Post on 02-Jan-2016
Praktikum Analisis Klinik 2011
KATA PENGANTAR
Puji syukur dipanjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa, atas tersusunnya Petunjuk
Praktikum Analisis Klinik yang ditujukan untuk membantu mahasiswa semester IV Program
Studi Farmasi Klinik dan Komunitas, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.
Mata praktikum Analisis Klinik B ini bertujuan untuk mengajarkan kepada mahasiswa bagaimana
memilih dan menggunakan/menerapkan metode yang tepat untuk menetapkan kadar senyawa-
seyawa endogen dalam tubuh yang memiliki makna klinik (berkaitan dengan penyakit tertentu).
Petunjuk ini hanya memuat cara singkat bagaimana melakukan analisis beberapa parameter
klinik, sedangkan untuk melengkapi pemahaman metode analisis tersebut mahasiswa diwajibkan
membaca literatur aslinya yang tertera pada daftar pustaka buku ini. Aplikasi secara klinik dapat
diperkaya melalui referensi lain yang terkait.
Buku petunjuk ini masih jauh dari sempurna. Oleh karena itu, kritik dan saran demi
menyempurnakan buku ini di masa mendatang sangat diharapkan. Semoga buku petunjuk yang
sangat sederhana ini dapat berguna bagi yang memerlukannya.
Yogyakarta, 2011
Pengampu Praktikum Analisis Klinik :Prof. Dr. Edy Meiyanto, M.Si., Apt. (koordinator)Prof. Dr. Sudibyo Martono, MS., AptDr. Ediati, SE, Apt.Dr. Arif Nurrochmad, M.Sc., Apt Dr. Tatang Irianti, M.Sc., AptArief Rahman Hakim, M.Si., Apt.Muthi' Ikawati, MSc., Apt.Adam Hermawan, M.Sc., Apt
DAFTAR ISI
Laboratorium Analisis Klinik 1
Praktikum Analisis Klinik 2011
Hlmn
KATA PENGANTAR ………………………………………………………………………………... 1
DAFTAR ISI …………………………………………………………………………………………. 2
PENDAHULUAN ……………………………………………………………………………………. 3
I.
II.
PREPARASI SAMPEL DAN PENGAMATAN SEL DARAH ……………………………..
PENETAPAN KADAR KREATININ ……………………………………............................
5
10
III. PENETAPAN KADAR KOLESTEROL TOTAL …………………………………………… 12
IV. PENETAPAN KADAR KARBOHIDRAT TOTAL ........................................................… 15
V. PENETAPAN KADAR UREA NITROGEN .......................................................……….. 18
VI. PENETAPAN KADAR PROTEIN TOTAL………………………………………………...... 23
DAFTAR PUSTAKA
PENDAHULUAN
Laboratorium Analisis Klinik 2
Praktikum Analisis Klinik 2011
A. DESKRIPSI DAN TUJUAN
P raktikum Analisis Klinik mengajarkan kepada mahasiswa bagaimana
memilih dan menggunakan/merapkan metode yang tepat untuk menetapkan kadar senyawa-
seyawa endogen dalam tubuh yang memiliki makna klinik (berkaitan dengan penyakit tertentu).
Praktikum ini bertujuan memperkenalkan berbagai metode penetapan kadar senyawa endogen
dalam tubuh dengan metode enzimatik dan kimiawi untuk penetapan karbohidrat, lipid, protein,
urea dan kreatinin. Setelah mengikuti praktikum Analisis Klinik diharapkan mahasiswa dapat
memahami dan mempraktikkan cara-cara penetapan senyawa-senyawa endogen dan mampu
mengkaitkan arti senyawa-senyawa tersebut dengan berbagai penyakit. Adapun tujuan
pembelajaran khusus setelah mengikuti praktikum ini mahasiswa diharapkan mampu :
1. menjelaskan cara-cara menetapkankadar senyawa endogen dalam tubuh
2. menjelaskan reaksi-reaksi kimia yang terjadi selama praktikum mata acara yang bersangkutan
3. memilih metode yang tepat untuk meneapkan senyawa endogen tertentu
4. menjelaskan arti pentingnya praktikum Analisis Klinik
5. membekali diri untuk pada waktunya bekerja di laboratorium klinik.
B. PELAKSANAAN PEMBELAJARAN
1. Jadwal Kegiatan Dua Mingguan (praktikum 2 minggu sekali)
Prakt. ke-
Topik Prakt. Substansisenyawa
dalam
Metodepenetapan
Fasilitas
I Preparasi sampel Penetapan kadar kreatinin
Plasma darahUrin
Spektrofotometri Buku Petunjuk,Pustaka
II Penetapan kadar karbohidrat Plasma darah Spektrofotometri Buku Petunjuk, Pustaka
III Penetapan kadar kolesterol Plasma darah Spektrofotometri Buku Petunjuk,Pustaka
IV Penetapan kadar urea nitrogen
Urinserum
Spektrofotometri Buku Petunjuk,Pustaka
V Penetapan kadar protein Urin Spektrofotometri Buku Petunjuk, Pustaka
VI Responsi Semua materi praktikum
Ujian tertulis Soal-soal ujian praktikum
2. Metode Pembelajaran dan Bentuk Kegiatan
Kegiatan setiap acara praktikum di laboratorium dimulai dengan
test singkat materi yang akan dipraktikkan (pretest), kemudian mahasiswa melaksanakan acara
praktikum dengan dibimbing asisten dan dosen. Setelah selesai melaksanakan praktikum,
mahasiswa diwajibkan membuat laporan praktikum (laporan sementara perkelompok) yang
Laboratorium Analisis Klinik 3
Praktikum Analisis Klinik 2011
memuat data-data praktikum dan perhitungan kadar. Setelah didiskusikan dalam satu golongan,
laporan akhir pergolongan dikumpulkan pada akhir praktikum dalam bentuk softcopy. Diskusi
lebih lanjut dilakukan secara on-line melalui situs
http://analisisklinikfarmasiugm.wordpress.com/ dan terbuka untuk mahasiswa golongan yang
bersangkutan dalam rentang waktu 2 x 24 jam setelah praktikum. Mahasiswa diwajibkan aktif
dalam forum diskusi tersebut yang akan selalu dipantau dan dibimbing oleh asisten dan dosen
pengampu.
