri patogenik lain (Lim, 1998).
Salah satu anggota kelompok coliform adalah E.coli. Karena E.coli adalah bakteri
coliform yang ada pada kotoran manusia, maka E.coli sering disebut sebagai coliform fekal.
Pengujian coliform jauh lebih cepat jika dibandingkan dengan uji E.coli karena hanya
memerlukan uji penduga yang merupakan tahap pertama uji E.coli (Penn, 1991).
Bakteri coliform merupakan parameter mikrobiologis terpenting bagi kualitas air
minum. Kelompok bakteri coliform, antara lain Eschericia coli, Enterrobacter aerogenes,
dan Citrobacter fruendi. Keberadaan bakteri di dalam air minum itu menunjukkan tingkat
sanitasi rendah. Keberadaan bakteri ini juga menunjukkan adanya bakteri pathogen lain
misalnya, Shigella, yang menyebabkan diare hingga muntaber (Lim, 1998).
BAB III
PEMBAHASAN
3.1 Sejarah perkembangan MPN
Metode MPN muncul sekitar awal abad 20 sehingga dikenal sudah sangat lama di
dalam ilmu mikrobiologi. Estimasi akurat dari tabel MPN di publikasikan oleh Mc Crady
pada tahun 1915 kemudian dasar statistik dari metode MPN dikemukakan oleh Halvorson
dan Ziegler (1933), Eisenhart dan Wilson (1943) dan Cochran (1950). Pada tahun 1957
Woodward menyarankan tentang pengabaian hasil positif (banyak tabung positif pada
pengenceran tinggi dan sebaliknya) yang dapat meningkatkan kesalahan laboratorium dalam
tabel MPN. Kemudian De Mann pada tahun 1983 mempublikasikan tentang metode
perhitungan tingkat kepercayaan (convidence interval) dalam tabel MPN. Sampai sekarang
metode MPN telah menjadi salah satu metode standard untuk menghitung jenis Coliform,
Fecal Coliform, Escherichia coli, dan S. aureus.
3.2 Prinsip metode MPN
MPN adalah suatu metode perhitungan mikroorganisme berdasarkan data kualitatif
hasil pertumbuhan mikroorganisme pada medium cair spesifik dalam seri tabung untuk
memperoleh kisaran data kuantitatif jumlah mikroorganisme tersebut (MPN/ml (g)). MPN
merupakan suatu metode uji pengenceran bertingkat (serial dilution) untuk mengukur
konsentrasi mikroorganisme target dengan perkiraan. SNI 01-2332.1 (2006:7)
mendeskripsikan MPN sebagai metode untuk menghitung jumlah mikroba dengan
menggunakan medium cair pada tabung reaksi yang pada umumnya setiap pengenceran
menggunakan 3 atau 5 seri tabung dan perhitungan yang dilakukan merupakan tahap
pendekatan secara statistik.
Prinsip utama metode ini adalah mengencerkan sampel sampai tingkat tertentu
sehingga didapatkan konsentrasi mikroorganisme yang pas/sesuai dan jika ditanam dalam
tabung menghasilkaan frekensi pertumbuhan tabung positif “kadang-kadang tetapi tidak
selalu”. Semakin besar jumlah sampel yang dimasukkan (semakin rendah pengenceran yang
dilakukan) maka semakin “sering” tabung positif yang muncul. Semakin kecil jumlah sampel
yang dimasukkan (semakin tinggi pengenceran yang dilakukan) maka semakin “jarang”
tabung positif yang muncul. Semua tabung positif yang dihasilkan sangat tergantung dengan
probabilitas sel yang terambil oleh pipet saat memasukkannya ke dalam media. Oleh karena
itu, homogenisasi sangat mempengaruhi metode ini. Kombinasi kemunculan positif (ya) atau
negatif (tidak) ini menggambarkan perkiraan konsentrasi mikroorganisme pada sampel
sebelum diencerkan. Perubahan dari data positif atau negatif sampai menghasilkan angka
dilakukan dengan proses perhitungan statistik. Jadi nilai MPN adalah suatu angka yang
menggambarkan jumlah mikroorganisme yang memiliki kemungkinan paling tinggi.
Gambar 3.1 Kombinasi tabung positif yang didapat adalah 3 tabung positif dari pengenceran
1/10, 2 tabung positif darimpengenceran 1/100 dan 1 tabung positif dari pengenceran 1/1000.
Angka MPN yang dihasilkan setelah dicocokkan dengan tabel adalah 150 MPN/g.
Asumsi yang diterapkan dalam metode MPN adalah :
- Bakteri terdistribusi sempurna dalam homogenat sampel.
