TEKNIK BIOLOGI MOLEKULERAPLIKASINYA DI KLINIK

Paramasari Dirgahayu

Kuliah MKK Peminatan BIOMEDIKMK Biomedik Biomolekuler

14 Agustus 2010

ISOLASI DNA

• .

• B. Tujuan Pembelajaran Setelah melakukan praktikum isolasi DNA,

mahasiswa diharapkan mampu• 1. Menjelaskan struktur dan fungsi materi

genetik• 2. Mengenali dasar-dasar teknik rekayasa

genetika

Separation of nucleic acids from other cell components

Chloroform Iso Amyl Alcohol (CIAA)

• Phenol CIAA

• Phenol

Two phases: ‘phenol’ phase + aqueous phase

Proteins

DNAaqueous phase

‘phenol’ phaseCAUTION

• Taking to much aqueous phase

will result in impure DNA !!

debris

ISOLASI DNA/RNA/PROTEIN SECARA KLASIK

isolasi/ ekstraksi/ purifikasi asam nukleatdengan Metode Collum

Isolasi/ ekstraksi/ purifikasi asam nukleat dilakukan karena DNA/RNA merupakan bahan dasar berbagai teknik molekular biologi

Ekstraksi DNA/RNA dari organisme eukariotik (manusia, hewan, tumbuhan) dilakukan melalui proses :

1. Penghancuran dinding sel2. Penghilangan komponen seluler

seperti protein, lipid dan karbohidrat dari sampel

3. Pengendapan DNA/RNA4. Purifikasi

PRINSIP

1. Berikatan dengan “glass fleece”

2. Garam kaotropik

3. Wash and spin

4. Pelarutan DNA

5. Analisa selanjutnya/ Simpan

Isolasi/ ekstraksi/ purifikasi asam nukleatdengan Metode Collum

Measurement of genomic DNA quality and quantity

Absorption measurement by spectrophotmeter

Measurement of optical density (OD) at a wavelength of 260 nm

Polymerase Chain Reaction

2007

Apakah Metoda PCR ?Metoda PCR adalah suatu teknologi yang dibuat

dengan tujuan dapat membuat tiruan berlipat ganda secara in-vitro enzymatic amplification dari suatu segmen DNA spesifik.

Metoda PCR menyediakan suatu mekanisme untuk mendeteksi target organisme dengan konsentrasi yang sangat kecil dengan spesifitas yang tinggi.

Didalam bidang diagnostik klinik, hanya dibutuhkan jumlah sampel yang sangat sedikit dan dibuat tiruannya berlipat ganda sehingga ada atau tidak adanya virus dan bakteri spesifik serta mutasi materi genetik dapat dideteksi

• Metoda PCR dapat digunakan untuk berbagai aplikasi penting seperti bidang penelitian biologi, genetika, arkeologi, forensik, tes paterniti dan diagnostik klinik

• Teknologi PCR ditemukan oleh Kary Mullis pada tahun 1985.

Tahapan Proses PCR

Pre – PCR : Preparasi reagensia

Preparasi spesimen : isolasi/ purifikasi DNA/ RNA

PCR : proses amplifikasiDenaturasi (pemisahan rantai DNA)

Annealing (penempelan primer)

Extension (pemanjangan oleh enzim)

Post – PCR :Deteksi/ Analisa Hasil PCR

Sekuen Target Target Sequence

DNA StrandDouble HelixDNA StrandSupercoiled

DNA Strand

Chromosome

DNA/ RNA diperoleh dari hasil isolasi/ purifikasi target organisme

Sekuen NukleotidaHydrogen Bonds

Cytosine (C)

Adenine (A)

Thymine (T)

Guanine (G)

Deoxyribose(Sugar molecule)

Phosphoric Acid(Phosphate molecule)

Cytosine (C)

Adenine (A)

Thymine (T)

Guanine (G)

PROSES PCRMaster Mix + target DNA/ RNA

Mg2+

Mn2+

Taq DNA Polymerase

rTth DNA Polymerase

AmpErase®

BiotinylatedPrimer

Target RNAor DNA

dCTP

dTTP

dGTP

dUTP

dATP

and

OR

and

Polymerase Chain Reaction

Mg2+

AmpErase®

Taq DNAPolymerase

BiotinylatedPrimers

Target DNA

PCR

dCTP

dTTP

dGTPdUTP

dATP

BiotinylatedAmplicon

BiotinylatedAmplicon

PROSES PCR : Amplifikasi 1 – Denaturasi oleh panas

Target Sequence

Target Sequence

2 – Penempelan pasangan primer berlabel biotin di kedua ujung

Sekuen TargetTarget Sequence

Target Sequence

Primer 1Primer 2

Biotin

Biotin

5’

