BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Air adalah materi esensial di dalam kehidupan. Tidak satupun mahluk hidup di dunia

ini yang tidak memerlukan dan tidak mengandung air. Air minum untuk sebagian besar

daerah tempat tinggal dan kota diperoleh dari permukaan sungai, kali, dan danau. Persediaan

air alamiah semacam itu, terutama kali dan sungai, kemungkinan besar tercemar oleh sampah

domestik, pertanian, dan industri. Banyak penduduk kota tidak menyadari bahwa air yang

mereka pakai itu telah digunakan sebelumnya. Penggunaan air kembali air merupakan suatu

proses alamiah, sebagaimana diperlihatkan dalam siklus hidrologis. Tetapi di masa kini ada

pandangan baru mengenai penggunaan kembali air, meningkatnya jumlah penduduk, adanya

kebutuhan air dalam jumlah banyak untuk keperluan industri maupun untuk irigasi daerah

pertanian, telah menciptakan tuntutan baru terhadap sumber air yang tersedia. Sejalan dengan

hal tersebut, telah timbul minat terhadap pengembangan metode-metode yang dapat diterima

untuk membuat air “bekas pakai” menjadi aman dan sesuai untuk digunakan kembali.

Kontaminan yang mencemari air digolongkan ke dalam tiga kategori: kimiawi, fisik,

dan hayati. Kontaminan-kontaminan tertentu dalam setiap kategori ini dapat mempunyai

pengaruh nyata terhadap kualitas air. Dalam bab ini yang akan dibahas ialah kategori hayati.

Dalam bidang mikrobiologi pangan, dikenal istilah bakteri indikator sanitasi. Dalam

hal ini pengertian pangan adalah pangan seperti yang tercantum pada Undang-Undang

Pangan No. 7 tahun 1996 yang mencakup makanan dan minuman (termasuk air

minum). Bakteri indikator sanitasi adalah bakteri yang keberadaannya dalam pangan

menunjukkan bahwa air atau makanan tersebut pernah tercemar oleh kotoran manusia.

Mengapa demikian? Karena bakteri-bakteri indikator sanitasi tersebut pada umumnya adalah

bakteri yang lazim terdapat dan hidup pada usus manusia. Jadi adanya bakteri tersebut pada

air atau makanan menunjukkan bahwa dalam satu atau lebih tahap pengolahan air atau

makanan tersebut pernah mengalami kontak dengan kotoran yang berasal dari usus manusia

dan oleh karenanya mungkin mengandung bakteri patogen lainnya yang berbahaya.

Karena mempunyai potensi untuk berlaku sebagai pembawa mikroorganisme

patogenik, air dapat membahayakan kesehatan dan kehidupan.

Bakteri yang paling banyak digunakan sebagai indikator sanitasi adalah E.coli,

karena bakteri ini adalah bakteri komensal pada usus manusia, umumnya bukan patogen

penyebab penyakit sehingga pengujiannya tidak membahayakan dan relatif tahan hidup di air

sehingga dapat dianalisis keberadaannya di dalam air yang notabene bukan merupakan

medium yang ideal untuk pertumbuhan bakteri. Keberadaan E. Coli dalam air atau makanan

juga dianggap memiliki korelasi tinggi dengan ditemukannya patogen pada pangan.

Bakteri golongan coliform merupakan bakteri yang dapat hidup hanya pada usus

hewan mamalia termasuk manusia. Penyebaran kotoran baik manusian dan hewan yang tidak

terkontrol dalam lingkungan perairan dapat menyebabkan lingkungan perairan tercemar oleh

bakteri ini. Untuk mengetahui jumlah sel bakteri golongan coliform yang terdapat dalam

sampel air, dilakukan metode Jumlah Perkiraan Terdekat atau Most Probable Number, untuk

menentukan apakah air yang digunakan masih sesuai peruntukannya sebagai air minum atau

tidah.

Tulisan ini akan membahas tentang mengapa bakteri-bakteri tersebut diuji sebagai

indikator air minum dan apa arti keberadaan bakteri-bakteri tersebut di dalam air minum

maupun makanan

1.2 Perumusan Masalah

Berdasarkan Uraian diatas, maka perumusan masalah yang diangkat dalam karya tulis

ini sebagai berikut

1. Bagaimana bakteri Coliform dapat menjadi parameter biologi kualitas air?

2. Apa yang dimaksud metode MPN?

3. Bagaimana Prinsip Kerja MPN?

4. Apa Kekurangan dari Metode MPN?

1.3 Tujuan

Tujuan dari karya tulis ini adalah

1. Mengidentifikasi bakteri coliform dan dampaknya bagi kualitas air

2. Mengetahui apa yang dimaksud metode MPN

3. Mengetahui prinsip kerja MPN

4. Mengetahui kekurangan metode MPN

1.4 Manfaat Penelitian

1. Sebagai pengetahuan dampak dari bakteri coliform dan metode analisis yang

digunakan untuk menghitung bakteri coliform dalam air

2. Untuk menambah wawasan dan pengalaman bagi penulis terutama bidang

bakteriologi.

3. Sebagai bahan acuan karya tulis selanjutnya pada objek yang sama.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Bakteri coliform

Bakteri coliform sebagai suatu kelompok dicirikan sebagai bakteri berbentuk batang

gram negative, tidak membentuk spora, aerobic, dan anaerobic fakultatif yang

memfermentasi laktosa dengan menghasilkan asam dan gas dalam waktu 48 jam pada suhu

35o C (Pelczar.et.al.,1988).

Coliform digunakan untuk menunjukkan kualitas air minum. Sejumlah besar bakteri

yang berbeda, termasuk: E-coli ,Enterobacter, Klebsiella, Serratia,Citrobacter

dan Proteus termasuk dalam kelompok Coliform total. Kelompok Coliform tinja itu

berdasarkan kelompok dari coliform total dan memiliki bakteri lebih sedikit.

Coliform tidak berubah warna atau rasa dari air. Satu-satunya cara untuk mengetahui

jika mereka hadir di dalam air adalah tes laboratorium. Mereka semua dapat dihancurkan oleh

air mendidih.

Istilah “mikroorganisme indikator” sebagaimana digunakan dalam analisis air

mengacu pada sejenis mikroorganisme yang kehadirannya di dalam air merupakan bukti

bahwa air tersebut terpolusi oleh bahan tinja dari manusia atau hewan berdarah panas.

Artinya terdapat peluang bagi berbagai macam organisme patogenik yang secara berkala

terdapat dalam saluran pencernaan, untuk masuk kedalam air tersebut.