- Sel bakteri terpisah-pisah secara individual, tidak dalam bentuk rantai atau kumpulan
(bakteri Coliform termasuk E. coliterpisah sempurna tiap selnya dan tidak membentuk
rantai).
- Media yang dipilih telah sesuai untuk pertumbuhan bakteri target dalam suhu dan
waktu inkubasi tertentu sehingga minimal satu sel hidup mampu menghasilkan tabung
positif selama masa inkubasi pada media tersebut.
- Jumlah yang didapatkan menggambarkan bakteri yang hidup (viable) saja . sel yang
terluka dan tidak mampu menghasilkan tabung positif tidak akan terdeteksi.
- Setiap individu tabung memiliki data yang berdiri sendiri (independen).
Metode MPN dinilai berdasarkan perkiraan unit tumbuh (Growth Unit / GU) seperti
CFU, bukan dari sel individu. Meskipun begitu baik nilai CFU atau MPN dapat
menggambarkan seberapa banyak sel individu yang tersebar dalam sampel. FDA BAM
appendix 2 (2001) menyatakan bahwa jika dalam MPN menggunakan target mikroorganisme
yang dalam preparasi sampel dan pengencerannya tetap menunjukkan sel yang tidak terpisah
dan berkelompok, maka nilai MPN sebaiknya dapat dinyatakan dalam perkiraan GU (Growth
Units) atau CFU (Colony Forming Units). Namun sebagian besar metode MPN digunakan
untuk menghitung mikroorganisme target yang benar-benar terpisah individunya seperti
Coliform dan E. coli.
Pemilihan media sangat berpengaruh terhadap metode MPN yang dilakukan.
Umumnya media yang digunakan mengandung bahan nutrisi khusus untuk pertumbuhan
bakteri tertentu. Misalnya dalam mendeteksi kelompok Coliform dapat menggunakan media
Brilliant Green Lactose 2% Bile (BGLB) broth. Di dalam media ini mengandung lactose dan
garam empedu (bile salt) yang hanya mengizinkan untuk tumbuh. Jika terdapat
ketidaksesuaian jenis media dan bakteri yang diinginkan maka metode ini akan menghitung
bukan bakteri yang dituju. Untuk menghitung Coliform pada tahap pendugaan umumnya
menggunakan Lauryl Sulphate Tryptose (LST) broth, sedangkan untuk menghitung E.coli
pada tahap konfirmasi diperlukan media EC (Escherichia coli) broth.
USDA/FSIS (2008:1) menyebutkan bahwa nilai MPN sangat berguna untuk
menentukan jumlah mikroorganisme dengan konsentrasi rendah (<100/g). Metode ini
umumnya dipakai untuk menganalisa susu, pangan, air atau tanah yang dimana pada jenis
sampel ini terdapat kemungkinan bahan partikulat sampel mampu mengganggu pertumbuhan
koloni pada agar.
Beberapa kelebihan metode MPN yang diambil berdasarkan Oblinger dan Korburger
(1975:541) adalah :
(1) Akurasi dapat ditingkatkan dengan memperbanyak tabung yang digunakan setiap
pengencerannya.
(2) Ukuran (volume) sampel yang cukup besar (dibanding plate count).
(3) Sensitivitas umumnya cenderung lebih baik pada konsentrasi mikroorganisme yang
sedikit daripada plate count.
(4) Recovery umumnya lebih baik karena menggunakan media cair, tetapi tetap tergantungm
partikel sampel yang mungkin dapat mengganggu.
(5) Jika medium spesifik yang sesuai dengan pertumbuhan bakteri target dapat dibuat maka
perkiraan perhitungan MPN dapat dilakukan berdasarkan medium tersebut.
3.3 Cara kerja metode MPN
MPN umumnya dilakukan tidak hanya sampai menghasilkan tabung-tabung positif
saja, melainkan dilanjutkan dengan berbagai macam uji untuk mengkonfirmasi tabung positif.
Prosedur konfirmasi tersebut bertujuan untuk meyakinkan bahwa data positif tersebut
memang ditimbulkan oleh mikroorganisme target. Meskipun media awal yang dipakai di
dalam tabungsudah berfungsi sebagai media selektif. Terdapat tiga tahap dalam prosedur
lengkap metode MPN yaitu uji penduga (presumptive test), uji penegasan (confirmed test)
dan uji pelengkap (completed test).
Uji penduga dilakukan untuk memperoleh kombinasi tabung positif awal, kemudian
uji penegasan digunakan untuk memastikannya. Nilai akhir yang diambil adalah dari hasil uji
penegasan dan pelengkap sehingga dimungkinkan mengubah kombinasi tabung yang
diperoleh pada uji penduga.