Catatan : selama pelaksanaan praktikum, mahasiswa wajib mentaati segala peraturan
dan menjaga ketertiban. Mahasiswa yang terlambat > 15 menit dan atau pretest telah selesai
dilaksanakan tidak diperkenankan mengikuti praktikum dan wajib melapor pada koordinator
praktikum.
C. EVALUASI PEMBELAJARAN
Aspek penilaian meliputi :
1. Tes pendahuluan 15%
2. Kinerja praktikum 50%(termasuk kinerja di laboratorium (15),
laporan (10), serta keaktifan diskusi di laboratorium maupun on-line (25))
3. Responsi 35%
Nilai akhir ditentukan sebagai berikut:
A jika nilai 75
60 ≤ B < 75
50 ≤ C < 60
40 ≤ D < 50
E ≤ 40
PREPARASI SAMPEL
DAN PENGAMATAN SEL DARAH (Sampel darah)
Laboratorium Analisis Klinik 4
Praktikum Analisis Klinik 2011
Preparasi sampel merupakan hal paling penting dalam suatu analisis klinik karena membutuhkan
waktu paling lama diantara langkah yang lain. Lebih jauh lagi tidak jarang banyak kesalahan terjadi
dalam proses preparasi sampel. Preparasi sampel yang salah dapat menyebabkan kesalahan
dalam interpretasi data klinik yang diperoleh. Maka dari itu setiap langkah dalam preparasi urin
harus benar-benar diperhatikan.
Sampel yang digunakan dalam analisis klinik dapat berasal dari darah maupun urin. Untuk darah
dapat dipilih whole blood, serum, ataupun plasma, tergantung dari data yang diinginkan. Secara
umum langkah-langkah dalam preparasi sampel terdiri dari :
A. PREPARASI PASIEN DAN KOLEKSI SAMPEL (PHLEBOTOMY)
Sebelum dilakukan koleksi sampel tentunya dilakukan identifikasi pasien. Dalam
proses identifikasi ini pasien dicatat nama lengkap, tanggal pengambilan sampel, serta volume
sampel yang diperoleh. Hal ini dilakukan untuk mencegah terjadinya kesalahan pelabelan
yang dapat berakibat pada kesalahan data. Kemudian data ini ditempelkan pada tabung (tube)
untuk koleksi sampel. Setelah itu pasien diberitahukan tentang prosedur pengambilan sampel
dan sebaiknya pasien berada dalam keadaan yang nyaman, terutama untuk koleksi sampel
darah.
Koleksi sampel darah dapat berasal dari kapiler maupun vena. Untuk koleksi darah
arteri sangat jarang digunakan kecuali pada kasus khusus seperti pada analisis gas yang
terkandung dalam darah. Darah kapiler biasanya diperoleh dari ujung jari dan volumenya
sangat kecil sehingga jarang digunakan untuk analisis rutin. Sebelum dilakukan pengambilan
ujung jari dibersihkan dengan alkohol 70% atau dengan air hangat. Kemudian oleskan krim
hidrofobik untuk menjaga sterilitas daerah yang akan diambil darahnya. Ambil darah dengan
menggunakan lancet. Darah akan keluar dengan spontan, kumpulkan dalam tube dan tutup
tempat keluarnya darah dengan plester steril.
Koleksi sampel darah vena tidak jauh berbeda dengan koleksi darah kapiler. Darah
vena biasanya diambil dari lengan karena vena di sini mudah untuk dideteksi. Dalam koleksi
sampel darah dari vena, biasanya digunakan tube tertentu tergantung dari kebutuhan analisis.
Urin merupakan sampel yang paling mudah didapatkan dalam proses klinik. Sampel
urin dapat digunakan untuk mengetahui status fungsi ginjal, kelainan pada saluran kemih, dan
kemungkinan dapat memberikan petanda adanya keabnormalan sistemik. Urin dikoleksi dalam
wadah bersih bebas bahan kimia, tidak steril, dan segera dibawa ke laboratorium dalam waktu
tak kurang dari 30 menit. Bila tidak segera dianalisis, dapat disimpan dalam refregerator, dan
dianalisis dalam waktu tidak lebih 8 jam kemudian. Biasanya sampel urin perlu diberi
preservasi untuk menjaga integritas kandungan analit.
Dalam proses koleksi sampel ini biasanya terdapat kesalahan – kesalahan seperti :
Laboratorium Analisis Klinik 5
Praktikum Analisis Klinik 2011
• Pelabelan salah atau tidak lengkap
• Jumlah tidak mencukupi untuk analisis
• Kesalahan dalam memilih tabung
• Instruksi pada pasien tidak tepat atau kurang lenkap
• Tutup tidak rapat sehingga menyebabkan tumpah atau terkontaminasi
• Gagal dalam memisahkan serum dari sel darah merah dalam waktu 60 menit
• Penjendalan darah tidak berhasil dengan baik
• Terjadi hemolisis
• Terjadi lipemia : kekeruhan pada serum yang disebabkan oleh diet.
B. PEMROSESAN SAMPEL
Setelah dilakukan pengumpulan sampel maka sampel dapat diproses lebih lanjut.
Sampel darah biasanya digunakan serum atau plasma, meskipun sebenarnya tidak ada
perbedaan yang signifikan pada interpretasi data klinik dalam penggunaan serum maupun
plasma. Serum sering digunakan dalam analisis kimia, sedangkan plasma biasa
digunakan untuk analisis amonia, studi koagulasi, dan analisis beberapa trace elements.