Beberapa ciri penting suatu organisme indikator ialah:

1. Terdapat dalam air tercemar dan tidak ada dalam air yang tidak tercemar.

2. Terdalam dalam air bila ada pathogen

3. Jumlah mikroorganisme indikator berkolerasi dengan kadar polusi.

4. Mempunyai kemampuan bertahan hidup yang lebih besar daripada pathogen.

5. Mempunyai sifat yang seragam dan mantap.

6. Tidak berbahaya bagi manusia dan hewan.

7. Terdapat dalam jumlah yang lebih banyak daripada pathogen.

8. Mudah dideteksi dengan teknik-teknik laboratorium yang sederhana.

Terdapat 3 jenis bakteri yang dapat digunakan untuk menunjukkan adanya masalah

sanitasi yaitu Escherichia coli , kelompok Streptococcus ( Enterococcus ) fekal

dan Clostridium perfringens .

Diantara organisme-organisme yang dipelajari, yang hampir memenuhi semua

persyaratan suatu organism indicator yang ideal ialah Escherichia coli dan kelompok

bakteri coli lainnya. Bakteri-bakteri tersebut dianggap sebagai indikato polusi tinja yang

dapat diandalkan (Pelczar.et.al.,1988). Bakteri ini adalah bakteri komensal pada usus

manusia, umumnya bukan patogen penyebab penyakit sehingga pengujiannya tidak

membahayakan dan relatif tahan hidup di air sehingga dapat dianalisis keberadaannya di

dalam air yang notabene bukan merupakan medium yang ideal untuk pertumbuhan bakteri.

Keberadaan E. coli dalam air atau makanan juga dianggap memiliki korelasi tinggi dengan

ditemukannya patogen pada pangan.

E.coli adalah genus dan spesies dari kelompok Coliform tinja. E.coli hadir di usus

hewan berdarah panas dan manusia. Keberadaan E. coli dalam air minum di hampir semua

kasus menandakan polusi kotoran segar. Sebagian besar E.coli strain tidak berbahaya,

(kecuali strain E. coli 0157: H7) tetapi kehadiran E.coli dalam air menunjukkan probabilitas

tinggi mikroorganisme penyebab penyakit.

Mikroorganisme selain bakteri coli yang dianggap sebagai bakteri pengganggu dalam

air karena menimbulkan rasa, bau, dan warna selain itu dapat membentuk endapan

persenyawaan tak dapat larut di dalam pipa-pipa sehingga mengurangi atau menyumbat

aliran air. Aksi merusak pada beberapa mikroorganisme adalah sebagai berikut:

a. Bakteri pembuat lender: menghasilkan keadaan air yang berlendir

b. Bakteri besi: mengubah persenyawaan besi yang dapat larut menjadi bentuk yang tak

dapat larut yang akan menghambat aliran air dalam pipa

c. Bakteri sulfur: membentuk asam sulfat dengan hydrogen sulfide, yang dapat membuat air

menjadi sangat asam san berbau tidak enak.

d. Algae: menyebabkan kekeruhan, perubahan warna, serta baud an rasa tidak enak

(pelczar.et.al.,1988)

2.2 Metode Analisis Bakteri Coliform

Perhitungan jumlah mikroba dapat dilakukan dengan perhitunganlangsung maupun

tidak langsung. Perhitungan secara langsung dapat mengetahui beberapa jumlah

mikroorganisme pada suatu bahan pada suatu saat tertentu tanpa memberikan perlakuan

terlebih dahulu, sedangkan jumlah organisme yangdiketahui dari cara tidak langsung terlebih

dahulu harus memberikan perlakuan tertentu sebelum dilakukan perhitungan. Perhitungan

secara langsung, dapat dilakukan dengan beberapa cara antara lain adalah dengan membuat

preparat darisuatu bahan ( preparat sederhana diwarnai atau tidak diwarnai ) dan

penggunaanruang hitung (counting chamber ). Sedangkan perhitungan cara tidak langsung

hanya untuk mengetahui jumlah mikroorganisme pada suatu bahan yang masihhidup saja

(viabel count). Dalam pelaksanaannya, ada beberapa cara yaitu : perhitungan pada cawan

petri (total plate count /TPC), perhitungan melalui pengenceran, perhitungan jumlah terkecil

atau terdekat (MPN methode), dankalorimeter (cara kekeruhan atau turbidimetri)

(Dwidjoseputro, 1994).

Perhitungan secara tidak langsung ada beberapa cara yaitu : perhitungan pada cawan

petri (total plate count / TPC), perhitungan melalui pengenceran, perhitungan jumlah terkecil

atau terdekat (MPN methode), dan kalorimeter (cara kekeruhan atau turbidimetri). Metode

MPN terdiri dari tiga tahap, yaitu uji pendugaan (presumtive test), uji konfirmasi (confirmed

test), dan uji kelengkapan (completed test). Dalam uji tahap pertama, keberadaan coliform

masih dalam tingkat probabilitas rendah; masih dalam dugaan. Uji ini mendeteksi sifat

fermentatif coliform dalam sampel. Metode perhitungan MPN sering digunakan dalam

pengamatan untuk menghitung jumlah bakteri yang terdapat di dalam tanah seperti

Nitrosomonas dan Nitrobacter. Kedua jenis bakteri ini memegang peranan penting dalam

meningkatkan pertumbuhan dan produksi tanaman, sehubungan dengan kemampuannya

dalam mengikat N2 dari udara dan mengubah ammonium menjadi nitrat (Lim, 1998).

Metode MPN biasanya biasanya dilakukan untuk menghitung jumlah mikroba di dalam

contoh yang berbentuk cair, meskipun dapat pula digunakan untuk contoh berbentuk padat.

Perhitungan jumlah suatu bakteri dapat melalui berbagai macam uji seperti uji kualitatif

koliform yang secara lengkap terdiri dari tiga tahap yaitu uji penduga (uji kuantitatif, bisa

dengan metode MPN), uji penguat dan uji pelengkap. Waktu, mutu sampel, biaya, tujuan

analisis merupakan beberapa faktor penentu dalam uji kualitatif koliform. Bakteri koliform

dapat dihitung dengan menggunakan metode cawan petri (metode perhitungan secara tidak

langsung yang didasarkan pada anggapan bahwa setiap sel yang dapat hidup akan

berkembang menjadi satu koloni yang merupakan suatu indeks bagi jumlah organisme yang

dapat hidup yang terdapat pada sampel (Plummer, 1987).

Output metode MPN adalah nilai MPN. Nilai MPN adalah perkiraan jumlah unit

tumbuh (growth unit) atau unit pembentuk koloni (colony forming unit) dalam sampel.

Namun, pada umumnya nilai MPN juda diartikan sebagai perkiraan jumlah individu bakteri.

Satuan yang digunakan, umumnya per 100 mL atau per gram. Metode MPN memiliki limit

kepercayaan 95 persen sehingga pada setiap nilai MPN, terdapat jangkauan nilai MPN

terendah dan nilai MPN tertinggi (Lim, 1998).