3’

5’

5’

3’

5’

3’

3’

3 - Taq DNA Polymerase mengkatalisa pemanjangan Primer sebagai

Komplemen NukleotidaTarget Sequence

Target Sequence

Primer 1

Primer 2

Biotin

Biotin

5’

3’

5’

5’

3’

5’

3’

3’

Taq DNAPolymerase

Akhir Siklus PCR ke-1Hasil 2 tiruan dari Sekuen Target

Target Sequence

Target Sequence

Biotin

Biotin

PCRPolymerase

Chain Reaction)

Cara kerjaPCR REACTION

MIXTUREAdd Add

2xPCR Mix

Template DNA

Primer

DDW

10 µl

1 µl

1 µl

8 µl

25 µl

2 µl

2 µl

21 µl

Total Reaksi 20 µl 50 µlTAMBAHKAN 40 µL MINERAL OIL UNTUK MENUTUPI PERMUKAAN CAIRAN MENCEGAH PENGUAPAN SAAT PCR

SETTING: DENATURASI 94-95 °C ANNEALING: 50-65 °C DAN EXTENSI 72 °C

Deteksi/ Analisa Hasil PCR

Elektroforesis gel agarosa (horizontal)

Eleftroforesis gel poliakrilamid (vertikal)

Enzym labelling oligonucleotide

Biotin-labelled oligonucleotide

Digoxigenin-labelled oligonucleotide

Selanjutnya : RFLP, Sequencing dll.

Definisi

Agarose gel elektophoresis adalah suatu metode untuk memisahkan molekul DNA atau RNA berdasarkan besar molekulnya (BM) Pemisahan molekul tersebut dapat terjadi melalui pergerakan asam nukleat yang “negatively charged “menembus matriks agarose dalam tank electrophoresis.

Molekul dengan berat molekul (BM) rendah akan bergerak lebih cepat daripada molekul yang BM nya besar.

AGAROSE GEL ELEKTROPHORESIS

Aplikasi penggunaan teknik elektrophoresis:

1. Untuk memperkirakan ukuran molekul DNA setelah dilakukan restriksi dengan enzim digesti tertentu

(misal restriction mapping dari clone DNA)

2. Analisis produk PCR, misal untuk kepentingan Analysis of PCR molecular genetic diagnosis atau

genetic fingerprinting

KEUNTUNGAN DAN KERUGIAN

Keuntungan:sampel dapat dipisahkan dan divisualisasi, akan tetapi karena agarose gel tidak bersifat mendenaturasi protein, maka sampel yang sudah di “running” tersebut dapat di purifikasi kembali untuk kepentingan pembuatan plasmid

Gel sangat mudah dibuat dan secara praktis hanya dituangkan ke dalam tank

Kerugian: Gel tersebut dapat meleleh pada saat elektrophoresis

The DNA fragments will separate according to size. To see the DNA bands one must stain the gel with ethidium bromide, a fluorescent dye that intercalates DNA, and excite and view the fluorescence by U.V. transillumination.

The gel may also be photographed.  Unknown bands may be sized by comparison  to molecular weight standards.

The standards should be used to generate a standard curve for interpolation.

 

PRINSIP

PRINSIP PROTOKOL KERJA

PROTOKOL KERJA

D1. Persiapan Agar

- TBE buffer + Agarose + SybrSafe/EtBromide

loading sampelGlycerol & bromophenol blue (6x) 3ml glycerol (30%) 25mg bromophenol blue (0.25%) dH2O to 10mL

Schematic drawing of the electrophoresis process, see text for description of steps

Deteksi Produk PCR: Elektroforesis Gel agarosa

PRAKTIKUM BIOMOL MAHASISWA KBK PBL

Beberapa alternative alamat untuk mencari jurnal

• Ebsco: Google ketik ebsco ketik ebscohost (baris pertama. Username: ns003857. Pasword: Password. Lalu untuk artikel pilih

EBSCOhost Research Database. Klik Medline with fulltext. Pilih Basic Search dan ketik artikel yang dicari

Alternative: Ketik Highwire, bmjjournals, freemedicaljournals, nejm pada

googlePROQUEST:http://www.fk.uns.ac.id lalu ketik proquest atau langsung ketik

www.proquest.com/pqdweb. User: 00C7TQWTJJ; Password: pw pquns