PANDUAN PRAKTIKUMMIKROBIOLOGI (BIO 202P)

Disusun oleh :

Maria Dwi Budi Jumpowati

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI

JURUSAN MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2010

ACARA I

ASISTENSI PRAKTIKUM

A. JADWAL DAN MATERI PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI T.A. 2010/2011

MATERI SUB POKOK BAHASAN WAKTU

Asistensi 1. Penjelasan materi dan tata tertib praktikum2. Evaluasi dan penilaian praktikum3. Pengenalan nama dan fungsi alat4. Tayangan video prosedur kerja praktikum

7 September

Dasar-dasar Teknik Mikrobiologi

1. Sterilisasi2. Pembuatan Media Pertumbuhan (Media

Padat dan Cair)3. Teknik Pemindahan Mikrobia

14 Sept & 21 Sept

Dasar-dasar Teknik Mikrobiologi

1. Pengenalan Mikrobia di Alam2. Teknik Biakan Murni

28 Sept & 5 Okt

Identifikasi Mikrobia Secara Morfologi

1. Morfologi Sel Bakteri : Macam-macam Pengecatan Bakteri

2. Morfologi Koloni Bakteri3. Morfologi Sel Fungi

12 Okt, 19 Okt & 26 Okt

Identifikasi Mikrobia Secara Biokimia

1. Pengujian Mikrobia Secara Biokimia2. Identifikasi Bakteri Tak Dikenal

2 Nov, 9 Nov & 16 Nov

Pertumbuhan Mikrobia (tentatif)

1. Pengukuran Pertumbuhan Secara Langsung2. Pengukuran Secara Tidak Langsung (Viable

Count)3. Penentuan Kurva Pertumbuhan

23 Nov & 30 Nov

REVIEW

B. TATA TERTIB

a. Mahasiswa diharuskan memakai jas praktikum berwarna putih dengan rapi dan sopan.

b. Mahasiswa bekerja secara berkelompok sesuai pengelompokan yang telah ditentukan, dan

masing-masing mahasiswa diharapkan proaktif untuk belajar.

c. Mahasiswa diharuskan bekerja secara terencana, hati-hati dan teliti. Setelah selesai

praktikum, alat-alat maupun bahan yang digunakan harus dikembalikan dalam kondisi

bersih dan utuh.

d. Mahasiswa yang memecahkan, merusakkan dan atau menghilangkan alat diharuskan

melapor ke dosen/assisten jaga dan mengganti alat tersebut secepatnya.

e. Mahasiswa diharuskan menjaga kemurnian bahan-bahan yang dipakai dan menjauhkan

segala macam kontaminan yang dapat mengganggu kevalidan hasil praktikum.

f. Tidak ada inhal.

2

g. Setelah selesai pelaksanaan dan pengamatan praktikum, mahasiswa wajib membuat

laporan data sementara yang akan dikoreksi oleh dosen pendamping. Laporan sementara

yang sudah disetujui assisten bisa langsung dibawa pulang untuk dibuat laporan resmi

mata acara praktikum pada hari itu. Pengamatan dilakukan sesuai kebutuhan dan waktu

yang telah ditentukan.

h. Untuk mengikuti praktikum minggu berikutnya diharuskan sudah menyerahkan laporan

resmi perseorangan dari acara praktikum minggu sebelumnya. Bila pada saat itu tidak

menyerahkan laporan, nilai laporan = 0.

i. Bila mahasiswa berhalangan dan tidak dapat mengikuti acara praktikum yang

menyebabkan nilai-nilainya kosong, maka nilai akhir adalah seluruh nilai yang ada dan

kemudian dikonversi berdasar standart nilai yang telah ditetapkan.

C. PENILAIAN (terintegrasi dengan nilai teori) :

a. Unsur yang dinilai dalam praktikum :

Pretest (lesan) 15 %

Postest (lesan) 15 %

Diskusi 20 %

Aktivitas 20 %

Laporan 30 %

b. Konversi : Nilai Total (N)

N 75,00 = A

60,00 N 75,00 = B

45,00 N 60,00 = C

30,00 N 45,00 = D

N 30,00 = E

D. LAIN- LAIN :

Hal-hal yang belum diatur di sini, akan disampaikan kemudian.

PROSEDUR BAKU PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

3

Setiap praktikan akan selalu berhubungan dengan mikroba patogen selama menjalankan

Praktikum Mikrobiologi. Untuk mencegah hal-hal yang tidak diinginkan, setiap praktikan

diharuskan mentaati peraturan yang telah ditetapkan dan menjalankan petunjuk yang diberikan

assisten/dosen jaga.

1. Tas dan benda-benda lain yang tidak diperlukan diletakkan pada tempat yang disediakan.

Jangan sekali-kali meletakkannya di atas meja laboratorium!

2. Seka-lah baik-baik meja laboratorium dengan desinfektan sebelum dan sesudah kegiatan

laboratorium.

3. Cucilah tangan anda baik-baik dengan air dan sabun sebelum dan sesudah kegiatan

laboratorium. Lakukan hal yang sama bila anda meninggalkan laboratorium untuk ke toilet atau

bila anda ke luar dari ruangan laboratorium.

4. Jangan merokok, makan atau minum di ruang laboratorium.

5. Jauhkan tangan anda dari mulut, hidung, mata dan telinga selama anda bekerja di laboratorium.

6. Perlakukan semua organisme yang anda tangani sebagai patogen atau mampu menimbulkan

penyakit. Kebanyakan biakan yang disediakan laboratorium tidak berbahaya, tetapi beberapa di

antaranya berbahaya.

7. Anda tidak diperkenankan membawa keluar biakan mikroba apa pun dari ruangan

mikroba/ruangan laboratorium.

8. Usahakan supaya mikroba yang anda tangani tidak tercecer dan tidak tercampur dengan

mikroba lain.

9. Bila biakan yang sedang anda pindahkan tercecer ke lantai atau di meja praktikum, tuangkan

desinfektan di atasnya, seka dengan kertas tissue/kapas dan buang di tempat yang disediakan

untuk bahan-bahan bukan kaca yang terkontaminasi.