Menurut Plummer (1987), ada beberapa cara yang dapat digunakan untuk menghitung

atau mengukur jumlah jasad renik di dalam suatu suspensi atau bahan, yang dapat dibedakan

atas beberapa kelompok yaitu:

a. Perhitungan jumlah sel

1. Hitungan mikroskopik

2. Hitungan cawan

3. MPN (Most Probable Number)

b. Perhitungan massa sel secara langsung

1. Volumetrik

2. Gravimetrik

3. Kekeruhan (turbidimetri)

c. Perhitungan massa sel secara tidak langsung

1. Analisis komponen sel

2. Analisis produk katabolisme

3. Analisis konsumsi nutrient

Metode MPN biasanya dilakukan untuk menghitung jumlah mikroba di dalam

contoh yang berbentuk cair, meskipun dapat pula digunakan untuk contoh berbentuk padat

dengan terlebih dahulu membuat suspensi 1:10 dari contoh tersebut. Metode MPN digunakan

medium cair di dalam tabung reaksi, dimana perhitungannya dilakukan berdasarkan jumlah

tabung yang positif yaitu yang ditumbuhi oleh jasad renik setelah inkubasi pada suhu dan

waktu tertentu. Pengamatan tabung yang positif dapat dilihat dengan mengamati timbulnya

kekeruhan atau terbentuknya gas di dalam tabung kecil (tabung Durham) yang diletakkan

pada posisi terbalik, yaitu untuk jasad renik pembentuk gas (Fardiaz, 1993).

Untuk metode MPN (most probable number) digunakan medium cair dalam wadah

berupa tabung reaksi, perhitungan di lakukan berdasarkan jumlah tabung yang positif yaitu

tabung yang mengalami perubahan pada mediumnya baik itu berupa perubahan warna atau

terbentuknya gelembung gas pada dasar tabung durham. Pada metode perhitungan MPN ini

digunakan bentuk tiga seri pengenceran, yang pertama 10-1, 10-2, dan 10-3. Kemudian dari

hasil perubahan tersebut dicari nilai MPN nya pada tabel nilai MPN, dan untuk jumlah

bakterinya maka digunakan rumus (Gobel, 2008).

Metode MPN merupakan uji deretan tabung yang menyuburkan pertumbuhan

koliform sehingga diperoleh nilai untuk menduga jumlah koliform dalam sampel yang diuji.

Uji positif akan menghasilkan angka indeks. Angka ini disesuaikan dengan tabel MPN untuk

menentukan jumlah koliform dalam sampel (Pakadang, S, 2010).

Bakteri koliform adalah bakteri indikator keberadaan bakteri patogenik lain dengan

kata lain merupakan bakteri indikator sebagai tanda bahwa adanya pencemaran bakteri

patogen. Penentuan koliform fecal menjadi indikator pencemaran dikarenakan jumlah

koloninya pasti berkorelasi positif dengan keberadaan bakteri patogen. Keuntungan

mendeteksi koliform adalah jauh lebih murah, cepat, dan sederhana daripada mendeteksi

bakteri patogenik lain. Koliform merupakan suatu grup bakteri yang digunakan sebagai

indikator adanya pencemaran dan kondisi sanitasi yang tidak baik terhadap air, makanan,

susu dan produk-produk susu. Pada saat perhitungan koloni, apabila jumlah koloni yang di

temukan kurang dari standart yang telah di tetapkan, maka suatu sampel bisa di katakan

murni (Umbreit, 1960).

Beberapa jenis bakteri selain coliform juga memiliki sifat fermentatif, sehingga

diperlukan uji konfirmasi untuk mengetes kembali kebenaran adanya coliform dengan

bantuan medium selektif diferensial. Uji kelengkapan kembali meyakinkan hasil tes uji

konfirmasi dengan mendeteksi sifat fermentatif dan pengamatan mikroskop terhadap ciri-ciri

coliform: berbentuk batang, gram negatif, tidak-berspora. Bakteri coliform adalah golongan

bakteri intestinal, yaitu hidup dalam saluran pencernaan manusia. Bakteri coliform adalah

bakteri indicator keberadaan bakteri patogenik lainnya. Lebih tepatnya, sebenarnya bakteri

coliform fecal adalah bakteri indicator adanya pencemaran bakteri pathogen. Penentuan

coliform fekal menjadi indikator pencemaran dikarenakan jumlah koloninya pasti berkorelasi

positif dengan keberadaan bakteri pathogen. Selain itu, mendeteksi coliform jauh lebih

murah, cepat dan sederhana daripada mndeteksi bakteri patogenik lain (Lim, 1998).

Salah satu anggota kelompok coliform adalah E.coli. Karena E.coli adalah bakteri

coliform yang ada pada kotoran manusia, maka E.coli sering disebut sebagai coliform fekal.

Pengujian coliform jauh lebih cepat jika dibandingkan dengan uji E.coli karena hanya

memerlukan uji penduga yang merupakan tahap pertama uji E.coli (Penn, 1991).

Bakteri coliform merupakan parameter mikrobiologis terpenting bagi kualitas air

minum. Kelompok bakteri coliform, antara lain Eschericia coli, Enterrobacter aerogenes,

dan Citrobacter fruendi. Keberadaan bakteri di dalam air minum itu menunjukkan tingkat

sanitasi rendah. Keberadaan bakteri ini juga menunjukkan adanya bakteri pathogen lain

misalnya, Shigella, yang menyebabkan diare hingga muntaber (Lim, 1998).

BAB III

PEMBAHASAN

3.1 Sejarah perkembangan MPN

Metode MPN muncul sekitar awal abad 20 sehingga dikenal sudah sangat lama di

dalam ilmu mikrobiologi. Estimasi akurat dari tabel MPN di publikasikan oleh Mc Crady

pada tahun 1915 kemudian dasar statistik dari metode MPN dikemukakan oleh Halvorson

dan Ziegler (1933), Eisenhart dan Wilson (1943) dan Cochran (1950). Pada tahun 1957

Woodward menyarankan tentang pengabaian hasil positif (banyak tabung positif pada

pengenceran tinggi dan sebaliknya) yang dapat meningkatkan kesalahan laboratorium dalam

tabel MPN. Kemudian De Mann pada tahun 1983 mempublikasikan tentang metode

perhitungan tingkat kepercayaan (convidence interval) dalam tabel MPN. Sampai sekarang

metode MPN telah menjadi salah satu metode standard untuk menghitung jenis Coliform,

Fecal Coliform, Escherichia coli, dan S. aureus.

3.2 Prinsip metode MPN

MPN adalah suatu metode perhitungan mikroorganisme berdasarkan data kualitatif

hasil pertumbuhan mikroorganisme pada medium cair spesifik dalam seri tabung untuk

memperoleh kisaran data kuantitatif jumlah mikroorganisme tersebut (MPN/ml (g)). MPN

merupakan suatu metode uji pengenceran bertingkat (serial dilution) untuk mengukur

konsentrasi mikroorganisme target dengan perkiraan. SNI 01-2332.1 (2006:7)

mendeskripsikan MPN sebagai metode untuk menghitung jumlah mikroba dengan

menggunakan medium cair pada tabung reaksi yang pada umumnya setiap pengenceran

menggunakan 3 atau 5 seri tabung dan perhitungan yang dilakukan merupakan tahap

pendekatan secara statistik.