Umumnya hanya uji E.coli saja yang sampai tahap uji pelengkap. Uji E.coli yang
sesuai standar harus dilakukan sampai tahap akhir yang memerlukan waktu berhari-hari. Jika
analisa tidak dilakukan sampai akhir maka belumdapat dinyatakan pasti bahwa tabung positif
tersebut mengandung E. coli.
Berikut adalah Metode MPN Coliform, Fecal Coliform dan E. coli untuk analisa
sampel pangan yang diinterpretasikan berdasarkan FDA BAM Ch.4 (2002).
3.4 Uji penduga
Buat pelarut Butterfield’s buffered phosphate dengan melarutkan 34.0 g KH2PO4
dalam 500 ml H2O lalu atur pH 7.2 dengan 1 M NaOH.
Larutkan dengan akuades sampai 1L, stok pelarut simpan dalam refrigerator. Larutkan
1,25 ml dari stok pelarut ke dalam 1L H2O lalu sterilisasi menggunakan autoklaf.
Cairkan sampel beku pada suhu 2-5°C selama ≤18 jam atau suhu 45°C selama 15
menit pada waterbath dengan agitasi. Timbang secara aseptis sebanyak 50g.
Masukkan sampel ke dalam kontainer blender yang telah disterilisasi. Tambahkan 450
ml butterfield phosphate diluent (dihitung pengenceran pertama ; 50:450 atau 1:9).
Kemudian hancurkan selama 2 menit. Volume total yang terdapat pada wadah blender
harus menutupi pisau blender. Jika sampel tersedia kurang dari 50g (x) maka
pengenceran pertamanya adalah x.9 ml.
Ambil 1 ml homogenat sampel (pengenceran 1/10) dari preparasi sampel lalu
masukkan ke 9 ml diluent (pengenceran 1/100). Ambil 1 ml dari tabung pengenceran
1/100 untuk dimasukkan ke 9 ml diluent (pengenceran 1/1000). Pada setiap transfer
sampel yang dilakukan, tabung dikocok berayun 25 kali dengan ketinggian ayunan
pengocokan 30 cm atau vorteks selama 7 detik.
Siapkan 3 seri tabung MPN berisi masing-masing 10 ml Lauryl Sulphate Tryptose
(LST) broth dengan tabung durham didalamnya (total 9 tabung yang dibagi menjadi 3
seri).
Masukkan 1 ml dari pengenceran 1/10 ke 3 tabung pertama, masukkan 1 ml dari
pengenceran 1/100 ke 3 tabung kedua, dan masukkan 1 ml dari pengenceran 1/1000
ke 3 tabung ketiga.
Inkubasi semua tabung pada suhu 35±0,5ºC selama 24±2 jam. Amati terbentuknya
gas pada tabung durham lalu catat hasilnya. Inkubasi lagi menjadi 48±3 jam tabung
yang tidak terbentuk gas.
Interpretasi hasil positif jika media keruh dan terbentuk gas (harus kedua-duanya)
pada inkubasi 24±2 jam atau 48±3 jam. Interpretasi hasil negatif jika tidak terdapat
pertumbuhan dan tidak terbentuk gas. Gas yang diproduksi dapat terjebak dalam
tabung durham ataupun berbentuk buih (effervescence) yang timbul saat dikocok.
Perkiraan konsentrasi berdasarkan tabel yang didapat adalah nilai dugaan adanya
Coliform, Fecal Coliform atau E.coli.
3.5 Uji penegasan untuk Coliform
Siapkan tabung berisi 10 ml Brilliant Green Lactose Bile (BGLB) broth dengan
tabung durham didalamnya.
Masukkan satu ulasan inokulum dari tiap tabung LST broth yang menghasilkan uji
positif ke dalam tiap tabung BGLB broth.
Inkubasi semua tabung pada suhu 35±0,5 C selama 48±3 jam.
Interpretasi hasil positif jika media keruh dan terbentuk gas (harus kedua-duanya).
Interpretasi hasil negatif jika tidak terdapat pertumbuhan dan tidak terbentuk gas.
Tentukan jumlah Coliform (MPN/g atau ml) dengan menghitung tabung positif
kemudian cocokkan dengan tabel MPN (tabel 10) berdasarkan dari perhitungan uji
dugaan. Perkiraan konsentrasi berdasarkan tabel yang didapat adalah nilai penegasan
adanya Coliform.
3.6 Uji penegasan untuk Fecal Coliform dan E.coli
Siapkan berisi masing-masing 10 ml EC broth dengan tabung durham didalamnya
Masukkan satu ulasan inokulum dari tiap tabung LST broth yang menghasilkan uji
positif ke dalam tiap tabung EC broth.