Sampel plasma sering digunakan sebagai ganti serum bila proses penjendalan dirasa
lama, namun penggunaan sampel plasma memiliki kelemahan yaitu bila terjadi interaksi
antara antikoagulan dengan analit yang akan diperiksa atau reagen pada proses analisis.
1. Preparasi Plasma dari Whole Blood
Langkah – langkah yang dilakukan adalah :
a. Darah diambil dari vena lengan menggunakan spuit steril dan bantuan tourniquet.
Bersihkan bagian yang disampling dengan menggunakan kapas beralkohol,
tutup dengan plester.
b. Koleksi darah ke dalam tabung (tube) yang mengandung antikoagulan (EDTA,
heparin) sebanyak 3 ml.
c. Tube dibolak-balik 3-5 kali
d. Ambil 1 ml darah pindahkan ke Eppendorf
e. Sentrifuge pada suhu 25o C pada 1300 rpm selama 3 menit
f. Ambil supernatan 250 μl
g. Simpan pada suhu -800 C sampai akan digunakan.
2. Preparasi Serum dari Whole Blood Langkah – langkah yang dilakukan adalah :
a. Darah diambil dari vena lengan menggunakan spuit steril dan bantuan tourniquet.
Bersihkan bagian yang disampling dengan menggunakan kapas beralkohol,
tutup dengan plester.
b. Koleksi darah dalam tabung yang tidak mengandung antikoagulan sebanyak 3 ml
Laboratorium Analisis Klinik 6
Praktikum Analisis Klinik 2011
c. Disarankan dalam koleksi darah menggunakan tabung serum separator
d. Tabung digoyang – balik 5 kali
e. Diamkan selama 30-60 menit sampai terjadi penjendalan di bagian atas atau
dibiarkan semalaman pada suhu 4o C
f. Sentrifugasi pada 3000 rpm selama 10 menit
g. Serum ditempatkan dalam wadah plastik bebas antikoagulan maupun preservatif.
Sampel yang diperoleh dapat segera dianalisis untuk berbagai keperluan klinik.
C. PENGAMATAN SEL DARAH
Pengamatan sel darah dilakukan dengan menggunakan alat hemocytometer (bilik
hitung). Skema hemocytometer :
T/E T T/E
T T
T/E
T T
T/E T/E
Keterangan : Leu = Leukosit; T = Trombosit; E = Eritrosit
1. Perhitungan Leukosit
a. 20 μL sampel darah tambahkan pereaksi Turk 0,5 mL
b. Tunggu 15-20 menit
c. Hitung jumlah leukosit menggunakan hemositometer di mikroskop
Cara menghitung leukosit
1) Pakailah lensa objektif kecil (pembesaran 10x). turunkan lensa kondensor atau
kecilkan diafragma mikroskop. meja mikroskop harus datar,
2) Kamar hitung dengan bidang bergaris diletakkan di bawah objektif dan fokus
mikroskop diarahkan pada garis-garis bagi tersebut. Dengan sendirinya leukosit-
leukosit akan jelas terlihat.
3) Hitunglah semua leukosit yang terdapat dalam keempat "bidang besar" pada
sudut-sudut "seluruh permukaan yang dibagi".
Laboratorium Analisis Klinik 7
Praktikum Analisis Klinik 2011
4) Mulailah menghitung dari sudut kiri atas, terus ke kanan, kemudian turun ke
bawah dan dari kanan ke kiri dan seterusnya. Kadang ada sel yang
menyinggung garis suatu bidang, sel-sel yang menyinggung garis batas sebelah
kiri atau garis atas haruslah di hitung. Sebaliknya sel-sel yang menyinggung
garis sebelah kanan dan bawah tidak boleh dihitung.
Jumlah leukosit = 1 x faktor pengenceran x jumlah sel
terhitung
Vol.kotak
2. Perhitungan Eritrosit
a. 20 μL sampel darah tambahkan pereaksi Hayem 4 ml
b. Tunggu 2-3 menit
c. Hitung jumlah eritrosit menggunakan hemositometer di mikroskop
Cara menghitung eritrosit
1) Turunkan lensa kondensor atau kecilkan diafragma. Meja mikroskop harus
dalam posisi rata air.
2) Atur fokus terlebih dahulu dengan memakai lensa objektif kecil (10 x), kemudian
lensa tersebut diganti dengan lensa objektif besar (40x), sampai garis-garis bagi
dalam bidang besar tengah jelas terlihat.
3) Hitung semua eritrosit yang terdapat dalam 5 bidang yang tersusun dari 16
bidang kecil (misalnya: pada keempat sudut bidang besar di tambah dengan satu
bidang di bagian tengah). Cara dan ketentuan menghitung sel sama dengan cara
menghitung leukosit.
Jumlah eritrosit = 1 x faktor pengenceran x
jumlah sel terhitung
Vol.kotak
3. Perhitungan Trombosit
a. 20 μL sampel darah tambahkan Amonium Oksalat 1% 2 ml
b. Tunggu 3-5 menit
c. Hitung jumlah trombosit menggunakan hemositometer di mikroskop
Cara menghitung trombosit
1) Turunkan lensa kondensor atau kecilkan diafragma. Meja mikroskop harus
dalam posisi rata air.
Laboratorium Analisis Klinik 8
Praktikum Analisis Klinik 2011
2) Atur fokus terlebih dahulu dengan memakai lensa objektif kecil (10 x), kemudian
lensa tersebut diganti dengan lensa objektif besar (40x), sampai garis-garis bagi
dalam bidang besar tengah jelas terlihat.
3) Hitung semua trombosit yang terdapat dalam 10 bidang yang tersusun dari 16
bidang kecil (sesuai dengan skema hemositometer untuk menghitung trombosit).
Cara dan ketentuan menghitung sel sama dengan cara menghitung leukosit.