10. Bila anda memecahkan tabung berisi mikroba, tuangkan desinfektan ke atasnya, sapukan dan

buang di tempat yang disediakan untuk pecahan kaca atau tuangkan spiritus dan kemudian

bakar.

11. Bila anda terkontaminasi atau terluka, hubungi assisten/dosen jaga.

12. Buanglah sampah-sampah yang tidak terkontaminasi di tempat yang disediakan.

13. Jarum inokulasi dan ose harus disterilkan dengan cara memijarkan seluruh panjang kawatnya

sebelum dan sesudah setiap penggunaan. Percikan biakan dapat dihindarkan dengan cara

memulai pemanasan di dalam kerucut api sebelah dalam yang berwarna lebih biru.

14. Apabila pipet yang sama perlu digunakan lebih dari 1 kali, jangan meletakkannya langsung di

atas meja di antara penggunaan, tetapi letakkanlah pada penyangga pipet yang telah tersedia.

15. Api pada pembakar bunsen harus dimatikan pada waktu tidak digunakan.

16. Biakan yang tidak diperlukan lagi serta bahan-bahan bekas pakai yang mempunyai potensi

bahaya harus diletakkan dalam tempatnya masing-masing yang disediakan sebagai berikut :

4

a. Cawan petri, labu dan reaksi diletakkan di tempat yang disediakan.

b. Pipet harus diletakkan dalam wadah berisi desinfektan

c. Kaca obyek dan penutupnya harus diletakkan dalam tempat-tempat khusus yang telah

diberi desinfektan. Bakteri yang ada pada kaca obyek belum tentu mati semuanya

sekalipun telah difiksasi dengan panas, jadi berhati-hatilah menanganinya.

d. Jangan sekali-kali membuang biakan di tempat cuci.

17. Kurangi bercakap-cakap selama praktikum, agar tidak merugikan pekerjaan sendiri atau rekan

lain.

18. Setiap pengerjaan praktikum dan pengamatan harus dicatat dengan cermat.

19. Setiap praktikan diwajibkan membersihkan mikroskop dan mengembalikan ke tempat semula

setelah digunakan, selain itu praktikan diharuskan untuk membersihkan meja kerja, memeriksa

nyala api dan listrik dipadamkan, menutup kran air dan gas, mencuci tangan dengan

desinfektan/lysol, kemudian melapor ke assisten/dosen jaga.

20. Cucilah jas laboratorium dan masker anda sehingga selalu bersih pada waktu anda datang

kembali ke laboratorium pada waktu berikutnya.

ACARA I

PENGENALAN ALAT DAN FUNGSINYA

5

Tujuan : mengenal bermacam-macam alat dan cara penggunaannya pada praktikum mikrobiologi

Beberapa alat yang perlu diketahui fungsinya adalah sebagai berikut :

1. Jarum ose/ loop/sengkelit digunakan untuk menanam mikroba dengan cara goresan/streak

2. Batang bengkok/spreader/batang Drigalsky digunakan untuk menanam mikroba dengan

cara sebar/pulasan/spread

3. Jarum enten digunakan untuk mengambil mikroba berupa biakan jamur/fungi

4. Jarum inokulasi/needle digunakan untuk menanam mikroba dengan cara tusukan

5. Microbiological Safety Cabinet (MSC) adalah ruang/lemari tempat menanam mikroba

6. Autoklaf digunakan untuk sterilisasi alat/bahan/media tertentu dengan menggunakan uap

panas bertekanan (moist heat).

7. Colony counter untuk menghitung jumlah koloni mikroba dan mungkin ukurannya.

8. Mikroskop digunakan untuk pemeriksaan suatu sediaan secara mikroskopis.

9. Inkubator digunakan untuk inkubasi media yang telah ditanami mikrobaa dan untuk

menyimpan bahan pemeriksaan di mana mikroba yang terkandung akan mati bila disimpan

dalam lemari es.

10. Lemari pendingin/refrigerator digunakan untuk menyimpan media steril yang siap pakai

agar isi dan mutu media tersebut tidak berubah, menyimpan untuk sementara waktu

bahan/spesimen yang belum sempat diperiksa agar tidak mengalami perubahan dan

menyimpan cakram antibiotik/antibiotic disk yang belum dipakai agar tidak mengalami

perubahan.

11. Alat-alat lain yang perlu diketahui di laboratorium mikrobiologi : mikropipet, pelobang

sumuran, haemositometer, cawan petri, lampu bunsen, kaca obyek, kaca obyek cekung,

oven, shaker incubator, shaker resiprok, vortex, glass pin, kaca penutup, pinset, gelas arloji,

disk blank, disk antibiotik, filter bakteri, tabung durham, tabung bentuk U.

Pertanyaan:

1. Tuliskanlah alat-alat apa saja yang digunakan di Lab Mikrobiologi yang belum disebutkan

diatas, juga fungsinya!

2. Tuliskan prinsip kerja autoklaf!

ACARA II

DASAR - DASAR TEKNIK MIKROBIOLOGI.

6

Tujuan :

1. Mempelajari cara pembuatan media dan syarat-syarat yang dibutuhkan oleh suatu media

untuk pertumbuhan mikroba.

2. Mempelajari macam-macam teknik sterilisasi

3. Mempelajari cara-cara pemindahan mikroba secara aseptis.

4. Mempelajari teknik-teknik isolasi dan penanaman mikroba.

5. Mengenal bermacam-macam mikroba di alam

B. DASAR TEORI DAN PROSEDUR KERJA :

1. Media dan Cara Pembuatan Media

Pembiakan mikrobia di laboratorium memerlukan media yang berisi zat hara serta

lingkungan pertumbuhan yang sesuai bagi mikroba. Media adalah suatu bahan yang digunakan

untuk menumbuhkan mikroba yang terdiri atas campuran nutrisi atau zat-zat makanan. Selain untuk

menumbuhkan mikroba, media dapat juga digunakan untuk isolasi, memperbanyak, pengujian sifat-

sifat fisiologis dan perhitungan jumlah mikroba (Lay, 1994; Jutono dkk, 1980).