Inkubasi semua tabung pada suhu 45,5ºC (Fecal Coliform untuk pangan dilakukan
pada 45,5±0,2ºC, uji air, kerangkerangan 44,5±0,2ºC) selama 24±2 jam. Amati
terbentuknya gas pada tabung durham lalu catat hasilnya. Inkubasi lagi menjadi 48±2
jam tabung yang tidak terbentuk gas.
Interpretasi hasil positif jika media keruh dan terbentuk gas (harus kedua-duanya).
Interpretasi hasil negatif jika tidak terdapat pertumbuhan dan tidak terbentuk gas.
Tentukan jumlah Fecal Coliform (MPN/g atau ml) dengan menghitung tabung
positif kemudian cocokkan dengan tabel MPN (tabel 10) berdasarkan dari perhitungan
uji dugaan. Perkiraan konsentrasi yang didapat berdasarkan tabel adalah nilai
penegasan adanya Fecal Coliform dan E. coli. Untuk mengetahui apakah pada tabung
EC broth adalah Fecal Coliform atau E.coli maka dilanjutkan uji penegasan untuk E.
coli.
3.7 Uji pelengkap untuk E.coli
Tabung positif yang mengandung gas dari EC broth dikocok kemudian inokulasikan
ke dalam cawan L-EMB agar dan inkubasi pada 35±0,5 C selama 18-24 jam.
Interpretasikan sebagai dugaan E.coli jika memiliki ciri-ciri koloni datar, berwarna
hitam di tengah koloni dengan atau tanpa warna kilat logam (metallic sheen).
Inokulasikan sampai 5 koloni tersangka ke PCA dan inkubasi pada 35±0,5 C selama
18-24 jam untuk kultur uji penegasan selanjutnya.
Satu dari lima koloni yang teridentifikasi positif E. coli cukup untuk menyatakan
bahwa tabung EC broth tersebut terkonfirmasi positif E. coli.
Uji kultur dugaan dengan uji pewarnaan gram dan morfologi sel. Semua kultur yang
mencirikan gram negatif dan sel berbentuk batang pendek selanjutnya diuji dengan
tahap selanjutnya. Inokulasikan kembali kultur dugaan tersebut ke mediaLST lalu
inkubasi pada 35±0,5ºC selama 48±2 jam untuk mengkonfirmasi ulang terbentuknya
gas. Kemudian kultur
sangkaan yang sama dilakukan uji IMViC.
Uji IMViC (uji produksi indole, uji Methyl Red, uji Voges-Proskauer, uji penggunaan
Citrate).
- Uji produksi indole; uji ini akan membedakan bakteri yang mampu atau tidak
mampu memproduksi indole dari Tryptone. Inokulasikan kultur sangkaan ke
Tryptone broth lalu inkubasi pada 35±0,5ºC selama 24±2 jam. Tambahkan 0,2-
0,3 ml reagen Kovac’s. Jika terbentuk cincin merah pada bagian atas tabung maka
bakteri dapat memproduksi indol (indol positif) dan bila terbentuk cincin kuning
maka disimpulkan sebagai indol negatif. Jika kultur dugaan adalah E. coli maka
seharusnya menunjukkan hasil positif dan sel berbentuk batang pendek.
- Uji Voges-Proskauer; uji ini dapat membedakan bakteri yang mampu
memproduksi acetylmethyl-carbinol atau tidak. Senyawa tersebut dideteksi
dengan penambahan potassium hydroxide yang akan membentuk diacetyl yang
bereaksi dengan peptone menghasilkan warna merah. Inokulasikan kultur
sangkaan ke MR-VP broth lalu inkubasi pada 35±0,5ºC selama 48±2 jam. Setelah
waktu 24 jam pindahkan 1 ml ke dalam tabung kosong (13×100 mm) lalu
tambahkan 0,6 ml larutan larutan α-naphthol dan 0.2 ml 40% KOH. Tambahkan
beberapa kristal creatine. Kocok kemudian biarkan selama 2 jam. Uji VP
dinyatakan positif bila warna
- berubah menjadi merah. Jika kultur dugaan adalah E. coli maka seharusnya
menunjukkan hasil tidak ada perubahan warna /negatif.
- Uji Methyl Red; uji ini akan membedakan bakteri yang mampu memproduksi
asam dari glukosa dan Methyl Red sebagai indikator penurunan pH .Inkubasi
kembali tabung MRVP pada 35±0,5 C selama 48±2 jam. Tambahkan 5 tetes
larutan Methyl Red ke dalam tabung MR-VP broth. Terbentuknya warna merah
menandakan hasil uji positif, sedangkang berwarna kuning menunjukkan hasil
- negatif. Jika kultur dugaan adalah E. coli maka seharusnya menunjukkan hasil
positif.