Jumlah trombosit = 1 x faktor pengenceran x
jumlah sel terhitung
Vol.kotak
Daftar Pustaka
Rai et al., 2005, Plasma Preparation From Whole Blood, Proteomics, 5:3262-3277.
Richterich, R and Colombo, J. P., 1981, Clinical Chemistry, John Wiley & Sons, USA.
PENETAPAN KADAR KREATININ(Sampel: plasma dan urin)
(Metode: Jaffe/modifikasi, tanpa deproteinisasi)
Prinsip:
Metode ini sederhana, untuk penentuan kreatinin dengan bantuan larutan pikrat-basa, tanpa
deproteinisasi.
Pereaksi:
a. Larutan bufer = 6,26 g NaOH dan 0,89 g dalam akuades ad 1000.0 mL.
b. Asam pikrat = 2,0 g dalam akuades ad 1000,0 mL.
c. Larutan kreatinin baku = 1 mg dalam akuades ad 100,0 mL
Laboratorium Analisis Klinik 9
Praktikum Analisis Klinik 2011
d. Asam klorida = 0,83 mL HCL pekat dalam akuades ad 1000,0 mL. (HCl pekat : 36,5 %; bj
= 1,18)
Kondisi pengukuran
Larutan bufer dan asam pikrat direaksikan pada suhu 20-37 ºC (bufer dan larutan asam pikrat
sebelumnya dibiarkan hingga mencapai suhu kamar).
Suhu analisis untuk sampel dan baku harus mirip.
Panjang gelombang (λ) = 492 nm, tebal kurvet 1 cm.
Konsentrasi dalam campuran reaksi akhir adalah sebagai berikut :
Larutan bufer = 125,2 mmol/L dan = 5 mmol/L; As. Pikrat = 3,5 mmol/L
Prosedur :
Sampel (μL) Baku/Blanko (μL)
Plasma atau
Urin (diencerkan 1 : 50)
50 -
Baku/Blanko - 50
Larutan buffer 1000 1000
Campurkan dan inkubasi selama 5 menit pada suhu kamar
Asam pikrat 250 250
Campurkan dan ukur absorban pertama (tidak lebih dari 1 menit) pada λ = 492 nm, tebal
kurvet 1 cm . Selanjutnya, ukur kembali absorban larutan tersebut 2 menit sesudah
pengukuran pertama ( ). Pada suhu > 30ºC, harus diukur tidak lebih dari 30 detik.
Metode tersebut menunjukkan linieritas hingga konsentrasi : 5 mg/100mL(422 mol/L)
Untuk konsentrasi > 5 mg/100 mL, plasma dan urin yang telah diencerkan tadi, harus
diencerkan dalam 1 : 6 larutan NaCl, dan sesudah pengulangan penentuan, hasil dikalikan
dengan 6.
Perhitungan :
Laboratorium Analisis Klinik 10
Praktikum Analisis Klinik 2011
Soal Latihan:
1. Apakah kepentingan penetapan kadar kreatinin dalam analisis klinik ?
2. Bagaimanakah metobolisme kreatinin, dan dimana terdapat ?
3. Tuliskan pembentukan kreatinin pikrat ?
4. Gangguan apa saja yang dapat timbul pada penetapan kadar kreatini dalam plasma
dengan metode pikrat-alkali ?
5. Apakah kelebihan metode Jaffe yang dimodifikasi tersebut ?
6. Bagaimana cara mengatasi problema yang ada pada nomer 4 tersebut ?
7. Pelajarilah metode – metode lain untuk penetapan kadar kreatinin !
PENETAPAN KADAR KOLESTEROL TOTAL
(Sampel: plasma)
A. METODE : LIEBERMANN – BURCHARD
Prinsip :
Bila kolesterol direaksikan dengan asam asetat anhidrid dan asam sulfat pekat dalam
lingkungan bebas air, maka akan terbentuk warna hijau-biru yang intens akibat pembentukan
polimer hidrokarbon tan jenuh.
Pereaksi :
a. Pereaksi kolesterol.
Mula-mula pereaksi cair didinginkan hingga 4ºC, kemudian ditambahkan
dalam wadah ( yang didinginkan dalam ice-bath) sambil diaduk (magnetik) dengan
urutan penambahan sebagai berikut :
Asam asetat glasial (30mL), asam asetat anhidrid (60 mL), dan terakhir asam sulfat
pekat (10 mL).
Laboratorium Analisis Klinik 11
Praktikum Analisis Klinik 2011
Ke dalam campuran tersebut, tambahkan natrium sulfat anhidrat (2 g) dan asam 2,5-
dimetilbenzensulfonat.
(Catatan : Larutan tersebut dalam botol gelap pada 4ºC stabil hingga 2 bulan.
Perubahan warna menjadi sedikit kuning tidak mengganggu reaksi).
b. Baku kolesterol.
Timbang 250 mg kolesterol, masukkan ke dalam labu takar 100 mL. Larutkan
dengan asam asetat glasial (10 mL), selanjutnya tambahkan asam asetat glasial hingga
100 mL. Larutan ini stabil dalam jangka waktu tak terbatas.
Prosedur :
Kerjakan dalam tabung reaksi volume 10 ml :
Water-bath 37 ºC Sampel (ml) Blanko pereaksi (ml) Baku (ml)
Plasma atau serum 0,04 - -
Air demineral - 0,04 -
Larutan baku - - 0,04
Pereaksi kolesterol 2,0 2,0 2,0
Campurkan segera dan biarkan dalam water-bath pada 37ºC selama tepat 10 menit.
Kemudian campurkan dan baca absorban pada λ = 570 nm terhadap blangko pereaksi dalam
waktu tidak lebih dari 5 menit.
Perhitungan :
Lakukan replikasi sebanyak : 3 kali.
