Post on 30-Jul-2015
description
Biotekologi : Rekayasa fermentasi untuk modifikasi antibiotik
(eritromisin)
ERITROMISIN, ANTIBIOTIK HASIL FERMENTASI Sac. erythraea
ANTIBIOTIK MAKROLID BROAD SPECTRUM
SANGAT EFEKTIF SEBAGAI ANTIBIOTIK BAGI PASIEN YANG SENSITIF MAUPUN MIKROBA YANG
RESISTEN TERHADAP ANTIBIOTIK TERTENTU
Struktur eritromisin
Desosamina
Aglikon
OH
O
O
O
O
R3
O
OH
R1
O
O R2
OH
R4
NCH3CH3
O
HO
Kladinosa/Mikarosa
12
3"
3'
9
6
11
CH2
Nama
R1 R2 R3 R4 Gula netral
Eri A OH CH3 CH3 H Kladinosa
Eri B H CH3 CH3 H Kladinosa
Eri C OH H CH3 H Mikarosa
Eri D H H CH3 H Mikarosa
Eri E OH CH3 O Kladinosa
Eri F OH CH3 CH2OH H Kladinosa
PERMASALAHAN
ERITROMISIN TIDAK STABIL DALAM SUASANA ASAM LAMBUNG
MENGALAMI DEKOMPOSISI
TIDAK AKTIF
TIDAK EFEKTIF DIGUNAKAN PER ORAL
REAKSI DEKOMPOSISI ERITROMISIN DALAM SUASANA ASAM (Sakakibara dan Omura, 1984)
O
O
O
O
O
HO
HO
HO
desosamin
kladinosa
O
O
O
O
O
HO desosamin
kladinosa
O
O
O
O
O
O
HO
HO
desosamin
kladinosa
12
O
O
O
OH
O
desosaminO
+ Kladinosa
kladinosaO
HOO
O
O
HO
HO
O
desosamin
9
6
H+ H+
H2O-
H+ H+
H2O-
Eritromisin A 6,9-Ketal-8,9-anhidro- eritromisin A
6,9-Hemiketaleritromisin A
Mekanisme dekomposisi eritromisin dalam suasana asam
6,9;9,12-Spiroketal Eritralosamin
Modifikasi struktur eritromisin
• Untuk membuat turunan eritromisin yang stabil dalam suasana asam
• Modifikasi dilakukan dengan cara mengubah atau melindungi gugus OH (C6) maupun C=O (C9)
• Dilakukan secara kimia, biosintesis hibrid dan rekayasa fermentasi
Modifikasi Kimia (sintesis kimia)(Klaritromisin, Roksitromisin dan Azitromisin)
Azitromisin(Retsema et al., 1987; Fass, 1993)
N
O
OH
OH
O
O
HO
O
O
N
HO
CH3
O
OCH3
OH
O
HON
O
OCH3
OH
Roksitromisin(Kirst and Sides, 1989a,b)
OH
HO
O
OO
OH
O
NOO
OH3C
Klaritromisin(Watanabe et al., 1984, 1990, 1993a,b)
O
O
OCH3
O
OO
HOOH
O
HON
O
OCH3
OH
Bioteknologi : Biosintesis hibrid(Jenie et al, 1998)
Streptomyces ambofaciens MutanSaccharopolyspora erythraea
O
(CH3)2N
OH
O
N(CH3)2
HO
HO
OH
O
OH
OH
OH
mikarosa
mikaminosa
forosamin
Spiramisin
mikaminosa
mikarosaspiralid
forosamin
O
O
O
O
OR
CHO
O
(CH3)2N
O
OH
OHO
N(CH3)2
OHO
Normal
Perlakuan dengan Serulenin
OH
O
OH
OH
OH
O
OH
O
O
O
OH
O
O
O
OH
O
N(CH3)2
HOOH
O
N(CH3)2
OH
O
O
O
OH
O
O
OH
OH
O
N(CH3)2
HOOH
O
N(CH3)2
HOOHOH
O
O
O
OH
O
O
OH
OH
3-O-Mikarosilmikaminosil-5-O-forosaminileritronolid B(MMFE) (Jenie et al., 1998)
3-O-Mikarosil-5-O-mikaminosil- eritronolid B (MME)
3-O-Mikarosil-5-O-forosaminil- eritronolid B (MFE)
TEKNOLOGI FERMENTASI
A. Biosintesis Hibrid
(Jenie et al., 1998) (Jenie et al., 1998)
MFE dan MMFE
O
OH
HO
O
O
O
CH3
O
O
HO
OH