Prinsip utama metode ini adalah mengencerkan sampel sampai tingkat tertentu

sehingga didapatkan konsentrasi mikroorganisme yang pas/sesuai dan jika ditanam dalam

tabung menghasilkaan frekensi pertumbuhan tabung positif “kadang-kadang tetapi tidak

selalu”. Semakin besar jumlah sampel yang dimasukkan (semakin rendah pengenceran yang

dilakukan) maka semakin “sering” tabung positif yang muncul. Semakin kecil jumlah sampel

yang dimasukkan (semakin tinggi pengenceran yang dilakukan) maka semakin “jarang”

tabung positif yang muncul. Semua tabung positif yang dihasilkan sangat tergantung dengan

probabilitas sel yang terambil oleh pipet saat memasukkannya ke dalam media. Oleh karena

itu, homogenisasi sangat mempengaruhi metode ini. Kombinasi kemunculan positif (ya) atau

negatif (tidak) ini menggambarkan perkiraan konsentrasi mikroorganisme pada sampel

sebelum diencerkan. Perubahan dari data positif atau negatif sampai menghasilkan angka

dilakukan dengan proses perhitungan statistik. Jadi nilai MPN adalah suatu angka yang

menggambarkan jumlah mikroorganisme yang memiliki kemungkinan paling tinggi.

Gambar 3.1 Kombinasi tabung positif yang didapat adalah 3 tabung positif dari pengenceran

1/10, 2 tabung positif darimpengenceran 1/100 dan 1 tabung positif dari pengenceran 1/1000.

Angka MPN yang dihasilkan setelah dicocokkan dengan tabel adalah 150 MPN/g.

Asumsi yang diterapkan dalam metode MPN adalah :

- Bakteri terdistribusi sempurna dalam homogenat sampel.

- Sel bakteri terpisah-pisah secara individual, tidak dalam bentuk rantai atau kumpulan

(bakteri Coliform termasuk E. coliterpisah sempurna tiap selnya dan tidak membentuk

rantai).

- Media yang dipilih telah sesuai untuk pertumbuhan bakteri target dalam suhu dan

waktu inkubasi tertentu sehingga minimal satu sel hidup mampu menghasilkan tabung

positif selama masa inkubasi pada media tersebut.

- Jumlah yang didapatkan menggambarkan bakteri yang hidup (viable) saja . sel yang

terluka dan tidak mampu menghasilkan tabung positif tidak akan terdeteksi.

- Setiap individu tabung memiliki data yang berdiri sendiri (independen).

Metode MPN dinilai berdasarkan perkiraan unit tumbuh (Growth Unit / GU) seperti

CFU, bukan dari sel individu. Meskipun begitu baik nilai CFU atau MPN dapat

menggambarkan seberapa banyak sel individu yang tersebar dalam sampel. FDA BAM

appendix 2 (2001) menyatakan bahwa jika dalam MPN menggunakan target mikroorganisme

yang dalam preparasi sampel dan pengencerannya tetap menunjukkan sel yang tidak terpisah

dan berkelompok, maka nilai MPN sebaiknya dapat dinyatakan dalam perkiraan GU (Growth

Units) atau CFU (Colony Forming Units). Namun sebagian besar metode MPN digunakan

untuk menghitung mikroorganisme target yang benar-benar terpisah individunya seperti

Coliform dan E. coli.

Pemilihan media sangat berpengaruh terhadap metode MPN yang dilakukan.

Umumnya media yang digunakan mengandung bahan nutrisi khusus untuk pertumbuhan

bakteri tertentu. Misalnya dalam mendeteksi kelompok Coliform dapat menggunakan media

Brilliant Green Lactose 2% Bile (BGLB) broth. Di dalam media ini mengandung lactose dan

garam empedu (bile salt) yang hanya mengizinkan untuk tumbuh. Jika terdapat

ketidaksesuaian jenis media dan bakteri yang diinginkan maka metode ini akan menghitung

bukan bakteri yang dituju. Untuk menghitung Coliform pada tahap pendugaan umumnya

menggunakan Lauryl Sulphate Tryptose (LST) broth, sedangkan untuk menghitung E.coli

pada tahap konfirmasi diperlukan media EC (Escherichia coli) broth.

USDA/FSIS (2008:1) menyebutkan bahwa nilai MPN sangat berguna untuk

menentukan jumlah mikroorganisme dengan konsentrasi rendah (<100/g). Metode ini

umumnya dipakai untuk menganalisa susu, pangan, air atau tanah yang dimana pada jenis

sampel ini terdapat kemungkinan bahan partikulat sampel mampu mengganggu pertumbuhan

koloni pada agar.

Beberapa kelebihan metode MPN yang diambil berdasarkan Oblinger dan Korburger

(1975:541) adalah :

(1) Akurasi dapat ditingkatkan dengan memperbanyak tabung yang digunakan setiap

pengencerannya.

(2) Ukuran (volume) sampel yang cukup besar (dibanding plate count).

(3) Sensitivitas umumnya cenderung lebih baik pada konsentrasi mikroorganisme yang

sedikit daripada plate count.

(4) Recovery umumnya lebih baik karena menggunakan media cair, tetapi tetap tergantungm

partikel sampel yang mungkin dapat mengganggu.

(5) Jika medium spesifik yang sesuai dengan pertumbuhan bakteri target dapat dibuat maka

perkiraan perhitungan MPN dapat dilakukan berdasarkan medium tersebut.

3.3 Cara kerja metode MPN

MPN umumnya dilakukan tidak hanya sampai menghasilkan tabung-tabung positif

saja, melainkan dilanjutkan dengan berbagai macam uji untuk mengkonfirmasi tabung positif.

Prosedur konfirmasi tersebut bertujuan untuk meyakinkan bahwa data positif tersebut

memang ditimbulkan oleh mikroorganisme target. Meskipun media awal yang dipakai di

dalam tabungsudah berfungsi sebagai media selektif. Terdapat tiga tahap dalam prosedur

lengkap metode MPN yaitu uji penduga (presumptive test), uji penegasan (confirmed test)

dan uji pelengkap (completed test).

Uji penduga dilakukan untuk memperoleh kombinasi tabung positif awal, kemudian

uji penegasan digunakan untuk memastikannya. Nilai akhir yang diambil adalah dari hasil uji

penegasan dan pelengkap sehingga dimungkinkan mengubah kombinasi tabung yang

diperoleh pada uji penduga.

Umumnya hanya uji E.coli saja yang sampai tahap uji pelengkap. Uji E.coli yang

sesuai standar harus dilakukan sampai tahap akhir yang memerlukan waktu berhari-hari. Jika

analisa tidak dilakukan sampai akhir maka belumdapat dinyatakan pasti bahwa tabung positif

tersebut mengandung E. coli.