B. METODE ENZIMATIK
Prinsip :
Sampel direaksikan dengan reagen/KIT kemudian diinkubasi dalam water-bath pada 37 o C
dan dibaca absorbansinya pada λ 560 nm
Reaksi :
Kolesterol ester + H2O kolesterol esterase kolesterol + as.lemak
Kolesterol + O2 kolesterol oksidase kolesterol-3-one + H2O2
2H2O2+4-aminoantipyrine+phenol peroxidase quinoneimine + 4H2O
Laboratorium Analisis Klinik 12
Praktikum Analisis Klinik 2011
Prosedur :
Kerjakan dalam tabung reaksi volume 10 ml :
Sampel (µl) Blanko pereaksi (µl) Baku (µl)
Plasma atau serum 10 - -
Air demineral - 10 -
Larutan baku - - 10
Pereaksi kolesterol 1000 1000 1000
Campurkan segera sampel/blanko/baku dengan reagen dan biarkan dalam water-bath pada
suhu 37ºC selama tepat 10 menit. Kemudian baca absorban pada λ = 560 nm terhadap
blangko pereaksi pada menit ke 0
Perhitungan :
kadar baku
Lakukan replikasi sebanyak : 3 kali.
LDL kolesterol (mg/dl) = kolesterol total – HDL kolesterol – (Trigliserida / 5)
Soal Latihan:
1. Apakah kepentingan penetapan kadar kolesterol pada analisis klinik ?
2. Bagaimana struktur kolesterol ? Apa yang dimaksud dengan kolesterol total?
3. Apa kelebihan metode Liebermann-Burchard pada penetapan kolesterol ?
4. Tuliskan reaksi yang terjadi pada nomer 3 !
5. Mengapa absorban dibaca pada λ 560 nm ?
6. Apa fungsi masing-masing pereaksi pada metode Liebermann-Burchard ?
7. Apa kelemahan metode Liebermann-Burchard?
8. Jelaskan prinsip metode enzimatik!
9. Sebutkan kelebihan dan kekurangan metode enzimatik!
10. Apakah yang dimaksud dengan HDL, LDL dan TG? Berapa range normalnya?
Laboratorium Analisis Klinik 13
Praktikum Analisis Klinik 2011
PENETAPAN KADAR KARBOHIDRAT TOTAL
(Sampel: plasma)
A. METODE ANILIN
Prinsip:
Bila aldose dan ketose dipanaskan dengan anilin dalam asam asetat glasial, akan terjadi
reaksi dan menghasilkan senyawa berwarna dengan panjang gelombang maks. 340 nm.
Pereaksi:
a. Pereaksi asam triklorasetat (10%).
Larutan 10 g asam triklorasetat dalam air demineral hingga 100,0 mL. Larutan ini
stabil pada suhu kamar.
b. Pereaksi anilin
Larutan 6,0 g anilin (pro analisis) dalam asam asetat glasial hingga 100,0 mL. Larutan
ini stabil untuk beberapa bulan. Perubahan menjadi sedikit kuning tidak menimbulkan
gangguan.
c. Baku glukose
Larutan 110 mg glukose monohidrat dalam larutan jenuh, dingin asam benzoat dalam
air demineral hingga 100,0 mL. Larutan ini stabil dalam jangka waktu tak terbatas.
Prosedur :
Laboratorium Analisis Klinik 14
Praktikum Analisis Klinik 2011
Kerjakan dalam tabung reaksi 10 mL:
Water-bath 37ºC Sampel (mL) Blangko pereaksi(mL) Baku (mL)
Asam triklor asetat 1,0 1,0 1,0
Darah, plasma, serum 0,1 - -
Air demineral - 0,1 -
Baku glucose - - 0,1
Biarkan beberapa saat, kemudian lakukan sentrifugasi dengan kuat.
Pisahkan supernatant
Pereaksi aniline 5,0 5,0 5,0
Supernatan 0,5 0,5 0,5
Panaskan masing-masing tabung reaksi tepat 10 menit dalam water-bath mendidih. Angkat
tabung reaksi, dinginkan dengan air mengalir (air kran) dan baca absorban pada panjang
gelombang 340 - 440 nm, dengan blangko air demineral. Warna tersebut stabil selama 3 jam.
Perhitungan :
Kadar glukose normal dalam plasma = 80 – 120 mg/100 mL.
B. METODE ENZIMATIK
Prinsip:
Prinsip dari metode enzimatik ini adalah enzim GOD akan mengoksidasi glukosa yang
nantinya akan menghasilkan asam glukonat dan H2O2. H2O2 yang dihasilkan setara dengan
glukosa yang bereaksi. H2O2 yang terbentuk akan direaksikan oleh peroksidase dan o-
dianisidin dan kemudian dihasilkan senyawa kunonimin (reaksi Trinder) yang berwarna merah,
yang bisa dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 500nm.
Reaksi:
Glukosa + O2 GOD asam glukonat + H2O2
O-dianisidin H2O2, peroksidase ion semiquinon + 4H2O
Prosedur :
A. Penetapan Kadar Karbohidrat Total
Sampel (µl) Blanko pereaksi (µl) Baku (µl)
Plasma atau serum 10 - -
Laboratorium Analisis Klinik 15
Praktikum Analisis Klinik 2011
Air demineral - 10 -
Larutan baku - - 10
Pereaksi kolesterol 1000 1000 1000
Inkubasi selama 10 menit di waterbath pada suhu 37°C kemudian baca absorbansi pada λ= 500
nm dalam rentang waktu 1 jam.
B. Penetapan Kadar GPT
Ambil plasma sebanyak 100 µl lalu tambahkan dengan reagen I sebanyak 1 ml setelah itu inkubasi
di waterbath selama 5 menit pada suhu 37°C. Tambahkan reagen II sebanyak 250 µl kemudian
segera baca absorbansi pada menit ke 0, 1, 2, dan 3 dengan λ=340 nm. Lakukan replikasi 2 kali.