- Uji penggunaan Citrate ; uji ini akan membedakan bakteri yang mampu
menggunakan Citrate sebagai sumber nutrisinya. Inokulasikan kultur sangkaan ke
medium Koser’s Citrate broth lalu inkubasi pada 35±0,5ºC selama 96 jam. Reaksi
positif jika terdapat pertumbuhan media yang berwarna hijau berubah menjadi
biru, reaksi negatif jika tidak ada pertumbuhan dan media tetap hijau. Jika kultur
dugaan adalah E. coli maka seharusnya menunjukkan hasil tidak ada perubahan
warna / negatif.
3.8 Pemilihan jumlah seri tabung MPN
Telah diketahui bahwa MPN memiliki beberapa pilihan cara dalam perhitungannya
berdasarkan jumlah tabung setiap serinya sesuai tabel yang tersedia yaitu 3, 5, 8 dan 10 seri
tabung. Inti dari metode MPN adalah mendapatkan tingkat pengenceran yang kadang-kadang
tapi tidak selalu mengandung mikroorganisme hidup. Alasan inilah yang
sangatmempengaruhi pemilihan jumlah seri tabung pada metode MPN tersebut. Menurut ISO
7218 (2007:45) pemilihan konfigurasi seri tabung ini juga dipengaruhi oleh jumlah
mikroorganisme yang diperkiraan, persyaratan peraturan yang berlaku, presisi yang
dibutuhkan dan pertimbangan praktik lainnya.
Sistem metode MPN yang paling banyak digunakan adalah Symmetric dilution system
yaitu metode MPN yang menggunakan banyak tabung secara paralel setiap pengencerannya.
Semakin banyak jumah tabung yang digunakan setiap serinya maka semakin presisi nilai
yang dihasilkan. Disarankan untuk menggunakan 5 atau lebih tabung setiap serinya jika
menginginkan presisi yang lebih baik (ISO 7218, 2007:45). FDA BAM Ch.4 (2002)
menyatakan bahwa 3 seri tabung umumnya digunakan untuk sampel pangan, 5 seri tabung
untuk sampel air dan kerang, sedangkan 10 seri tabung dipakai untuk menguji air dalam
kemasan (bottled water) atau sampel lain yang diperkirakan jarang terkontaminasi
(mengandung sedikit mikroorganisme).
UNEP/WHO (1996:7) menyarankan jumlah sampel yang diinokulasikan dan jumlah
seri tabung yang dipakai untuk analisa berbagai jenis sampel air pada tabel berikut.
Tabel 3.1 Tabel seri tabung dan volume sampel yang digunakan untuk analisa MPN berbagai
jenis sampel air (UNEP/WHO,1996:7)
Menurut USDA/FSIS (2008:3) untuk mengantisipasi jika jumlah mikroorganisme
dalam sampel >10 Growth Unit/g (ml) makadisarankan menanam sampel 10 ml pada 3 seri
tabung, 1 ml pada 3 seri tabung lalu selanjutnya dilakukan pengenceran sampai 1/10 dan tiap
pengenceran ditanam 1 ml pada 3 seri tabung.
Gambar 3.2 Skema penanaman metode MPN yang disarankan oleh USDA/FSIS (2008:3). Jika mengikuti petunjuk ini maka kemungkinan memperoleh tabung positif yang “kadang-
kadang tapi tidak selalu” semakin besar.
3.9 Peluang dalam metode MPN
FDA BAM appendiks 2 (2001) memberikan informasi bahwa hasil dari metode MPN
memiliki derajat kepercayaan karena proses perhitungannya merupakan hasil dari peluang.
Arti dari 95% confidence intervals dalam tabel MPN adalah kemungkinan paling tidak 95%
rentang derajat kepercayaan dari hasil akhir adalah sesuai dengan konsentrasi yang
sebenarnya. Di dalam tabel MPN terdapat kolom derajat kepercayaan (confidence interval)
95% dengan batas bawah (lower limit) dan batas atas (upper limit). Angka ini menunjukkan
batas derajat kepercayaan tersebut. Nilai indeks MPN dan derajat kepercayaan dalam tabel
dinyatakan dalam dua digit signifikan, misalnya nilai 400 adalah hasil pembulatan antara 395
dan 405. Tidak diberikannya batas nilai MPN untuk semua tabung positif (3-3-3) yang
ditandai dengan tanda “>” adalah menggambarkan konsentrasi lebih dari nilai MPN untuk
kombinasi paling tidak ada satu tabung negatif pada pengenceran tertinggi (3-3-2).
Ketidakpastian ini juga dijumpai pada indeks MPN untuk semua kombinasi tabung negatif.
Tabel 3.2 Contoh potongan tabel MPN 5 seri tabung dengan inokulum 0,1g (ml), 0,01 g (ml)
dan 0,001 g (ml).