Berikut adalah Metode MPN Coliform, Fecal Coliform dan E. coli untuk analisa

sampel pangan yang diinterpretasikan berdasarkan FDA BAM Ch.4 (2002).

3.4 Uji penduga

Buat pelarut Butterfield’s buffered phosphate dengan melarutkan 34.0 g KH2PO4

dalam 500 ml H2O lalu atur pH 7.2 dengan 1 M NaOH.

Larutkan dengan akuades sampai 1L, stok pelarut simpan dalam refrigerator. Larutkan

1,25 ml dari stok pelarut ke dalam 1L H2O lalu sterilisasi menggunakan autoklaf.

Cairkan sampel beku pada suhu 2-5°C selama ≤18 jam atau suhu 45°C selama 15

menit pada waterbath dengan agitasi. Timbang secara aseptis sebanyak 50g.

Masukkan sampel ke dalam kontainer blender yang telah disterilisasi. Tambahkan 450

ml butterfield phosphate diluent (dihitung pengenceran pertama ; 50:450 atau 1:9).

Kemudian hancurkan selama 2 menit. Volume total yang terdapat pada wadah blender

harus menutupi pisau blender. Jika sampel tersedia kurang dari 50g (x) maka

pengenceran pertamanya adalah x.9 ml.

Ambil 1 ml homogenat sampel (pengenceran 1/10) dari preparasi sampel lalu

masukkan ke 9 ml diluent (pengenceran 1/100). Ambil 1 ml dari tabung pengenceran

1/100 untuk dimasukkan ke 9 ml diluent (pengenceran 1/1000). Pada setiap transfer

sampel yang dilakukan, tabung dikocok berayun 25 kali dengan ketinggian ayunan

pengocokan 30 cm atau vorteks selama 7 detik.

Siapkan 3 seri tabung MPN berisi masing-masing 10 ml Lauryl Sulphate Tryptose

(LST) broth dengan tabung durham didalamnya (total 9 tabung yang dibagi menjadi 3

seri).

Masukkan 1 ml dari pengenceran 1/10 ke 3 tabung pertama, masukkan 1 ml dari

pengenceran 1/100 ke 3 tabung kedua, dan masukkan 1 ml dari pengenceran 1/1000

ke 3 tabung ketiga.

Inkubasi semua tabung pada suhu 35±0,5ºC selama 24±2 jam. Amati terbentuknya

gas pada tabung durham lalu catat hasilnya. Inkubasi lagi menjadi 48±3 jam tabung

yang tidak terbentuk gas.

Interpretasi hasil positif jika media keruh dan terbentuk gas (harus kedua-duanya)

pada inkubasi 24±2 jam atau 48±3 jam. Interpretasi hasil negatif jika tidak terdapat

pertumbuhan dan tidak terbentuk gas. Gas yang diproduksi dapat terjebak dalam

tabung durham ataupun berbentuk buih (effervescence) yang timbul saat dikocok.

Perkiraan konsentrasi berdasarkan tabel yang didapat adalah nilai dugaan adanya

Coliform, Fecal Coliform atau E.coli.

3.5 Uji penegasan untuk Coliform

Siapkan tabung berisi 10 ml Brilliant Green Lactose Bile (BGLB) broth dengan

tabung durham didalamnya.

Masukkan satu ulasan inokulum dari tiap tabung LST broth yang menghasilkan uji

positif ke dalam tiap tabung BGLB broth.

Inkubasi semua tabung pada suhu 35±0,5 C selama 48±3 jam.

Interpretasi hasil positif jika media keruh dan terbentuk gas (harus kedua-duanya).

Interpretasi hasil negatif jika tidak terdapat pertumbuhan dan tidak terbentuk gas.

Tentukan jumlah Coliform (MPN/g atau ml) dengan menghitung tabung positif

kemudian cocokkan dengan tabel MPN (tabel 10) berdasarkan dari perhitungan uji

dugaan. Perkiraan konsentrasi berdasarkan tabel yang didapat adalah nilai penegasan

adanya Coliform.

3.6 Uji penegasan untuk Fecal Coliform dan E.coli

Siapkan berisi masing-masing 10 ml EC broth dengan tabung durham didalamnya

Masukkan satu ulasan inokulum dari tiap tabung LST broth yang menghasilkan uji

positif ke dalam tiap tabung EC broth.

Inkubasi semua tabung pada suhu 45,5ºC (Fecal Coliform untuk pangan dilakukan

pada 45,5±0,2ºC, uji air, kerangkerangan 44,5±0,2ºC) selama 24±2 jam. Amati

terbentuknya gas pada tabung durham lalu catat hasilnya. Inkubasi lagi menjadi 48±2

jam tabung yang tidak terbentuk gas.

Interpretasi hasil positif jika media keruh dan terbentuk gas (harus kedua-duanya).

Interpretasi hasil negatif jika tidak terdapat pertumbuhan dan tidak terbentuk gas.

Tentukan jumlah Fecal Coliform (MPN/g atau ml) dengan menghitung tabung

positif kemudian cocokkan dengan tabel MPN (tabel 10) berdasarkan dari perhitungan

uji dugaan. Perkiraan konsentrasi yang didapat berdasarkan tabel adalah nilai

penegasan adanya Fecal Coliform dan E. coli. Untuk mengetahui apakah pada tabung

EC broth adalah Fecal Coliform atau E.coli maka dilanjutkan uji penegasan untuk E.

coli.

3.7 Uji pelengkap untuk E.coli

Tabung positif yang mengandung gas dari EC broth dikocok kemudian inokulasikan

ke dalam cawan L-EMB agar dan inkubasi pada 35±0,5 C selama 18-24 jam.

Interpretasikan sebagai dugaan E.coli jika memiliki ciri-ciri koloni datar, berwarna

hitam di tengah koloni dengan atau tanpa warna kilat logam (metallic sheen).

Inokulasikan sampai 5 koloni tersangka ke PCA dan inkubasi pada 35±0,5 C selama

18-24 jam untuk kultur uji penegasan selanjutnya.

Satu dari lima koloni yang teridentifikasi positif E. coli cukup untuk menyatakan

bahwa tabung EC broth tersebut terkonfirmasi positif E. coli.

Uji kultur dugaan dengan uji pewarnaan gram dan morfologi sel. Semua kultur yang

mencirikan gram negatif dan sel berbentuk batang pendek selanjutnya diuji dengan

tahap selanjutnya. Inokulasikan kembali kultur dugaan tersebut ke mediaLST lalu

inkubasi pada 35±0,5ºC selama 48±2 jam untuk mengkonfirmasi ulang terbentuknya

gas. Kemudian kultur

sangkaan yang sama dilakukan uji IMViC.

Uji IMViC (uji produksi indole, uji Methyl Red, uji Voges-Proskauer, uji penggunaan

Citrate).