Syarat media yang baik untuk pertumbuhan mikroba adalah lingkungan kehidupannya harus

sesuai dengan lingkungan pertumbuhan mikroba tersebut, yaitu : susunan makanannya (media

harus mengandung air untuk menjaga kelembaban dan untuk pertukaran zat/metabolisme, juga

mengandung sumber karbon, mineral, vitamin dan gas), tekanan osmose yaitu harus isotonik,

derajat keasaman/pH umumnya netral tapi ada juga yang alkali, temperatur harus sesuai dan steril.

Media harus mengandung semua kebutuhan untuk pertumbuhan mikroba, yaitu: sumber energi

(contoh: gula), sumber nitrogen, juga ion inorganik essensial dan kebutuhan yang khusus, seperti

vitamin (Jawetz dkk, 1996).

Berdasarkan komposisi kimianya, media dapat dibedakan menjadi media sintetik yaitu

media yang susunan kimianya diketahui dengan pasti, medium ini biasanya digunakan untuk

mempelajari kebutuhan makanan mikroba. Media non sintetik (kompleks) yaitu media yang

susunan kimianya tidak dapat diketahui dengan pasti, media ini digunakan untuk menumbuhkan

dan mempelajari taksonomi mikroba. Berdasarkan konsistensinya media dapat dibedakan menjadi :

media cair, media padat, dan media padat yang dapat dicairkan (Lay, 1994; Jutono dkk, 1980;

Jawetz dkk, 1996).

Alat dan bahan :

a. Media Nutrien Agar (NA) (Oxoid)

b. Media Nutrien Broth (NB) (Oxoid)

c. Aquades

d. Cawan petri

e. Tabung reaksi

7

f. Batang pengaduk, pipet volume, erlenmeyer, penangas/elemen pemanas

Cara kerja :

1. Timbang media NA (Oxoid) dan NB (Oxoid) sesuai prosedur di kemasan. (Catatan :

Buatlah 50 ml media NA untuk setiap kelompok kecil praktikum dan 50 ml media NB

untuk satu golongan praktikum). Penimbangan media dilakukan secara teliti dan cepat,

kemudian serbuk media dimasukkan secara hati-hati ke dalam erlenmeyer.

2. Tambahkan aquades dan aduk sampai merata dengan batang pengaduk

3. Panaskan dengan hati-hati menggunakan penangas/elemen pemanas sampai media

tercampur homogen (ditunjukkan dengan warna yang kuning jernih). Perhatian :pada saat

pemanasan jangan sampai terbentuk buih berlebihan sampai meluap!

4. Sebelum diotoklaf, tuangkan media NA dengan volume tertentu menggunakan pipet volume

: 5 ml ke dalam tabung reaksi untuk NA miring, 10 ml ke dalam tabung reaksi untuk NA

tegak, 15 ml untuk NA dalam cawan petri untuk percobaan 4b (metode isolasi pour plate),

sisanya untuk NA dalam cawan petri untuk percobaan 6 (pengenalan mikroba di alam).

Tutup tabung reaksi dengan kapas atau penutup tabung (penutupan jangan terlalu rapat!)

5. Sebelum diotoklaf, tuangkan NB ke dalam tabung reaksi untuk 6 kelompok praktikum

dalam 1 golongan. Masing-masing tabung reaksi @ 8 ml. Tutup tabung reaksi dengan kapas

atau penutup tabung (penutupan jangan terlalu rapat!)

6. Sterilkan seluruh media dalam tabung reaksi tersebut dengan menggunakan autoklaf selama

15 menit, tekanan 1 atm 121oC. Pelajari cara mengoperasikan autoklaf dengan benar!

7. Setelah diotoklaf : media NA 10 ml dalam tabung reaksi diletakkan tegak pada rak tabung

dan biarkan memadat, media NA 5 ml inkubasikan miring dan biarkan memadat. Media sisa

NA tuangkan dalam cawan petri dan biarkan memadat (untuk percobaan 6 : pengenalan

mikroba di alam). Media NA 15 ml dibiarkan sampai suhu 45-50oC (untuk percobaan 4b

: metode isolasi pour plate).

8. Media NB dalam tabung reaksi biarkan dingin. Seluruh media NA dan NB ini akan

digunakan untuk percobaan selanjutnya.

2. Sterilisasi

Sterilisasi adalah suatu usaha untuk membebaskan alat-alat atau bahan-bahan dari segala

macam bentuk kehidupan terutama mikroba (termasuk spora mikroba). Penyelidikan sesuatu

spesies mikroba selalu didasarkan atas penyelidikan sifat biakan murni spesies tersebut. Oleh

karena itu, untuk dapat memisahkan kegiatan mikroba yang satu dengan mikroba lainnya, atau

untuk memelihara sesuatu mikroba secara biakan murni, perlu digunakan alat-alat dan medium

yang steril. Suatu benda atau substansi hanya dapat steril; tidak akan pernah mungkin setengah

steril atau hampir steril (Pelczar, 1988)

8

Ada beberapa cara yang umum yang dipakai dalam sterilisasi yaitu: panas, bahan kimia, dan

penyaringan. Macam sterilisasi yang digunakan tergantung pada macamnya bahan dan sifat bahan

(ketahanan terhadap panas, bentuk bahan yang disterilkan : padat, cair atau berbentuk gas).

i. Sterilisasi dengan panas, paling banyak digunakan, dapat dibedakan menjadi 3 jenis, yaitu:

1) Dengan pemijaran, umumnya digunakan untuk mensterilkan jarum platina, ose dan

lainnya.

2) Dengan udara panas kering (dry heat) untuk mensterilkan alat-alat gelas, seperti

erlenmeyer, cawan petri, tabung reaksi, dan alat-alat gelas lainnya.