OH
N(CH3)2
O
HO
O
O
O
CH3
O
O
HO
OH
O
N(CH3)2
O OHHO
N(CH3)2
OH
mikarosa mikamnosa
forosamin
MFE MMFE
6 Anhidroeritromisin (Sudibyo et al, 1999)
O
HO
O
O
O
CH3
O
O
HON
H3C CH3
HO
OCH3
OH
Desosamin
kladinosa
O
OH
O
O
O
CH3
O
O
HO
OH
OH
HO
N(CH3)2
mikarosa
desosamin
6Anhidroeritromisin A 6 Anhidroeritromisin D
Biosintesis eritronolidO
SKoA
O
OH
OH SKoAO
O
OH
OH
SKoAO
O
SKoA
COOH
K
O
OH
OH
O
O
KoAS
O
SKoA
OH
OH
O
OH
OH
O
OH
O
OH
OH OH
SKoAO
O
SKoA
OH
+Langkah 1
K, R
Langkah 2
K, R
6
Langkah 3
Langkah 4
K, R, DH, ER
Langkah 5
K, R
Langkah 6K, R
Laktonisasi
Poliketid tereduksi6-deoksieritronolid-B
isoniazidN
ONH2N
H
N
O
N
NH2
O
R
H
Anion Asilisonikotinat Radikal Asilisonikotinat
INH(Asam Nikotinat hidrazid)+ +
N
O
N
O.
N
NH2
O
H
R
N
O
NH2
R
H H
..N
O
NH2
R
H.
..
NAD(P)HNAD(P)+Radikal NAD
Asilisonikotinat-NADH
InhA InhA
Mn2+
Kat G
Mn2+
Kat G
Bioteknologi : Rekayasa biosintesisPenghambatan isoniazid pada langkah ke-4 dalam biosintesis eritronolid
(Sudibyo et al, 1999)
3"
O H
O
O
O
O O
O HH O
O
O C H 3
O H
NC H 3C H 3
O
Eritromisin A
12
3"
O H
O
O
O
O O
H O
O
O C H 3
O H
NC H 3C H 3
O
Anhidroeritromisin A
12
NADP + NADPH + H +
ER
R
NADPH + H + NADP +
O H
OO H
O
S KoA
6
7
DH- H 2 O
K
CO 2
O
HO O C S Ko A
O HS KoA
O H
O
OO H
OO H
O
S KoA
HO
O H
OO H
O
S KoA
H
H
NADPH + INH
Mekanisme aksi antibiotik makrolid (1)
Schlunzen et al (2001)
Terdapat interaksi antara antibiotik makrolid (eritromisin, roksitromisin dan klaritromisin) dengan molekul target di dalam eubacteria berdasarkan data
kristalografi sinar X
Eritromisin, azitromisin dan roksitromisin terikat pada suatu sisi dari rRNA 23S (peptidil transferase) yang
merupakan bagian dari ribosom 50S
Mekanisme aksi antibiotik makrolid (2)
Lovmar et al (2005)
Eritromisin terikat pada suatu sisi rRNA 23S pada bagian Ribosome polipeptide exit tunnel
Pengikatan eritromisin dapat menyebabkan penghambatan perpanjangan sintesis polipeptida
setelah terbentuk peptida 6-8 asam amino
Lovmar et al (2005)
Interaksi dan mekanisme aksi anhidroeritromisin, MFE dan MMFE terhadap target molekul serta potensi
antibiotiknya belum diketahui
Akan dikaji menggunakan metode docking molekul
Dikaji tentang potensi antibiotik berdasarkan pengikatannya dengan molekul target
Molecular Docking (1)
• Adalah suatu metode pemodelan molekul untuk memprediksi orientasi terbaik jika suatu molekul kecil (ligan) terikat pada suatu makromolekul
• Biasa digunakan dalam perancangan obat (drug design), yaitu untuk memodelkan suatu molekul obat sebagai ligan yang terikat pada molekul target seperti protein, enzim atau asam nukleat.