- Uji produksi indole; uji ini akan membedakan bakteri yang mampu atau tidak

mampu memproduksi indole dari Tryptone. Inokulasikan kultur sangkaan ke

Tryptone broth lalu inkubasi pada 35±0,5ºC selama 24±2 jam. Tambahkan 0,2-

0,3 ml reagen Kovac’s. Jika terbentuk cincin merah pada bagian atas tabung maka

bakteri dapat memproduksi indol (indol positif) dan bila terbentuk cincin kuning

maka disimpulkan sebagai indol negatif. Jika kultur dugaan adalah E. coli maka

seharusnya menunjukkan hasil positif dan sel berbentuk batang pendek.

- Uji Voges-Proskauer; uji ini dapat membedakan bakteri yang mampu

memproduksi acetylmethyl-carbinol atau tidak. Senyawa tersebut dideteksi

dengan penambahan potassium hydroxide yang akan membentuk diacetyl yang

bereaksi dengan peptone menghasilkan warna merah. Inokulasikan kultur

sangkaan ke MR-VP broth lalu inkubasi pada 35±0,5ºC selama 48±2 jam. Setelah

waktu 24 jam pindahkan 1 ml ke dalam tabung kosong (13×100 mm) lalu

tambahkan 0,6 ml larutan larutan α-naphthol dan 0.2 ml 40% KOH. Tambahkan

beberapa kristal creatine. Kocok kemudian biarkan selama 2 jam. Uji VP

dinyatakan positif bila warna

- berubah menjadi merah. Jika kultur dugaan adalah E. coli maka seharusnya

menunjukkan hasil tidak ada perubahan warna /negatif.

- Uji Methyl Red; uji ini akan membedakan bakteri yang mampu memproduksi

asam dari glukosa dan Methyl Red sebagai indikator penurunan pH .Inkubasi

kembali tabung MRVP pada 35±0,5 C selama 48±2 jam. Tambahkan 5 tetes

larutan Methyl Red ke dalam tabung MR-VP broth. Terbentuknya warna merah

menandakan hasil uji positif, sedangkang berwarna kuning menunjukkan hasil

- negatif. Jika kultur dugaan adalah E. coli maka seharusnya menunjukkan hasil

positif.

- Uji penggunaan Citrate ; uji ini akan membedakan bakteri yang mampu

menggunakan Citrate sebagai sumber nutrisinya. Inokulasikan kultur sangkaan ke

medium Koser’s Citrate broth lalu inkubasi pada 35±0,5ºC selama 96 jam. Reaksi

positif jika terdapat pertumbuhan media yang berwarna hijau berubah menjadi

biru, reaksi negatif jika tidak ada pertumbuhan dan media tetap hijau. Jika kultur

dugaan adalah E. coli maka seharusnya menunjukkan hasil tidak ada perubahan

warna / negatif.

3.8 Pemilihan jumlah seri tabung MPN

Telah diketahui bahwa MPN memiliki beberapa pilihan cara dalam perhitungannya

berdasarkan jumlah tabung setiap serinya sesuai tabel yang tersedia yaitu 3, 5, 8 dan 10 seri

tabung. Inti dari metode MPN adalah mendapatkan tingkat pengenceran yang kadang-kadang

tapi tidak selalu mengandung mikroorganisme hidup. Alasan inilah yang

sangatmempengaruhi pemilihan jumlah seri tabung pada metode MPN tersebut. Menurut ISO

7218 (2007:45) pemilihan konfigurasi seri tabung ini juga dipengaruhi oleh jumlah

mikroorganisme yang diperkiraan, persyaratan peraturan yang berlaku, presisi yang

dibutuhkan dan pertimbangan praktik lainnya.

Sistem metode MPN yang paling banyak digunakan adalah Symmetric dilution system

yaitu metode MPN yang menggunakan banyak tabung secara paralel setiap pengencerannya.

Semakin banyak jumah tabung yang digunakan setiap serinya maka semakin presisi nilai

yang dihasilkan. Disarankan untuk menggunakan 5 atau lebih tabung setiap serinya jika

menginginkan presisi yang lebih baik (ISO 7218, 2007:45). FDA BAM Ch.4 (2002)

menyatakan bahwa 3 seri tabung umumnya digunakan untuk sampel pangan, 5 seri tabung

untuk sampel air dan kerang, sedangkan 10 seri tabung dipakai untuk menguji air dalam

kemasan (bottled water) atau sampel lain yang diperkirakan jarang terkontaminasi

(mengandung sedikit mikroorganisme).

UNEP/WHO (1996:7) menyarankan jumlah sampel yang diinokulasikan dan jumlah

seri tabung yang dipakai untuk analisa berbagai jenis sampel air pada tabel berikut.

Tabel 3.1 Tabel seri tabung dan volume sampel yang digunakan untuk analisa MPN berbagai

jenis sampel air (UNEP/WHO,1996:7)

Menurut USDA/FSIS (2008:3) untuk mengantisipasi jika jumlah mikroorganisme

dalam sampel >10 Growth Unit/g (ml) makadisarankan menanam sampel 10 ml pada 3 seri

tabung, 1 ml pada 3 seri tabung lalu selanjutnya dilakukan pengenceran sampai 1/10 dan tiap

pengenceran ditanam 1 ml pada 3 seri tabung.

Gambar 3.2 Skema penanaman metode MPN yang disarankan oleh USDA/FSIS (2008:3). Jika mengikuti petunjuk ini maka kemungkinan memperoleh tabung positif yang “kadang-

kadang tapi tidak selalu” semakin besar.

3.9 Peluang dalam metode MPN

FDA BAM appendiks 2 (2001) memberikan informasi bahwa hasil dari metode MPN

memiliki derajat kepercayaan karena proses perhitungannya merupakan hasil dari peluang.

Arti dari 95% confidence intervals dalam tabel MPN adalah kemungkinan paling tidak 95%

rentang derajat kepercayaan dari hasil akhir adalah sesuai dengan konsentrasi yang

sebenarnya. Di dalam tabel MPN terdapat kolom derajat kepercayaan (confidence interval)

95% dengan batas bawah (lower limit) dan batas atas (upper limit). Angka ini menunjukkan

batas derajat kepercayaan tersebut. Nilai indeks MPN dan derajat kepercayaan dalam tabel

dinyatakan dalam dua digit signifikan, misalnya nilai 400 adalah hasil pembulatan antara 395

dan 405. Tidak diberikannya batas nilai MPN untuk semua tabung positif (3-3-3) yang

ditandai dengan tanda “>” adalah menggambarkan konsentrasi lebih dari nilai MPN untuk

kombinasi paling tidak ada satu tabung negatif pada pengenceran tertinggi (3-3-2).

Ketidakpastian ini juga dijumpai pada indeks MPN untuk semua kombinasi tabung negatif.

Tabel 3.2 Contoh potongan tabel MPN 5 seri tabung dengan inokulum 0,1g (ml), 0,01 g (ml)

dan 0,001 g (ml).