Untuk memahami peranan peluang dalam mendistribusikan sel sehingga
menghasilkan tabung positif maka jumlah tabung positif (5-3-1) pada tabel dicoba untuk
dirunut dan diilustrasikan kembali dalam proses penanamannya pada gambar berikut
(dianggap bahwa nilai MPN/ml sama dengan ‘sel’/ml (GU/ml)). Namun perlu diingat, jumlah
sel yang terambil tidak selalu seperti itu, semuanya adalah peluang dan angka yang didapat
adalah angka yang kemungkinannya paling besar.
Gambar 3.3 Ilustrasi peluang saat penanaman dan pengenceran pada metode MPN. Satu titik menggambarkan satu ‘sel’ atau growth unit.
3.10 Persyaratan pemilihan kombinasi tabung positif dan pelaporannya
Seperti metode hitungan cawan, di dalam MPN juga memiliki konsep pemilihan
jumlah yang masuk dalam ‘kisaran hitung’ yaitu berdasarkan frekuensi kemunculan tabung
positif yang sebaiknya kadang-kadang tapi tidak selalu. Kombinasi tersebut dipilih dari tiga
tingkat pengenceran tertentu yang disebut tiga tingkat pengenceran yang signifikan. Syarat
umum yang dipakai dalam pemilihan tabung positif adalah :
- Pilih pengenceran yang memiliki kombinasi tabung kategori 1, jika tidak ada maka
pilih kombinasi dari kategori berikutnyayang lebih rendah berturut-turut (2 dan 3)
(tabel 3.2).
Atau dengan ketentuan :
- Pilih pengenceran terendah yang tidak semua tabung menghasilkan tabung positif.
- Pilih pengenceran tertinggi yang paling tidak memiliki satu tabung positif.
- Pilih semua pengenceran diantaranya.
- Kalikan setiap seri tabung yang dipilih dengan pengenceran yang diambil.
Misalnya : dari inokulum 1, 0,1, 0,01, 0,001 dan 0,0001 menghasilkan kombinasi tabung
positif 5-4-3-1-0 maka dipilih 5-4-3-1-0 bukan 5-4-3-1-0 atau bukan 5-4-3-1-0 sehingga
didapat nilai MPN 33/g.
Tabel 3.3 Tabel contoh pemilihan tabung positif berdasarkan syarat yang berlaku.
Gambar 3.4 Bagan pemilihan tabung untuk kombinasi tabung 5-4-3-1-0.
Tidak semua keadaan menggambarkan kondisi seperti diatas. Dimungkinkan juga
mendapatkan semua seri tabung menghasilkan tabung positif dan tidak semua pengenceran
menghasilkan tabung positif. Berikut contoh penentuan tabung positif pada beberapa kasus
tertentu berdasarkan interpretasi peraturan SNI 01-2332.1
(2006:8) dan ISO 7218 (2007:48).
Gambar 3.5 Bagan pemilihan tabung untuk contoh A. Dipilih kombinasi tabung 5(1/10)-
1(1/100)-0(1/1000).
Jika terdapat lebih dari satu seri pengenceran yang memiliki seluruhnya tabung
positif, maka pilih pengenceran tertinggi yang menghasilkan seluruh tabung positif dan dua
pengenceran berikutnya.
Contoh A: 5-5-1-0-0.
Jika pada pengenceran tertentu memiliki tabung positif seluruhnya dan pengenceran
sebelumnya tidak memiliki seluruh tabung positif, maka dipilih pengenceran yang memiliki
semua tabung positif dan dua pengenceran berikutnya.
Contoh B: 4-5-1-0-0. Bukan diambil 4-5-1 karena pada pengenceran 1/1 tidak semua tabung
positif.
Jika pada tingkat pengenceran yang lebih tinggi (dari dua pengenceran berikutnya
setelah pengenceran yang memiliki semua tabung positif) masih menghasilkan tabung positif
maka yang dijadikan pengenceran paling tinggi yang diambil adalah tingkat pengenceran
tertinggi tersebut dan dua pengenceran sebelumnya.
Contoh C: 5-4-4-1-0. Bukan dipilih 4-1-0 karena pada 1/10 tidak seluruh tabung positif.
Bukan dipilih 5-4-4 karena pada 1/10 masih terdapat satu tabung positif.
Jika pada tingkat pengenceran tertentu semua menghasilkan tabung negatif tetapi
pengenceran selanjutnya masih terdapat tabung positif, maka yang dinyatakan tabung positif
(dari pengenceran selanjutnya tersebut) adalah tingkat pengenceran sebelumnya (tabung
positif bergeser ke pengenceran sebelumnya).