3) Dengan udara panas lembab (moist heat) yaitu dengan uap air panas bertekanan, alat

yang digunakan disebut autoklaf. Sterilisasi ini merupakan cara sterilisasi yang paling

baik, biasanya digunakan untuk mensterilkan media kultur.

ii. Sterilisasi dengan penyaringan (filtrasi), bahan-bahan lain yang sangat peka terhadap

pemanasan (serum, antibiotika, toksin, vitamin dll) atau relatif tidak tahan terhadap

pemanasan yang tinggi (medium yang mengandung senyawa gula dll) tidak dapat

disterilkan dengan pemanasan, untuk keperluan ini dipakai filter bakteri.

iii. Sterilisasi dengan bahan kimia, bahan-bahan yang mudah rusak bila disterilkan pada suhu

tinggi (dari plastik) dapat disterilkan secara kimiawi dengan menggunakan bahan kimia, gas

atau radiasi. Bahan kimia ialah suatu substansi (padat, cair atau gas) yang dicirikan oleh

komposisi molekuler yang pasti dan menyebabkan terjadinya reaksi, contohnya : senyawa

fenolik, alkohol, klor, iodium, dan etilen oksida. Beberapa bahan kimia yang dapat

digunakan untuk sterilisasi gas yaitu: etilen oksida, asam perasetat, formal dehida dan

glutaral dehida alkalin (Pelczar, 1988; Volk & Wheeler, 1988; Hugo & Russell, 1987).

Prosedur Kerja :

Lakukan prosedur sterilisasi sesuai dengan alat-alat praktikum yang digunakan dalam Acara I

3. Teknik - Teknik Pemindahan Kultur Mikroba

Untuk mencegah tercemarnya biakan murni, perlu diadakan teknik aseptik pada waktu

memindahkan mikroba. Dalam percobaan-percobaan ini akan dipelajari cara-cara memindahkan

biakan murni dengan cara aseptik.

Alat dan bahan :

1. Media NA miring dalam tabung reaksi (hasil percobaan 1)

2. Media NA tegak dalam tabung reaksi (hasil percobaan 1)

3. Media nutrien cair atau NB dalam tabung reaksi (hasil percobaan 1)

4. Jarum ose

5. Jarum inokulasi

6. Kultur murni bakteri E. coli

9

7. Lampu bunsen

8. Vortex mixer

Cara kerja:

1. Siapkan media NA dan NB hasil percobaan 1 (media NA miring, media NA tegak dan

media NB/cair). Pemindahan kultur mikroba dilakukan satu persatu untuk masing-masing

media.

2. Longgarkankan tutup dari masing-masing tabung reaksi yang berisi media (jangan di

lepaskan!).

3. Pegang tabung reaksi yang mengandung kultur murni bakteri E. coli di tangan kiri.

4. Pegang jarum ose pada tangan kanan dan bakar di atas nyala lampu bunsen hingga kawat

memijar. Perhatian : pemanasan jarum ose dilakukan dari pangkal ke ujung sampai

memijar, sebelum digunakan kawat didinginkan beberapa saat!

5. Pegang ose menggunakan ibu jari dan jari telunjuk, gunakan jari kelingking untuk membuka

tutup tabung reaksi (tutup tabung reaksi tetap dipegang seperti posisi semula).

6. Bakar mulut tabung reaksi, masukkan jarum ose dan ambil 1 ose biakan bakteri.

7. Bakar kembali mulut tabung reaksi dan tutup tabung reaksi kembali.

8. Ambillah tabung reaksi yang akan diinokulasi dengan tangan kiri, dengan cara yang sama

buka tutup tabung reaksi, dan bakar mulut tabung reaksi.

9. Inokulasikan biakan bakteri pada tabung reaksi inokulasi dengan cara goresan zigzag pada

permukaan NA miring.

10. Bakar mulut tabung reaksi dan tutup tabung reaksi kembali, kemudian bakar ose.

11. Beri label : tanggal percobaan, nama bakteri, teknik pemindahan dan nama kelompok.

12. Lakukan dengan cara yang sama untuk media nutrien cair/NB menggunakan jarum ose dan

media agar tegak secara tusukan tegak lurus menggunakan jarum inokulasi.

13. Inkubasikan selama 24 jam pada suhu kamar dan amati pertumbuhannya.

4. Teknik-teknik Isolasi atau Penanaman Mikroba

Untuk menanam suatu mikroba perlu diperhatikan faktor-faktor nutrisi serta kebutuhan akan

oksigen (gas, O2 atau udara). Cara menumbuhkan mikroba yang anaerob sangat berbeda dengan

yang aerob. Mengisolasi suatu mikroba ialah memisahkan mikroba tersebut dari lingkungannya di

alam dan menumbuhkannya sebagai biakan murni dalam medium buatan. Untuk isolasi harus

diketahui cara-cara menanam dan menumbuhkan mikroba pada medium biakan serta syarat-syarat

lain untuk pertumbuhannya (Jutono dkk, 1980).

Mikroba jarang terdapat di alam dalam keadaan murni. Kebanyakan merupakan campuran

bermacam-macam spesies mikroba. Macam-macam cara mengisolasi dan menanam mikrobia

adalah : 1). Spread plate method (cara tebar/sebar), 2). Streak plate method (cara gores), 3). Pour

plate method (cara tabur).

10

a. Spread Plate Method (Cara Tebar/Sebar)

Teknik spread plate merupakan teknik isolasi mikroba dengan cara menginokulasi kultur

mikroba secara pulasan/sebaran di permukaan media agar yang telah memadat.

Metode ini dilakukan dengan mengencerkan biakan kultur mikroba. Karena konsentrasi

sel-sel mikroba pada umumnya tidak diketahui, maka pengenceran perlu dilakukan beberapa tahap,

sehingga sekurang-kurangnya ada satu dari pengenceran itu yang mengandung koloni terpisah (30-

300 koloni). Koloni mikrobia yang terpisah memungkinkan koloni tersebut dapat dihitung.

Alat dan bahan :

1. Spreader/batang bengkok/batang Drigalsky

2. Pipet volume, lampu bunsen

3. Media NA dalam cawan petri

4. Kultur murni bakteri E. coli

5. Larutan pengencer (BPW atau NaCl fisiologis 0,9%)

Cara kerja :

1. Buatlah pengenceran 10-1 – 10-6 dari kultur murni bakteri dengan larutan pengencer.

2. Ambil tabung reaksi yang mengandung kultur murni bakteri, buka dan bakar leher tabung.

3. Pindahkan 0,1 ml kultur bakteri secara aseptis ke permukaan media NA dalam cawan petri.

4. Bakar spreader yang sebelumnya telah dicelupkan dalam alkohol, biarkan dingin.

5. Tebarkan/sebarkan kultur bakteri dengan spreader secara merata dan biarkan sampai

permukaan agar mengering.