Untuk memahami peranan peluang dalam mendistribusikan sel sehingga

menghasilkan tabung positif maka jumlah tabung positif (5-3-1) pada tabel dicoba untuk

dirunut dan diilustrasikan kembali dalam proses penanamannya pada gambar berikut

(dianggap bahwa nilai MPN/ml sama dengan ‘sel’/ml (GU/ml)). Namun perlu diingat, jumlah

sel yang terambil tidak selalu seperti itu, semuanya adalah peluang dan angka yang didapat

adalah angka yang kemungkinannya paling besar.

Gambar 3.3 Ilustrasi peluang saat penanaman dan pengenceran pada metode MPN. Satu titik menggambarkan satu ‘sel’ atau growth unit.

3.10 Persyaratan pemilihan kombinasi tabung positif dan pelaporannya

Seperti metode hitungan cawan, di dalam MPN juga memiliki konsep pemilihan

jumlah yang masuk dalam ‘kisaran hitung’ yaitu berdasarkan frekuensi kemunculan tabung

positif yang sebaiknya kadang-kadang tapi tidak selalu. Kombinasi tersebut dipilih dari tiga

tingkat pengenceran tertentu yang disebut tiga tingkat pengenceran yang signifikan. Syarat

umum yang dipakai dalam pemilihan tabung positif adalah :

- Pilih pengenceran yang memiliki kombinasi tabung kategori 1, jika tidak ada maka

pilih kombinasi dari kategori berikutnyayang lebih rendah berturut-turut (2 dan 3)

(tabel 3.2).

Atau dengan ketentuan :

- Pilih pengenceran terendah yang tidak semua tabung menghasilkan tabung positif.

- Pilih pengenceran tertinggi yang paling tidak memiliki satu tabung positif.

- Pilih semua pengenceran diantaranya.

- Kalikan setiap seri tabung yang dipilih dengan pengenceran yang diambil.

Misalnya : dari inokulum 1, 0,1, 0,01, 0,001 dan 0,0001 menghasilkan kombinasi tabung

positif 5-4-3-1-0 maka dipilih 5-4-3-1-0 bukan 5-4-3-1-0 atau bukan 5-4-3-1-0 sehingga

didapat nilai MPN 33/g.

Tabel 3.3 Tabel contoh pemilihan tabung positif berdasarkan syarat yang berlaku.

Gambar 3.4 Bagan pemilihan tabung untuk kombinasi tabung 5-4-3-1-0.

Tidak semua keadaan menggambarkan kondisi seperti diatas. Dimungkinkan juga

mendapatkan semua seri tabung menghasilkan tabung positif dan tidak semua pengenceran

menghasilkan tabung positif. Berikut contoh penentuan tabung positif pada beberapa kasus

tertentu berdasarkan interpretasi peraturan SNI 01-2332.1

(2006:8) dan ISO 7218 (2007:48).

Gambar 3.5 Bagan pemilihan tabung untuk contoh A. Dipilih kombinasi tabung 5(1/10)-

1(1/100)-0(1/1000).

Jika terdapat lebih dari satu seri pengenceran yang memiliki seluruhnya tabung

positif, maka pilih pengenceran tertinggi yang menghasilkan seluruh tabung positif dan dua

pengenceran berikutnya.

Contoh A: 5-5-1-0-0.

Jika pada pengenceran tertentu memiliki tabung positif seluruhnya dan pengenceran

sebelumnya tidak memiliki seluruh tabung positif, maka dipilih pengenceran yang memiliki

semua tabung positif dan dua pengenceran berikutnya.

Contoh B: 4-5-1-0-0. Bukan diambil 4-5-1 karena pada pengenceran 1/1 tidak semua tabung

positif.

Jika pada tingkat pengenceran yang lebih tinggi (dari dua pengenceran berikutnya

setelah pengenceran yang memiliki semua tabung positif) masih menghasilkan tabung positif

maka yang dijadikan pengenceran paling tinggi yang diambil adalah tingkat pengenceran

tertinggi tersebut dan dua pengenceran sebelumnya.

Contoh C: 5-4-4-1-0. Bukan dipilih 4-1-0 karena pada 1/10 tidak seluruh tabung positif.

Bukan dipilih 5-4-4 karena pada 1/10 masih terdapat satu tabung positif.

Jika pada tingkat pengenceran tertentu semua menghasilkan tabung negatif tetapi

pengenceran selanjutnya masih terdapat tabung positif, maka yang dinyatakan tabung positif

(dari pengenceran selanjutnya tersebut) adalah tingkat pengenceran sebelumnya (tabung

positif bergeser ke pengenceran sebelumnya).

Contoh D. 5-4-4-0-1.

Jika pada tingkat pengenceran tertinggi yang dilakukan masih terdapat tabung positif,

maka pilih pengenceran tersebut dan dua tingkat pengenceran sebelumnya.

Contoh E. 5-5-5-5-2.

Jika tingkat pengenceran tertentu menghasilkan tabung positif sedangkan pengenceran

sebelumnya tidak, maka pilih dua

tingkat pengenceran sebelumnya dari pengenceran yang memiliki tabung positif tersebut.

Contoh F. 0-0-1-0-0.

Jika pada pengenceran yang lebih tinggi dari pengenceran tertinggi yang ditentukan

masih menghasilkan tabung positif, maka tambahkan tabung positif tersebut ke tingkat

pengenceran sebelumnya (bergeser menambahkan jumlah tabung positif pengenceran

sebelumnya).

Contoh G. 4-4-1-1-0 dipilih menjadi 4-4-2.

Pelaporan MPN/g didapat dari angka indeks MPN yang harus disesuaikan dengan seri tabung

dari mana tingkat pengenceran tersebut diambil. Misalnya pada contoh E angka indeks MPN

untuk kombinasi 5-5-2 (inokulum 0,1, 0,01 dan 0,001) adalah 540 tetapi karena diambil

pengenceran signifikan 0,01, 0,001 dan 0,0001 maka nilai harus dikalikan 10. Begitu pula

sebaliknya untuk contoh G yang diambil dari pengenceran signifikan 1, 0,1 dan 0,01 maka

nilai 47 harus dibagi 10 menjadi 4,7 .

Tabel 3.3 Tabel contoh pemilihan tabung positif pada beberapa kasus berdasarkan syarat

yang berlaku. Angka indeks MPN diambil dari tabel MPN 5 seri tabung dengan

inokulum 0,1 g, 0,01 g, dan 0,001 g (SNI 01-2332.1, 2006:8).

3.11 Kesalahan umum MPN

3.11.1 Kombinasi seri tabung diluar tabel

Berdasarkan prinsip pengenceran pada MPN maka seharusnya atau sebaiknya jumlah

tabung positif pada pengenceran lebih pekat akan semakin banyak (1/10>1/100>1/1000),

misalnya 5-3-1. Hal ini dikarenakan setiap pengenceraan mengurangi jumlah mikroorgansime

target dan akibatnya semakin kecil kesempatannya untuk membuat tabung menjadi positif.