Contoh D. 5-4-4-0-1.
Jika pada tingkat pengenceran tertinggi yang dilakukan masih terdapat tabung positif,
maka pilih pengenceran tersebut dan dua tingkat pengenceran sebelumnya.
Contoh E. 5-5-5-5-2.
Jika tingkat pengenceran tertentu menghasilkan tabung positif sedangkan pengenceran
sebelumnya tidak, maka pilih dua
tingkat pengenceran sebelumnya dari pengenceran yang memiliki tabung positif tersebut.
Contoh F. 0-0-1-0-0.
Jika pada pengenceran yang lebih tinggi dari pengenceran tertinggi yang ditentukan
masih menghasilkan tabung positif, maka tambahkan tabung positif tersebut ke tingkat
pengenceran sebelumnya (bergeser menambahkan jumlah tabung positif pengenceran
sebelumnya).
Contoh G. 4-4-1-1-0 dipilih menjadi 4-4-2.
Pelaporan MPN/g didapat dari angka indeks MPN yang harus disesuaikan dengan seri tabung
dari mana tingkat pengenceran tersebut diambil. Misalnya pada contoh E angka indeks MPN
untuk kombinasi 5-5-2 (inokulum 0,1, 0,01 dan 0,001) adalah 540 tetapi karena diambil
pengenceran signifikan 0,01, 0,001 dan 0,0001 maka nilai harus dikalikan 10. Begitu pula
sebaliknya untuk contoh G yang diambil dari pengenceran signifikan 1, 0,1 dan 0,01 maka
nilai 47 harus dibagi 10 menjadi 4,7 .
Tabel 3.3 Tabel contoh pemilihan tabung positif pada beberapa kasus berdasarkan syarat
yang berlaku. Angka indeks MPN diambil dari tabel MPN 5 seri tabung dengan
inokulum 0,1 g, 0,01 g, dan 0,001 g (SNI 01-2332.1, 2006:8).
3.11 Kesalahan umum MPN
3.11.1 Kombinasi seri tabung diluar tabel
Berdasarkan prinsip pengenceran pada MPN maka seharusnya atau sebaiknya jumlah
tabung positif pada pengenceran lebih pekat akan semakin banyak (1/10>1/100>1/1000),
misalnya 5-3-1. Hal ini dikarenakan setiap pengenceraan mengurangi jumlah mikroorgansime
target dan akibatnya semakin kecil kesempatannya untuk membuat tabung menjadi positif.
Namun seringkali hasil yang didapat tidak sesuai dengan logika peluang, seperti kombinasi 5-
3-4 yang menghasilkan nilai 210. Bisa saja banyak sel tidak sengaja terambil dan
memperbanyak tabung positif di pengenceran selanjutnya atau homogenisasi tidak
berlangsung sempurna. USDA/FSIS (2008:2) menyarankan untuk mengulangi analisa jika
diperoleh kombinasi tabung yang tidak terdapat dalam tabel (misalnya untuk 3 seri tabung :
0-2-3, 1-2-3, 2-1-3 dll.). Diasumsikan bahwa hasil tersebut mencurigakan karena kontaminasi
atau kesalahan praktik lainnya.
Dalam tabel MPN dalam metode MPN yang diterbitkan AOAC (AOAC OM 966.24,
2005:Ch.17,p5) mengenai kombinasi tabung seperti ini diberikan catatan khusus. Misalnya
untuk kombinasi 0-1-2, 1-3-2, 2-0-3 dll. Catatan ini menyarankan bahwa terdapat aspek
ketidakemungkinan yang tinggi jika mendapatkan kombinasi ini yang mengindikasikan
bahwa nilai MPN yang diperoleh dapat lebih rendah dibandingkan konsentrasi sebenarnya.
ISO 7218 (2007:61) menjabarkan tentang pembagian kategori kemungkinan nilai
MPN berdasarkan kombinasi tabung positif dari tabel MPN. Nilai MPN yang diperoleh
dibagi menjadi empat kategori yaitu kategori 1, kategori 2, kategori 3 dan kategori 0.
Kategori 1 memiliki kemungkinan paling tinggi untuk diperoleh, berturut-turut menurun
sampai kategori 0. Disarankan untuk ditentukan terlebih dahulu kategori mana yang
dinyatakan diterima (acceptable), misalnya hanya kategori 1, 1 dan 2 atau 1,2,dan 3. Jika
hasil MPN digunakan untuk menentukan keputusan yang lebih penting maka sebaiknya
dipakai kategori 1 atau 1 dan 2 saja sebagai batas keberterimaan. Sedangkan kategori 0 dapat
dipertimbangkan sebagai nilai yang mencurigakan. Tedapat pola mengenai kombinasi tabung
dan pengelompokan kategorinya. Semakin baik kategori nilai MPN maka kombinasi tabung
positif yang terjadi akan semakin logis (mendekati kenyataan).