Perhitungan :
Kadar glukose normal dalam plasma = 80 – 120 mg/100 mL.
Soal Latihan :
1. Apakah kepentingan penetapan kadar karbohidrat total pada analisis klinik?
2. Jelaskan metabolisme karbohidrat/glukose dan penyakit yang terkait ?
3. Apakah dasar penetapan kadar karbohidrat total dengan metade Anilin? Tuliskan
reaksinya !
4. Apakah guna asam triklorasetat tersebut ? Tuliskan reaksinya ! Bahan lain apakah yang
dapat menggantikan fungsi asam triklorasetat tersebut ?
5. Apakah kerugian/ kelemahan metode Anilin untuk penetapan kadar karbohidrat total ?
6. Sebut dan jelaskan metode lain untuk penetapan karbohidrat total !
7. Apakah makna hasil penetapan kadar karbohidrat total, terkait dengan
penyakit/kepentingan diagnose ?
Laboratorium Analisis Klinik 16
Praktikum Analisis Klinik 2011
PENETAPAN KADAR UREA NITROGEN(Sampel: urin dan serum)
Urea merupakan senyawa hasil metabolisme nitrogen. Pengukuran kadar urea nitrogen dapat
dilakukan di dalam cairan tubuh, yaitu serum/plasma dan urin, dimana prinsip pengukurannya
didasarkan pada salah satu dari metode-metode berikut :
1. Reaksi urea dengan α-diketon dan senyawa -oksim
Metode ini dapat menggunakan reagen diacetil, diasetil monoksim, diasetil dioksim,
fenilpropanadion, fenilpropanadion monoksim, α-isonitrosopropiofenon, heptoksim, nioksim,
dan diasetil monoksim glukuronolakton. Akan tetapi metode ini kurang spesifik karena
digunakan juga dalam penetapan kadar sitrulin, alantoin, kreatinin, arginin, protein, dan lain-
lain. Kelemahan lain yang dimiliki metode ini adalah produk warna yang dihasilkan kurang
stabil, tidak memenuhi hukum Lambert-Beer, serta memerlukan deproteinasi dan pemanasan
sampai 100o C.
2. Pengukuran kadar amonia yang dihasilkan dari reaksi urea dengan urease
Pada metode ini, urea dipecah dengan enzim urease enghasilkan CO2 dan amonia.
Selanjutnya amonia yang dibebaskan ditetapkan kadarnya dengan reagen Berthelot. Belum
diketahui adanya senyawa lain dalam tubuh yang mengalami pemecahan yang sama dengan
urea, oleh karena itu metode ini mempunyai spesifitas yang tinggi terhadap urea.
3. Pengukuran dengan elektroda ion selektif
Metode ini memanfaatkan urease yang dilekatkan pada membran dan pengukuran
amonia yang dihasilkan dengan elektrode ion spesifik, tetapi metode ini masih dalam tahap
pengembangan.
4. Pengukuran urea dengan optical test, menggunakan urease dan glutamat
dehidrogenase
Metode ini paling memuaskan karena penggunaan urease dikombinasikan dengan
glutamat dehidrogenase.
Laboratorium Analisis Klinik 17
Praktikum Analisis Klinik 2011
Metode fotometri lain, yaitu menggunakan p-dimetilaminobenzaldehid atau xantidrol, akan tetapi
tidak spesifik dan belum banyak diketahui. Selain metode tersebut, urea dapat diukur dengan
mikrodifusi, gasometri atau metode elektrokimia, tetapi sulit diterapkan untuk pekerjaan rutin
Diantara metode tersebut, metode pemecahan dengan urease dilanjutkan dengan pengukuran
amonia dengan metode Berthelot paling sering digunakan
A. METODE BERTHELOT
Prinsip:
Urea dipecah menjadi amonia dan karbon dioksida dengan pemberian urease. Amonia yang
dibebaskan ditentukan dengan metode Bethelot.
Prinsip dari metode ini sebagai berikut :
NH2
C O + H2O 2
NH3 + CO2
NH2
Amonia yang dihasilkan ditetapkan kadarnya dengan metode Berthelot. Reaksi yang
terjadi sebagai berikut :
I. NH3 + HOCl H2NCl + H2O (pH > 7,5)
As. hipoklorit Kloramin
[Fe(CN)5NO]2- + 2 OH- [Fe(CN)5NO2]4- + H2O [Fe(CN)5H2O]3- +
NO2-
Nitroprusid nitritopentasianoferat
aquapentasianoferat
II. [Fe(CN)5H2O]3- + H2NCl kompleks + fenol
(dalam
medium basa)
*pembentukan monokloramin berlangsung paling cepat pada pH 10.5, sedangkan pada pH > 11.5
berjalan sangat lambat dan pada pH < 10.5 produk monokloramin yang terbentuk cepat
terdekomposisi. Oleh karena itureaksi hendaknya dilakukan pada pH 10.5 – 11.5
Laboratorium Analisis Klinik 18
urease
Praktikum Analisis Klinik 2011
*sensitifitas reaksi dapat ditingkatkan mensubstitusi posisi 2 dari cincin fenol dengan donor
elektron. Senyawa yang direkomendasikan adalah 2-klorofenol. Untuk tujuan klinik, salisilat terbukti
cukup sensitif.
Pengukuran kadar amonia dengan metode Berthelot sangat sensitif dan mempunyai
koefisien ekstingsi molar (ε) sebesar 20000. Selain itu metode ini memiliki spesifisitas yang tinggi
terhadap ion amonium. Reaksi berjalan lambat tapi dapat ditingkatkan dengan penambahan agen
pengkopling, seperti Na-nitroprusid.
Pereaksi :
a. Larutan nitroprusid-salisilat.