6. Setelah permukaan agar mengering, selanjutnya inkubasikan secara terbalik selama 24 jam

pada suhu kamar dan amati pertumbuhannya.

7. Bandingkan pertumbuhan dari tiap-tiap pengenceran.

b. Pour Plate Method (Cara Tabur)

Cara ini dasarnya ialah menginokulasi medium agar yang sedang mencair pada temperatur

45-50oC dengan suspensi bahan yang mengandung mikroba, dan menuangkannya ke dalam cawan

petri steril. Setelah inkubasi akan terlihat koloni-koloni yang tersebar di permukaan agar yang

mungkin berasal dari 1 sel bakteri, sehingga dapat diisolasi lebih lanjut (Jutono dkk, 1980)

Alat dan bahan:

1. Media NA dalam tabung reaksi (hasil percobaan 1)

2. Cawan petri steril

3. Kultur murni bakteri E. coli

4. Pipet volume, lampu bunsen

Cara kerja:

11

1. Dinginkan media NA dalam tabung reaksi sampai suhu ± 45 - 500C (cirinya : terasa hangat

di kulit/tidak ‘kemranyas’).

2. Buka tutup tabung yang mengandung kultur murni bakteri, dan bakar leher botol.

3. Pindahkan 1 ml kultur murni bakteri ke dalam tabung reaksi yang mengandung NA secara

aseptis.

4. Bakar leher tabung di atas bunsen, dan tuangkan media NA yang telah mengandung kultur

murni bakteri ke dalam cawan petri.

5. Goyangkan perlahan-lahan untuk mencampur kultur bakteri dengan NA sampai homogen.

Penggoyangan petri jangan terlalu kuat. Pada saat penuangan media, petri bisa diletakkan

dalam radius maksimal 20 cm dari sumber api (zona steril).

6. Setelah agar memadat diinkubasi terbalik pada suhu kamar selama 24 jam. Inkubasi terbalik

dilakukan setelah agar memadat. Amati pertumbuhannya.

c. Streak Plate Method (Cara Gores)

Cara gores umumnya digunakan untuk mengisolasi koloni mikroba pada cawan agar

sehingga didapatkan koloni terpisah dan merupakan biakan murni. Cara ini dasarnya ialah

menggoreskan suspensi bahan yang mengandung mikroba pada permukaan medium agar yang

sesuai pada cawan petri. Setelah inkubasi maka pada bekas goresan akan tumbuh koloni-koloni

terpisah yang mungkin berasal dari 1 sel mikroba, sehingga dapat diisolasi lebih lanjut (Jutono dkk,

1980). Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Bakteri yang

memiliki flagella seringkali membentuk koloni yang menyebar terutama bila digunakan lempengan

yang basah. Untuk mencegah hal itu harus digunakan lempengan agar yang benar-benar kering

permukaannya (Lay, 1994)

Alat dan bahan :

1. Media NA dalam cawan petri

2. Kultur murni bakteri E. coli)

3. Jarum ose

4. Lampu bunsen

Cara kerja :

1. Panaskan jarum ose hingga memijar di atas bunsen, kemudian dinginkan. Gunakan ose yang

telah dingin untuk menggores pada permukaan media agar dalam cawan petri.

2. Ambil 1 ose kultur murni bakteri dan goreskan pada permukaan media agar dimulai pada

satu ujung. Perhatikan teknik penggoresan!

Ose disentuhkan pada permukaan media agar dalam cawan petri, sewaktu menggores ose

dibiarkan meluncur di atas permukaan agar.

12

3. Setiap kali menggoreskan ose untuk kuadran berikutnya, pijarkan ose terlebih dahulu dan

biarkan dingin.

4. Inkubasikan secara terbalik pada suhu kamar selama 24 jam dan amati pertumbuhannya.

5. Pengenalan Mikroba di Alam

Berbagai mikroba seringkali dijumpai di berbagai lingkungan di alam, baik di air, tanah

maupun udara. Percobaan ini bertujuan untuk mengenali macam-macam mikrobia yang ada di alam

seperti bakteri, yeast dan fungi.

Alat dan bahan :

1. Media NA dalam cawan petri (hasil percobaan 1)

2. Aquades steril

3. Cotton bud

4. Spidol

Cara kerja:

a. Cawan petri berisi NA (hasil percobaan 1) dibagi menjadi 4 bagian.

b. Basahi cotton bud dengan air, usap permukaan lantai dan inokulasikan pada cawan petri

(1/4 bagian, beri beri kode 1).

c. Letakkan jari anda pada cawan petri bagian 2 (kode 2).

d. Basahi cotton bud lainnya dan usapkan pada bagian dalam pipi (selaput mukosa mulut),

inokulasikan pada cawan petri (kode 3).

e. Pada bagian ke-4 pada cawan, basahi cotton bud yang lain dan inokulasikan pada tempat-

tempat di sekitar anda yang dimungkinkan terdapat mikroba (misal permukaan kulit yang

berkeringat, permukaan tembok, jendela, atau permukaan alat-alat yang lain).

f. Inkubasi secara terbalik pada suhu kamar selama 24 jam pada suhu kamar dan amati

pertumbuhannya.

g. Amati dan bedakan mikroba yang mungkin tumbuh, apakah bakteri, yeast atau fungi.

C. PERTANYAAN-PERTANYAAN DISKUSI :

1. Apa fungsi agar pada media pertumbuhan?

2. Sterilisasi adalah upaya pengendalian mikroba. Apa tujuan pengendalian mikroba?

3. Pemijaran merupakan salah satu macam sterilisasi secara ………..

Bagaimana prinsip kerjanya?

4. Mengapa pada waktu inkubasi cawan petri harus diletakkan terbalik?

5. Jelaskan prinsip dasar dan tujuan teknik isolasi mikroba secara streak plate, pour plate dan

spread plate!

6. Apa yang dimaksud dengan kultur murni/biakan murni?

13

7. Bagaimana teknik penggoresan yang benar pada teknik isolasi secara streak plate agar

supaya didapatkan koloni bakteri terpisah?