3.11.2 Tabung negatif palsu dan positif palsu
Tabung negatif palsu mungkin terjadi jika mikroorganisme target yang terdapat pada
tabung gagal menghasilkan indikasi yang disyaratkan metode untuk dinyatakan sebagai
tabung positif. Beberapa sebab yang dapat diidentifikasi diantaranya adalah :
1. Terdapat bahan yang dapat mematikan dan menghambat mikroorganisme atau
berinterferensi dengan media, misalnya Chlorine pada air.
2. Gagalnya uji penegas dan pelengkap dalam mengidentifikasi mikroorganisme terkait
karenatidak semua (100%) strain mampu dideteksi metabolismenya dengan prosedur
tertentu sehingga tabung penduga yang semula positif dinyatakan menjadi negatif,
misalnya pada metode ISO 7251: 2005 terdapat catatan bahwa strain patogen E.coli tidak
mampu tumbuh pada suhu 44°C saat dikonfirmasi dengan pada EC broth.
3. Tabung durham dilingkupi atau tenggelam oleh substrat sampel padat dari homogenat
sampel sehingga gas tidak mampu terperangkap.
Disarankan tetap melihat pembentukan gas dengan menggoyang tabung sehingga
timbul buih (effervescence). Sedangkan tabung positif palsu dapat disebabkan oleh :
1. Terjadinya tabung positif oleh mikroorganisme non target, misalnya menurut Hussong et
al. (1981:35) beberapa strain Bacillus spp. dan Aeromonas spp. mampu pada membentuk
gas pada tahap penduga. Oleh karena itu pellicle (substansi lengket bakteri; film) tidak
boleh terambil saat diinokulasikan lagi pada tahap penegas dan Coliform umumnya tidak
membentuk pellicle.
2. Kontaminasi oleh bakteri lain termasuk oleh isolat kontrol uji, sehingga disarankan
penanaman isolat kontrol dilakukan setelah analisa.
3. Kontaminasi silang dari tabung yang lain. Oleh karena itu lebih tepat menggunakan
inoculation stick sekali buang saat uji penegas jika pembakaran jarum inokulum berkali-
kali dirasa kurang menjamin sterilisasi.
4. Masih terdapatnya udara pada tabung durham karena kesalahan preparasi media. Jika
terdapat udara pada durham dan tidak timbul buih maka umumnya adalah reaksi negatif.
BAB IV
Kesimpulan
1. Bakteri coliform sebagai suatu kelompok dicirikan sebagai bakteri berbentuk batang
gram negative, tidak membentuk spora, aerobic, dan anaerobic fakultatif yang
memfermentasi laktosa dengan menghasilkan asam dan gas dalam waktu 48 jam pada
suhu 35 C. Coliform digunakan untuk menunjukkan kualitas air minum, yang
kehadirannya di dalam air merupakan bukti bahwa air tersebut terpolusi oleh bahan
tinja dari manusia atau hewan berdarah panas
2. MPN adalah suatu metode perhitungan mikroorganisme berdasarkan data kualitatif
hasil pertumbuhan mikroorganisme pada medium cair spesifik dalam seri tabung
untuk memperoleh kisaran data kuantitatif jumlah mikroorganisme tersebut (MPN/ml
(g)).
3. Prinsip utama metode ini adalah mengencerkan sampel sampai tingkat tertentu
sehingga didapatkan konsentrasi mikroorganisme yang pas/sesuai dan jika ditanam
dalam tabung menghasilkaan frekensi pertumbuhan tabung positif “kadang-kadang
tetapi tidak selalu”. Semakin besar jumlah sampel yang dimasukkan (semakin rendah
pengenceran yang dilakukan) maka semakin “sering” tabung positif yang muncul.
4. Beberapa kelebihan metode MPN yang diambil berdasarkan Oblinger dan Korburger
(1975:541) adalah
1. Akurasi dapat ditingkatkan dengan memperbanyak tabung yang digunakan setiap
pengencerannya.
2. Ukuran (volume) sampel yang cukup besar (dibanding plate count).
3. Sensitivitas umumnya cenderung lebih baik pada konsentrasi mikroorganisme yang
sedikit daripada plate count.
4. Recovery umumnya lebih baik karena menggunakan media cair, tetapi tetap
tergantungm partikel sampel yang mungkin dapat mengganggu.
5. Jika medium spesifik yang sesuai dengan pertumbuhan bakteri target dapat dibuat
maka perkiraan perhitungan MPN dapat dilakukan berdasarkan medium tersebut.