Larutan 3 g natrium salisilat dan 60 mg natrium nitroprusid dalam air demineral hingga
100,0 mL. (Larutan ini dapat disimpan selama 6 bulan pada 4 ºC dalam ruang gelap
atau 1 bulan pada suhu kamar).
b. Larutan stok hipoklorit (NaOCl dalam akuades hingga 100,0 mL. Larutan tersebut dapat
disimpan selama 1 bulan pada suhu kamar.
c. Larutan natrium hidroksida (12,5 mol/L).
Larutan 50 g NaOH dalam akuades hingga 100,0 mL.
d. Larutan NaOH-hipoklorit (NaOC1 550 mmol/L; NaOH 6,25 mol/L).
Campurkan dengan jumlah yang sama larutan stok hipoklorit (1,1 mol/L) dengan larutan
NaOH (12,5 mol/L). (larutan ini dapat disimpan selama 6 bulan pada 4ºC dalam ruang
gelap atau 1 bulan pada suhu kamar).
e. Larutan urea-nitrogen baku (20 mg/100 mL atau 7,13 mmol/L).
Larutan 42,8 mg urea dalam larutan jenuh, dingin asam benzoat dalam air demineral
dan encerkan hingga 100,0 mL dengan larutan asam benzoat yang sama. Larutan ini
stabil dalam jangka waktu tak terbatas.
f. Bufer EDTA (27 mmol/L, pH 6,5).
Larutan 1 g .2H20 dalam 99 mL air demineral, atur pH larutan
hingga tepat 6,5 menggunakan larutan NaOH, encerkan dengan air demineral hingga
100,0 mL. Larutan ini stabil dalam jangka waktu tak terbatas.
g. Larutan 25 mg urease dalam buffer EDTA dan encerkan hingga 50,0 mL denngan buffer
tersebut. Larutan stabil selama beberapa minggu pada 4 ºC
Prosedur :
Sampel
(mL)
Blangko sample
(mL)
Baku
(mL)
Blangko baku
(mL)
Laboratorium Analisis Klinik 19
Praktikum Analisis Klinik 2011
Larutan urease 0,1 - 0,1 -
Serum, plasma 0,02 0,02 - -
Larutan baku - - 0,02 0,02
Inkubasi pada 37ºC selama 20 menit atau pada suhu kamar selama 30 menit
Larutan salisilas 2,5 2,5 2,5 2,5
Larutan urease - 0,1 - 0,1
Larutan hipoklorit 2,5 2,5 2,5 2,5
Biarkan masing-masing larutan selama 10 menit pada suhu kamar, kemudian baca absorban
terhadap blangko air demineral pada λ = 546 nm ( 540 – 590 nm).
Perhitungan :
Kondisi normal : Dewasa, n =
347
Urea nitrogen = 7,8 – 21,4 mg/100 mL.
Urea = 16,7 – 45,9 mg/100 mL.
B. METODE ENZIMATIK
Prinsip:
Prinsip dari metode enzimatik ini adalah urea dalam sampel serum atau urin dengan bantuan
enzyme urease akan menghasilkan amoniak dan CO2. Kemudian amoniak bersama dengan
-ketoglutarat, NADH dan dibantu oleh enzyme GLDH akan menghasilkan L-glutamat, NAD
dan H2O. Penurunan absorbansi pada panjang gelombang 340 nm menunjukkan adanya
peningkatan NADH yang digunakan atau peningkatan kadar urea dalam sampel.
Reaksi:
Urea + H2O urease amoniak + CO2
amoniak + -ketoglutarat + NADH + H+ GLDH L-glutamat + NAD + H2O
Prosedur :
Baku (μL) Sampel (μL)
Baku 10
Serum atau - 10
Laboratorium Analisis Klinik 20
Praktikum Analisis Klinik 2011
Urin (pengenceran 101x)
Reagen 1 10 10
Campurkan dan inkubasi selama 5 menit pada suhu 370 C
Reagen 2 250 250
Campurkan dan inkubasi selama 30-40 detik pada suhu 370 C
ukur absorban pertama (menit ke 0) pada λ = 365 nm, tebal kurvet 1 cm . Kemudian, ukur
kembali absorban larutan tersebut 1 menit sesudah pengukuran pertama ( ).
Perhitungan :
Absorbansi sampel atau baku = [(A1 + A2)sampel/baku ] – [(A1 + A2) blanko]
2 2
Kadar urea = Absorbansi sampel x Konsentrasi Baku x faktor pengenceran (untuk urin)
Absorbansi baku
Soal Latihan :
1. Apakah kepentingan penetapan kadar urea-nitrogen dalam analisis klinik ?
2. Tuliskan reaksi yang terjadi pada penetapan kadar urea-nitrogen dengan metode
Betherlot !
3. Apakah kelebihan metode Berthelot pada penetapan kadar urea-nitrogen?
4. Mengapa digunakan air demineral ? Bagaimana cara membuat air demineral?
5. Apakah fungsi EDTA pada penetapan kadar urea-nitrogen tersebut ?
6. Apakah manfaat pada penetapan kadar urea-nitrogen tersebut, terkait dengan
kepentingan diagnose ?
7. Pelajarilah metode lain untuk penetapan kadar urea-nitrogen !
8. Jelaskan prinsip metode enzimatik!
9. Sebutkan keuntungan dan kelebihan metode enzymatik !
10. Jelaskan fungsi masing-masing reagen yang digunakan dalam metode enzymatik !
Laboratorium Analisis Klinik 21
Praktikum Analisis Klinik 2011
PENETAPAN KADAR PROTEIN TOTAL
(Sampel: urin)
A. METODE SPEKTROFOTOMETRI
Prinsip :
Warburg dan Cristian adalah orang yang pertama kali memperkenalkan bahwa dengan
menggunakan persamaan sederhana atau nomogram, dapat dievaluasi konsentrasi protein
dan asam nukleat dari absorban larutan sample pada λ = 280 dan 260 nm. Penentuan
tersebut menggunakan prinsip pengukuran absolut.