• Interaksi antara ligan dengan makromolekul didasarkan pada prinsip lock and key
Molecular docking (2)
• Afinitas pengikatan antara ligan dengan makromolekul didasarkan pada energi pengikatan dan kecocokan (fitness) interaksi antara ligan dengan sisi aktif makromolekul
• Makin rendah energi pengikatan dan makin cocok (fit) interaksi antara ligan dengan makromolekul, maka afinitas pengikatan makin tinggi
• Dari afinitas pengikatan dapat diprediksikan potensi suatu obat/antibiotik
Metode docking molekul
• Metode pencarian (searching method)o Simulated annealing (SA)o Genetic algorithm (GA)o Lamarckian genetic algorithm (LGA)
• LGA merupakan algoritma terbaik untuk docking terutama untuk ligan dengan derajat kebebasan tinggi dan paling sesuai dengan eksperimen (Morris et al, 1998)
Metode docking molekul (2)
Lamarckian Genetic Algorithm• Merupakan hibrid dari global search genetic
algorithm dan local search Solis and Wet• Genetic Algorithm adalah suatu algoritma
yang diadopsi dari sistem genetika dan evolusi sistem biologis dimana sifat individu (fenotipe) ditentukan dan diturunkan dari genotipe induknya.
• Pada docking molekul genotipe adalah variabel keadaan posisi, orientasi dan konformasi ligan sedangkan fenotipe adalah koordinat lokasi ligan
• Metode Genetic Algorithm terdiri dari mapping and fitness evaluation, selection, cross over, mutation, elitist selection
Fitness evaluation• Evaluasi kecocokan ligan-makromolekul
berdasarkan fungsi energi bebas pengikatan (G)
rRNA 23S (Schlunzen,2001)
Eritromisin A
O
OH
HO
O
O
OH
O
CH3
O
O
HON
H3C CH3
HO
OCH3
OH
Aglikon
Desosamin
kladinosa
6 deoksieritromisin A
O
OH
O O
CH3
O
O
HO
OCH3
OH
HO
N
H3C CH3
HO
O
Anhidroeritromisin A
O
OH
O O
CH3
O
O
HO
OCH3
OH
HO
N
H3C CH3
HO
O
Anhidroeritromisin D
O
OH
O
O
O
CH3
O
O
HO
OH
OH
HO
N(CH3)2
mikarosa
desosamin
MFE
O
OH
HO
O
O
O
CH3
O
O
HO
OH
OH
N(CH3)2
MMFE
O
HO
O
O
O
CH3
O
O
HO
OH
O
N(CH3)2
O OHHO
N(CH3)2
OH
mikarosa mikamnosa
forosamin
Klaritromisin
O
O O
CH3
O
O
HO
OCH3
OH
HO
N
H3C CH3
HO
OCH3
O
Roksitromisin
N
OH
O O
CH3
O
O
HO
OCH3
OH
HO
N
H3C CH3
HO
OH
OO
O
H3C
O
Spiramisin
O
O
O
OCH3
O
OCH3
O
(H3C)2N
HO
N(CH3)2
O
O OH
OH
Kloramfenikol
Parameter docking1. Algoritma Lamarckian Genetic Algorithm.2. Parameter Genetic Algoritm
– populasi awal = 150, – jumlah maksimum generasi = 27.000, laju persilangan (cross over) = 0,8, dan
laju mutasi 0,02.
3. Parameter local search Solis dan Wet – iterations of local search = 300– consecutive successes before changing dan consecutive failures before
changing adalah 4.
4. AutoGrid – grid box = 60
5. Jumlah evaluasi energi = 2,5 x 108
6. Jumlah running = 10
Struktur Kristalografi sinar-X kompleksEritromisin, klaritromisin, roksitromisin,
spiramisin dan kloramfenikol-rRNA 23 S D. radiodurans (Schlunzen et al, 2001)
CHIMERA
Struktur eritromisin, klaritromisin, roksitromisin kloramfenikol
spiramisin
Struktur rRNA 23S D..radiodurans
Perbandingan hasil docking : estimated of free binding of
energy, serta posisi, orientasi, dan konformasi antibiotik-
antibiotik terhadap rRNA 23S
Struktur6 anhidroeritromisin A, 6 anhidroeritromisin D, 6-
deoksieritromisin A, MFE dan MMFE
Optimasi menggunakan GAUSSIAN 98
Membuat struktur 6
anhidroeritromisin A, 6
anhidroeritromisin D, 6-deoksieritromisin A, MFE dan
MMFE dengan MOLDEN
Model pengikatan dan Prediksi potensi antibiotik terhadap
D..radiodurans
DOCKING DOCKING
SKEMA PENELITIAN
Pengikatan molekul antibiotik di dalam makromolekul rRNA 23S (kristalografi sinar X)
Perbesaran….