Namun seringkali hasil yang didapat tidak sesuai dengan logika peluang, seperti kombinasi 5-

3-4 yang menghasilkan nilai 210. Bisa saja banyak sel tidak sengaja terambil dan

memperbanyak tabung positif di pengenceran selanjutnya atau homogenisasi tidak

berlangsung sempurna. USDA/FSIS (2008:2) menyarankan untuk mengulangi analisa jika

diperoleh kombinasi tabung yang tidak terdapat dalam tabel (misalnya untuk 3 seri tabung :

0-2-3, 1-2-3, 2-1-3 dll.). Diasumsikan bahwa hasil tersebut mencurigakan karena kontaminasi

atau kesalahan praktik lainnya.

Dalam tabel MPN dalam metode MPN yang diterbitkan AOAC (AOAC OM 966.24,

2005:Ch.17,p5) mengenai kombinasi tabung seperti ini diberikan catatan khusus. Misalnya

untuk kombinasi 0-1-2, 1-3-2, 2-0-3 dll. Catatan ini menyarankan bahwa terdapat aspek

ketidakemungkinan yang tinggi jika mendapatkan kombinasi ini yang mengindikasikan

bahwa nilai MPN yang diperoleh dapat lebih rendah dibandingkan konsentrasi sebenarnya.

ISO 7218 (2007:61) menjabarkan tentang pembagian kategori kemungkinan nilai

MPN berdasarkan kombinasi tabung positif dari tabel MPN. Nilai MPN yang diperoleh

dibagi menjadi empat kategori yaitu kategori 1, kategori 2, kategori 3 dan kategori 0.

Kategori 1 memiliki kemungkinan paling tinggi untuk diperoleh, berturut-turut menurun

sampai kategori 0. Disarankan untuk ditentukan terlebih dahulu kategori mana yang

dinyatakan diterima (acceptable), misalnya hanya kategori 1, 1 dan 2 atau 1,2,dan 3. Jika

hasil MPN digunakan untuk menentukan keputusan yang lebih penting maka sebaiknya

dipakai kategori 1 atau 1 dan 2 saja sebagai batas keberterimaan. Sedangkan kategori 0 dapat

dipertimbangkan sebagai nilai yang mencurigakan. Tedapat pola mengenai kombinasi tabung

dan pengelompokan kategorinya. Semakin baik kategori nilai MPN maka kombinasi tabung

positif yang terjadi akan semakin logis (mendekati kenyataan).

3.11.2 Tabung negatif palsu dan positif palsu

Tabung negatif palsu mungkin terjadi jika mikroorganisme target yang terdapat pada

tabung gagal menghasilkan indikasi yang disyaratkan metode untuk dinyatakan sebagai

tabung positif. Beberapa sebab yang dapat diidentifikasi diantaranya adalah :

1. Terdapat bahan yang dapat mematikan dan menghambat mikroorganisme atau

berinterferensi dengan media, misalnya Chlorine pada air.

2. Gagalnya uji penegas dan pelengkap dalam mengidentifikasi mikroorganisme terkait

karenatidak semua (100%) strain mampu dideteksi metabolismenya dengan prosedur

tertentu sehingga tabung penduga yang semula positif dinyatakan menjadi negatif,

misalnya pada metode ISO 7251: 2005 terdapat catatan bahwa strain patogen E.coli tidak

mampu tumbuh pada suhu 44°C saat dikonfirmasi dengan pada EC broth.

3. Tabung durham dilingkupi atau tenggelam oleh substrat sampel padat dari homogenat

sampel sehingga gas tidak mampu terperangkap.

Disarankan tetap melihat pembentukan gas dengan menggoyang tabung sehingga

timbul buih (effervescence). Sedangkan tabung positif palsu dapat disebabkan oleh :

1. Terjadinya tabung positif oleh mikroorganisme non target, misalnya menurut Hussong et

al. (1981:35) beberapa strain Bacillus spp. dan Aeromonas spp. mampu pada membentuk

gas pada tahap penduga. Oleh karena itu pellicle (substansi lengket bakteri; film) tidak

boleh terambil saat diinokulasikan lagi pada tahap penegas dan Coliform umumnya tidak

membentuk pellicle.

2. Kontaminasi oleh bakteri lain termasuk oleh isolat kontrol uji, sehingga disarankan

penanaman isolat kontrol dilakukan setelah analisa.

3. Kontaminasi silang dari tabung yang lain. Oleh karena itu lebih tepat menggunakan

inoculation stick sekali buang saat uji penegas jika pembakaran jarum inokulum berkali-

kali dirasa kurang menjamin sterilisasi.

4. Masih terdapatnya udara pada tabung durham karena kesalahan preparasi media. Jika

terdapat udara pada durham dan tidak timbul buih maka umumnya adalah reaksi negatif.

BAB IV

Kesimpulan

1. Bakteri coliform sebagai suatu kelompok dicirikan sebagai bakteri berbentuk batang

gram negative, tidak membentuk spora, aerobic, dan anaerobic fakultatif yang

memfermentasi laktosa dengan menghasilkan asam dan gas dalam waktu 48 jam pada

suhu 35 C. Coliform digunakan untuk menunjukkan kualitas air minum, yang

kehadirannya di dalam air merupakan bukti bahwa air tersebut terpolusi oleh bahan

tinja dari manusia atau hewan berdarah panas

2. MPN adalah suatu metode perhitungan mikroorganisme berdasarkan data kualitatif

hasil pertumbuhan mikroorganisme pada medium cair spesifik dalam seri tabung

untuk memperoleh kisaran data kuantitatif jumlah mikroorganisme tersebut (MPN/ml

(g)).

3. Prinsip utama metode ini adalah mengencerkan sampel sampai tingkat tertentu

sehingga didapatkan konsentrasi mikroorganisme yang pas/sesuai dan jika ditanam

dalam tabung menghasilkaan frekensi pertumbuhan tabung positif “kadang-kadang

tetapi tidak selalu”. Semakin besar jumlah sampel yang dimasukkan (semakin rendah

pengenceran yang dilakukan) maka semakin “sering” tabung positif yang muncul.

4. Beberapa kelebihan metode MPN yang diambil berdasarkan Oblinger dan Korburger

(1975:541) adalah

1. Akurasi dapat ditingkatkan dengan memperbanyak tabung yang digunakan setiap

pengencerannya.

2. Ukuran (volume) sampel yang cukup besar (dibanding plate count).

3. Sensitivitas umumnya cenderung lebih baik pada konsentrasi mikroorganisme yang

sedikit daripada plate count.

4. Recovery umumnya lebih baik karena menggunakan media cair, tetapi tetap

tergantungm partikel sampel yang mungkin dapat mengganggu.

5. Jika medium spesifik yang sesuai dengan pertumbuhan bakteri target dapat dibuat

maka perkiraan perhitungan MPN dapat dilakukan berdasarkan medium tersebut.