Pereaksi :
Larutan natrium klorida 0,9 %.
Larutan 0,9 g NaCl dalam akuades hingga 100,0 mL.
Prosedur :
Blanko (μL) Urin (μL)
Sampel 20 20
NaCl 1000 1000
Absorban larutan sampel yang ditentukan konsentrasi proteinnya diukur pada λ 260 dan 280
nm terhadap blangko larutan NaCl. Replikasi 2x
Perhitungan :
Konsentrasi protein = [1,55 x Abs. pada 280 nm] – [0,76 x Abs.pada 260 nm] mg/mL.
Selanjutnya hasil tersebut dibaca pada Nomogram.
Soal Latihan :
1. Apakah kepentingan penetapan kadar protein dalam analisis klinik ?
2. Apakah dasar penetapan kadar protein secara spektrofotometri UV ?
3. Apakah syarat metode tersebut dapat digunakan ?
4. Gangguan apakah yang ada pada metode spektrofotometri UV tersebut ?
5. Pakah kelemahan spektrofotometri UV penetapan kadar protein ?
Laboratorium Analisis Klinik 22
Praktikum Analisis Klinik 2011
6. Pelajarilah cara lain untuk penetapan kadar protein !
Calculation
According to Layne.
Concentration = [ 1.55 E(280)] – [0.76E(260)] mg
Reading the result straight from the monogram (Fig.105).
Laboratorium Analisis Klinik 23
Praktikum Analisis Klinik 2011
B. METODE BIURET
Prinsip :
Senyawa dengan dua atau lebih ikatan peptida apabila direaksikan dengan garam kupri dalam
suasana basa akan membentuk warna violet.
Pereaksi :
a. Pereaksi basa.
Larutan 36 g urea dalam larutan NaOH ( 20 g/250mL akuades) dan encerkan hingga
100,0 mL dengan larutan NaOH yang sama.
Laboratorium Analisis Klinik 24
Praktikum Analisis Klinik 2011
b. Pereaksi Biuret.
Larutkan 4,25 g dalam lebih kurang 25 mL air demineral.
Larutkan 1,8 g KI dalam lebih kurang 25 mL air demineral.
Larutkan 43,5 g natrium sitrat dan 25 g dalam lebih kurang 250 mL air
demineral. Sambil diaduk/digoyang, tambahkan larutan tersebut di atas, dan
terakhir tambahkan larutan KI.
Masukkan 180 g urea ke dalam larutan terakhir tersebut dengan pengadukan tetap,
selanjutnya encerkan dengan air demineral hingga 500,0 mL.
c. Larutan Biuret.
Untuk penggunaan dalam analisis, campurkan sama banyak volume (1 bagian pereaksi
basa dan 1 bagian pereaksi Biuret).
d. Larutan albumin baku (tahan selama beberapa bulan pada suhu 4ºC).
Larutkan 7 g albumin baku dalam larutan KCl (373 mg/250 mL dalam akuades) yang
telah diatur pHnya hingga 6,5 – 6,8 menggunakan larutan natrium karbonat, selanjutnya
encerkan hingga 100,0 mL dengan larutan KCl tersebut.
Prosedur :
Baku (μL) Urin (μL)
Sampel 20 20
Pereaksi Biuret 1000 1000
Pereaksi Basa 1000 1000
Baca absorban terhadap blanko aquadest antara menit ke 30 dan 40 sesudah pencampuran
pada λ 546 nm.
C. METODE FOTOMETRI DENGAN BROMOKRESOL-GREEN
Prinsip :
Dengan adanya bromokresol hijau dalam suasana asam, albumin yang berwarna kuning hijau
akan diubah menjadi hijau biru dan akan dibaca serapannya pada λ 546 nm.
Prosedur :
Laboratorium Analisis Klinik 25
Praktikum Analisis Klinik 2011
Baku Albumin (μL) Urin (μL)
Sampel 10 10
Reagen 1000 1000
Campurkan dan inkubasi selama 10 menit pada suhu 370 C
Baca absorban terhadap blanko aquadest dalam rentang waktu 60 menit sesudah pencampuran
pada λ 546 nm. Replikasi 2 kali.
Soal Latihan ;
1. Apakah kelebihan penetapan kadar protein cara Biuret dibanding metode spektrofotometri
UV ?
2. Apakah dasar penetapan kadar protein cara Biuret ?
3. Tuliskan reaksi yang terjadi pada penetapan kadar protein cara Biuret ? Jelaskan
mengapa terbentuk warna?
4. Apakah kelebihan penggunaan albumin sebagai standar pada penetapan kadar protein ?
5. Apakah gangguan yang ada pada penetapan kadar protein cara Biuret ?
6. Apakah senyawa pengganti albumin sebagai standar pada penetapan kadar protein ?
7. Jelaskan prinsip penetapan kadar protein dengan metode fotometri dengan bromokresol
green !
8. Sebut dan jelaskan komponen dan fungsi reagen pada metode no. 7 !
DAFTAR PUSTAKA
Christian, G.D., 1994, Analytical Chemistry, John Wiley & Sons, Inc., New York.
Lewandrowski, K., (Editor) 2002, Clinical Chemistry, Laboratory management and clinical correlations, LIPPINCOTT WILLIAMS & WILKINS, A Wolters Kluwer Company, Philadelphia.
Richterich, R. and Colombo, J.P., 1981, Clinical Chemistry, Theory, Practice, and Interpretation, John Wiley & Sons, Chichester.
Smith, R.V. and Stewart, J.T., 1981, Textbook of Biopharmaceutic Analysis, A description of methods for the determination of drug in biological fluids, Lea & Febiger, Philadelphia.
Stryer, L., 1995, Biochemistry, Fourth Edition, W.H. Freeman and Company, New York.
Laboratorium Analisis Klinik 26
Praktikum Analisis Klinik 2011
Laboratorium Analisis Klinik 27