Docking eritromisin
Estimasi energi bebas pengikatan eritromisin A pada rRNA 23S
Energi
Klaster / ligan
I II III IV V
2 5 9 3 4 10 1 6 7 8
(1) vdW + Hbond + desolv Energi (a)
-9,64 -9,64 -9,65 -9,34 -9,36 -9,35 -9,46 -8,81 -8,19 -8,44
Energi elektrostatik (b) -0,03 -0,03 -0,02 -0,01 -0,02 -0,03 -0,08 -0,26 -0,27 -0,11
Total Energi antar molekul (a + b)
-9,67 -9,67 -9,63 -9,35 -9,38 -9,17 -9,54 -9,07 -8,45 -8,54
(2) Total Energi internal -2,05 -2,05 -2,06 -2,16 -2,12 -2,12 -1,55 -1,90 -2,11 -1,91
(3) Energi bebas torsional 1,92 1,92 1,92 1,92 1,92 1,92 1,92 1,92 1,92 1,92
(4) Unbound System's Energy -0,39 -0,39 -0,39 -0,39 -0,39 -0,39 -0,39 -0,39 -0,39 -0,39
Estimasi energi bebas pengikatan[(1)+(2)+(3)-(4)]
-9,41 -9,40 -9,41 -9,20 -9,19 -9,17 -8,78 -8,66 -8,25 -8,14
Ikatan hidrogen eritromsin A vs rRNA 23S
Docking anhidroeritromisin A pada rRNA 23S
Estimasi energi bebas pengikatan anhidroeritromisin A pada rRNA 23S
Energi
Klaster / ligan
I II III IV V
6 8 9 7 1 4 10 3 2 5
(1) vdW + Hbond + desolv Energi (a)
-9,71 -9,83 -9,85 -9,77 -9,64 -9,65 -9,63 -8,84 -7,60 -7,17
Energi elektrostatik (b) -6,60 -6,22 -6,23 -5,72 -5,28 -5,26 -5,29 -5,03 -6,05 -6,33
Total Energi antar molekul (a + b)
-16,31 -16,04 -16,08 -14,86 -14,92 -14,91 -14,92 14,14 -13,65 -13,50
(2) Total Energi internal -1,67 -1,76 -1,74 -2,01 -2,05 -2,06 -2,06 -2,02 -2,04 -2,05
(3) Energi bebas torsional +1,92 +1,92 +1,92 +1,92 +1,92 +1,92 +1,92 +1,92 +1,92 +1,92
(4) Unbound System's Energy -0,71 -0,71 -0,71 -0,71 -0,71 -0,71 -0,71 -0,71 -0,71 -0,71
Estimated Free Energi of Binding[(1)+(2)+(3)-(4)]
-15,34 -15,17 -15,18 -14,86 -14,34 -14,33 14,34 -13,53 -13,05 -12,91
Rekapitulasi energi pengikatanEnergi Ligan (kkal/mol)
EriA 6-DEA AneriA AneriD CLM CTY MFE ROX MMFE
(1) Final Intermolecular Energy
-9.67 -11.45 -16.31 -17.30 -2.57 -9.89 -8.81 -9.15 -20.97
vdW + Hbond + desolv Energy
-9.64 -11.44 -9.71 -10.78 -6.96 -9.86 -8.87 -9.09 -9.54
Electrostatic Energy -0.03 -0.02 -6.60 -6.51 +4.40 -0.03 +0.06 -0.06 -11.44
(2) Final Total Internal Energy
-2.05 -1.81 -1.67 -1.59 -0.89 -1.43 -2.72 -3.91 -1.10
(3) Torsional Free Energy +1.92 +1.92 +1.92 +1.92 +1.92 +2.20 +1.65 +3.57 +2.47
(4) Unbound System's Energy
-0.39 -0.59 -0.71 -0.42 -0.51 -0.44 -0.39 -2.93 -0.64
Estimated Free Energy of Binding
[(1)+(2)+(3)-(4)]
-9.41 -10.75 -15.34 -16.55 -1.03 -8.68 -9.50 -6.56 -18.96
Ket : EriA = eritromisin A; 6-DEA = 6-deoksieritromisin A; AneriA = 6 Anhidroeritromisin A; AnerD = 6 Anhidro-eritromisin D; CLM = kloramfenikol; CTY = klaritromisin; ROX = roksitromisin; MFE = mikarosil forosaminil eritronolid B; MMFE = mikarosil mikaminosil eritronolidD