8. Sebutkan mikroba yang tumbuh dan Anda temukan di alam dalam praktikum ini!

Bagaimana ciri-ciri/karakter morfologi untuk membedakan mikroba-mikroba tersebut!

9. Pertanyaan lain dapat diberikan assisten/dosen.

14

ACARA III

III. 1. MORFOLOGI SEL : MACAM-MACAM PENGECATAN

Tujuan: - mempelajari jenis-jenis pengecatan bakteri

Pembuatan pulasan bakteri

1. Labellah objek gelas yang kering dan bersih. Sterilkan jarum ose dengan membakar diatas

pembakar spirtus.

2. Jika kultur dalam bentuk cairan (suspensi), ambillah 1 ose penuh dan letakkan ditengah-tengah

objek gelas dan ratakan.

3. Jika kutur dalam medium padat, ambillah dengan jarum ose satu bagian kecil kultur dan letakkan

ditengah objek gelas yang sebelumnya telah diberi air dan ratakan.

4. Biarkan kering dengan mengangin-anginkan objek gelas.

5. Fiksasi pulasan bakteri dengan menggunakan bahan kimia atau dengan melewatkan diatas

pembakar spirtus (hati-hati, jangan sampai terlalu kering), tergantung jenis pengecatannya.

A. Pengecatan Gram

Pengecatan ini dikembangkan pertama kali oleh Christian Gram (1884) dan termasuk

pengecatan differensial, karena dapat membedakan bakteri yang bersifat gram positif dan gram

negatif.

Dari segi pewarnaan perbedaan antara bakteri Gram positif dan Gram negatif dapat diamati

dengan jelas. Bakteri Gram positif mengikat cat utama (crystal violet) dengan kuat sehingga tidak

dapat dilunturkan oleh cat peluntur dan tidak diwarnai lagi oleh cat lawan (safranin), hal ini

disebabkan karena sifat dinding sel dan sitoplasmanya, yang mempunyai afinitas kuat terhadap

kompleks crystal violet dan iodine (jodium). Bakteri Gram negatif tidak mengikat cat utama secara

kuat, sehingga dapat dilunturkan oleh peluntur dan dapat diwarnai oleh cat lawan.

Perbedaan sifat bakteri Gram positif dan gram negatif tidak mutlak tegas dan spesifik, tetapi

masih tergantung pada beberapa faktor yang dapat menyebabkan variasi dalam pengecatan Gram.

Alat dan bahan:

1. Objek gelas

2. mikroskop

3. Crystal violet

4. Larutan iodine

5. Alkohol 95%

6. Safranin.

7. Minyak immersi

8. Campuran kultur B. subtilis dan E. coli

15

Cara kerja :

1. Buatlah pulasan bakteri diatas objek gelas, keringkan dan fiksasi dengan api.

2. Teteskan cat crystal violet dan diamkan 30-60 detik.

3. Buanglah sisa cat dan cuci sisanya dengan air mengalir.

4. Teteskan larutan iodine dan diamkan selama 1-2 menit.

5. Cuci dengan air mengalir, kemudian di decolorisasi (di beri larutan peluntur) dengan alkohol

(kira-kira 20 detik, hati-hati jangan sampai berlebihan yang mengakibatkan kesalahan hasil).

6. Cuci dengan air mengalir, tambahkan larutan safranin selama 10-20 detik.

7. Cuci kembali dengan air, angin-anginkan dan amati dibawah mikroskop dengan perbesaran kuat,

menggunakan minyak immersi.

B. Pengecatan Acid Fast (Ziehl Neelsen)

Pertama-tama dikembangkan oleh Ehrlich pada tahun 1882, yang kemudian dikembangkan

oleh Ziehl dan Neelsen. Pengecatan acid fast bertujuan untuk membedakan bakteri yang tahan

terhadap pencucian asam (acid fast) dan yang tidak tahan terhadap pencucian asam.

Bakteri tahan asam umumnya mempunyai kandungan lemak kompleks yang tinggi didalam

dinding selnya, hal ini membuat mereka bersifat hidrofobik dan sulit untuk di cat. Penggunaan

carbolfuchsin bersamaan dengan pemanasan membuat lapisan lemak menjadi lunak sehingga cat

dapat menembus ke dalam sel. Selain itu fenol (yang melarutkan fuchsin) lebih mudah larut dalam

lemak dari pada air.

Alat dan bahan :

1. Gelas obyek

2. Mikroskop

3. Cat Ziehl Neelsen carbolfuchsin

4. Peluntur (Alkohol 95%)

5. Metylen blue

6. Kultur Nocardia dan E. coli

Cara kerja :

1. Buatlan pulasan bakteri, dan fiksasi di atas pembakar spiritus.

2. Tutupkan dengan sepotong kertas filter, tambahkan larutan carbolfuchsin, panaskan di atas

pembakar spiritus dengan nyala kecil (hati-hati!), diamkan selama 5-10 menit.

3. Dinginkan, cuci dengan air mengalir dan angin-anginkan.

4. Cuci dengan larutan peluntur sambil digoyang-goyangkan sampai seluruh tak nampak.

5. Cuci dengan air mengalir, keringkan.

6. Bubuhkan dengan cat penutup (metylen biru), selama 20-30 detik.

7. Cuci, keringkan dan amati dengan perbesaran kuat menggunakan minyak immersi.

16

C. Pengecatan Dinding Sel

Pengecatan dinding sel dilakukan dengan menggunakan crystal violet. Dinding sel berwarna

violet, sedangkan sel, akan berwarna ungu muda.

Alat dan bahan:

1. Objek gelas

2. Alkohol 95 %

3. Asam tannic

4. Crystal violet

5. Kultur B. subtilis

Cara kerja:

1. Buatlah pulasan bakteri dan fiksasi dengan alkohol 95% selama 15 menit.

2. Cucilah dibawah air mengalir.

3. Tambahkan asam tannic, biarkan selama 15 menit.

4. Cuci dibawah air mengalir.

5. Tambahkan larutan cat 0,02% crystal violet selama 2 menit.

6. Cuci dan amati dengan perbesaran kuat dengan menggunakn minyak immersi.

D. Pengecatan spora

Sifat spora bakteri adalah tahan terhadap bahan-bahan kimia, sehingga sulit dilakukan

pengecatan spora. Spora dapat dicat dengan menggunakan metylen biru, acid fast atau dengan

pengecatan khusus untuk spora.

Tidak semua bakteri dapat membentuk spora, dan ukuran spora dapat bermacam-macam,

lebih kecil, sama atau lebih besar dari sel vegetatif nya. Letaknya juga bermacam-macam; ditengah

(sentral), diujung sel (terminal) atau subterminal (disebut juga parasentral, jika spora terletak

diantara tengah-tengah dan ujung sel).

Alat dan bahan:

1. Objek gelas

2. Malachite green 5%

3. Safranin

4. Mikroskop

5. Minyak immersi

6. Kultur E. coli dan B. subtilis

Cara kerja:

1. Buatlah pulasan bakteri dan fiksasi diatas pembakar spirtus.

2. Tetesi dengan Malchite green dan panasi (kira-kira 1 menit).

17

3. Cuci dengan air mengalir dan tambahkan cat safranin selama 30-40 detik.

4. Cuci dan amati dengn perbesaran kuat. Spora bakteri akan berwarna hijau.

E. Neisser' s Method

Metoda ini digunakan untuk mengecat granula-granula metakromatik atau volutin yang

merupakan bahan cadangan makanan. Umumnya graula-granula ini banyak terdapat pada sel-sel

yang telah tua dan sel yang telah terhenti pertumbuhannya.

Alat dan bahan:

1. Objek gelas

2. Neisser's metylen biru

3. Neisser's iodine (jodium)

4. Neutral red

5. Kultur Nocardia

Cara kerja:

1. Buatlah pulasan bakteri dan fiksasi dengan panas.

2. Bubuhi dengan Neisser's metylen biru selama 3 menit.

3. Cuci dengan air, tetesi dengan Neisser's iodine selama 1 menit.

4. Cuci dengan air, kemudian lakukan pengecatan dengan menggunakan Neutral red.

5. Cuci dibawah air mengalir. Amati dibawah mikroskop.

Granula volutin akan tampak berwarna biru.

Pertanyaan:

1. Apa fungsi minyak imersi pada pengamatan 1000x atau lebih?.

2. Apakah kelemahan pengecatan gram?

F. Gerakan Bakteri

Tujuan: Untuk melihat pergerakan bakteri di bawah mikroskop maupun pada media pertumbuhan.

Beberapa spesies bakteri yang mempunyai flagella atau filamen yang panjang yang ada

didalam larutan mengadakan pergerakan. Pergerakan ini dapat diamati secara langsung pada

metoda tetes gantung atau secara tidak langsung dengan tusukan.

1. Tetes Gantung / Hanging Drop

Alat dan bahan:

1. Gelas benda dan penutup

2. Tusuk gigi

18

3. Vaselin

4. Biakan murni E. coli dan S. typhimurium

Cara kerja:

1. Dengan menggunakan tusuk gigi, tempatkanlah 4 gumpalan vaselin pada objek gelas kira-kira

seluas ujung-ujung gelas penutup.

2. Letakkan 1 ose kultur pada gelas penutup (jika media padat, tambahkan kultur dengan air).

3. Balikkan gelas benda pada gelas penutup dengan hati-hati sedemikian sehingga ujung-ujung

vaselin pada gelas benda berlekatan dengan gelas penutup.

4. Balikkan dengan hati-hati gelas benda.

5. Amati dengan perbesaran lemah dan dengan menutup sebagian difragma (hati-hati dengan

adanya gerakan "brownian")

2. Cara Tusukan

Alat dan bahan:

1. Tabung reaksi yang berisi 0,2-0,4% agar.

2. Biakan murni E. coli dan S. typhimurium

Cara kerja:

1. Inokulasikan masing-masing biakan bakteri pada media agar yang telah steril dengan

menggunakan jarum inokulasi secara tusukan.

2. Inkubasikan pada temperatur kamar selama 24-48 jam.

3. Amati hasil pertumbuhan dan gambarkan.

Pertanyaan:

1. Bandingkan kedua metoda diatas yang digunakan untuk mendeterminasi pergerakan bakteri.

19

III.2. MORFOLOGI KOLONI MIKROBA

Tujuan: mengenal bermacam-macam bentuk koloni bakteri berdasarkan konsistensi media

pertumbuhannya.

Bentuk-bentuk koloni bakteri digunakan untuk mempermudah identifikasi dan determinasi

suatu biakan murni bakteri. Morfologi-morfologi koloni bakteri dapat dibedakan atas bentuk,

ukuran, tekstur, warna koloni.

Bentuk-bentuk koloni tergantung pada konsistensi medianya. Pada media cair sifat bakteri

pada oksigen sangat mudah dilihat dan penampakan koloninya dapat dibedakan menjadi: serabut,

cincin, dan selaput. Demikan pula pada media agar tegak atau miring, mempunyai bentuk yang

spesifik.

A. Medium Cair

Alat dan bahan:

1. Tabung reaksi

2. Ose

3. Biakan murni bakteri B. subtilis dan E. coli dalam nutrien agar miring

4. Medium nutrien cair

Cara kerja:

1. Siapkan medium yang telah disterilkan.

2. Inokulasikan biakan murni dengan menggunakan ose pada medium cair

3. Inkubasikan pada temperatur 370C selama ± 48 jam

4. Amati pertumbuhan pada permukaan media, kekeruhan, bau dan ada tidaknya endapan.

B. Medium Nutrien Agar Tegak

Alat dan bahan:

1. Tabung reaksi

2. Jarum inokulasi

3. Biakan murni bakteri E. coli dan B. subtilis

4. Medium nutrien agar

Cara kerja:

1. Siapkan medium yang telah disterilkan.

2. Inokulasi biakan murni dengan menggunakan jarum inokulasi secara tusukan sampai ke dalam

tabung.

3. Inkubasikan pada temperatur 370C/suhu kamar selama 48 jam

20

4. Amati pertumbuhannya, merata atau tidak (permukaan, dasar atau keseluruhan), bentuk

pertumbuhan pada bekas tusukan (filiform, echinulate, bead, villous).

C. Medium Nutrien Agar Miring

Alat dan bahan:

1. Ose

2. Medium nutrien padat

3. Biakan kultur bakteri E. coli dan B. subtilis

Cara kerja:

1. Medium yang telah disterilkan diinokulasi dengan biakan murni bakteri dengan menggunakan

ose secara goresan.

2. Inkubasi pada temperatur 370C selama 48 jam.

3. Amati pertumbuhan, tipis, sedang, lebat atau tidak ada, bentuk pertumbuhan pada goresan,

elevasi, kilat, topografi, warna, bau, dan konsistensinya.

D. Media Nutrien Agar (Cawan Petri)

Alat dan bahan:

1. Spreader

2. Cawan NA

3. Kultur E. coli dan B. subtilis

Cara kerja:

1. Inokulasikan 0,1 ml kultur bakteri (perhatikan pengencarannya) pada media NA secara spread

plate.

2. Inkubasikan secara terbalik pada suhu kamar, selama 24 jam.

3. Amati pertumbuhan kedua bakteri dan bandingkan.

Pertanyaan:

1. Untuk pengamatan morfologi, pertumbuhan pada media manakah yang paling valid digunakan.

2. Pertumbuhan pada media cair biasanya digunakan untuk melihat sifat apa?.

21

III. 3. MORFOLOGI FUNGI

Fungi adalah mikroorganisma eukariotik, yang dapat berbentuk uniseluler, disebut yeast

(khamir) ataupun multiseluler, disebut mold (jamur). Dinding sel dari fungi sebagian besar tersusun

atas chitin, selulosa, dan glucan. Mereka tidak dapat mengadakan fotosintesa dan hidup secara

saprofitik. Apapun bentuknya, baik uni atau multiseluler, kesatuan individual dari fungi disebut

thallus.

Fungi yang tumbuh memanjang seperti filamen disebut hifa, dan jika jumlahnya banyak dan

berkoloni disebut miselium. Menurut fungsinya hifa dapat dibedakan menjadi: hifa fertil, hifa yang

dapat membentuk sel-sel reproduktif atau badan buah dan hifa vegetatif, hifa yang berfungsi

mencari makanan kedalam substrat.

A. Jamur

1. Pengamatan langsung

Alat dan bahan:

Petri mengandung biakan jamur

Cara kerja:

Pindahkan tutup petri dan amati secara langsung atau menggunakan loupe, gambarkan dan jelaskan.

2. Preparat basah

Alat dan bahan:

1. Gelas benda dan gelas penutup

2. Mikroskop

3. Biakan jamur: Aspergilus sp, Penicillium sp, Mucor sp, dan Rhizopus sp.

Cara kerja:

1. Bersihkan gelas benda, dan tetesi dengan metylen blue.

2. Ambillah sedikit biakan jamur dengan jarum preparat.

3. Amati dibawah mikroskop dengan perbesaran sedang.

4. Gambar dan beri keterangan.

B. Khamir

Merupakan fungi bersel satu yang mikroskopik yang tidak membentuk pertumbuhan dengan

miselium. Sebagian khamir termasuk dalam kelas Ascomycetes, sebagian kecil termasuk kelas

Basidiomycetes dan Fungi imperfecti. Umumnya khamir berkembang biak dengan budding (tunas).

Khamir mempunyai ukuran 4-20 x lebih besar dari bakteri, tergantung dari spesiesnya.

Dindingnya terdiri dari khitin, dan dibawah dinding sel terdapat membran sitoplasma yang bersifat

permeabel selektif.

22

Morfologi khamir secara mikroskopi dapat diamati baik dengan melakukan pengecatan

maupun tidak. Pengamatan morfologi sel-sel yang masih hidup biasanya digunakan biakan murni

yang masih muda (berumur 24-48 jam). Pengecatan dapat menggunakan pengecatan negatif

ataupun menggunakan pengecatan khusus.

Alat dan bahan:

1. Gelas benda dan penutup

2. Mikroskop

3. Methylen blue

4. Biakan khamir: S. cerevisiae dan Schizosacc. octoporus atau S. pombe.

Cara kerja:

1. Bersihkan gelas benda dan penutup.

2. Letakkan 1 ose biakan khamir ditengah-tengah gelas benda dan campurkan dengan 1 tetes

larutan methylen blue.

3. Tutup dengan gelas penutup, hati-hati jangan sampai terbentuk gelembung.

4. Amati dengan perbesaran lemah dan kuat.

5. Bandingkan kedua jenis sel tersebut diatas (terutama cara pembelahannya).

Pertanyaan:

1. Apa perbedaan antara S. cerevisiae dengan Schizosacc. pombe?.

2. Apa perbedaan antara Rhizopus dan Mucor?.

23

ACARA IV

IDENTIFIKASI BAKTERI SECARA BIOKIMIA DAN DETERMINASI BAKTERI

Bahan:

1. 2 buah petri yag berisi 2 macam bakteri, gram negatif dan gram positif.

2. Bahan pengecatan gram3. H2O2

4. Objek gelas.

5. Bahan untuk oksidase test.

6. Bahan untuk O-F test

7. NA tegak

8. Bahan untuk sitrat test

9. Bahan untuk test dekarboksilase lisin

10. Gelatin

11. TSI.

12. KCN test

13. Test fermentasi karbohidrat

14. Test untuk pembentukan indol

15. Test VP

16. Test urea

Cara kerja:

1. Test untuk tabel I :

a. Pengecatan gram

Lakukanlah pengecatan gram seperti cara yang telah diberikan.

b. Test katalaseLetakkan 1 tetes 10 % atau 30% H2O2 pada objek gelas dan tambahkan 1 ose kultur dari

koloni tunggal. Amati, test positif jika timbul buih seketika.

c. Test oksidase

Letakkan 2-3 tetes larutan tetramethyl-paraphenyldiamine pada keras saring. Ambillah sampel

dari koloni tunggal dan letakkan pada kertas saring yng telah ditetesi reagen. Amati, reaksi positif

terjadi jika timbul warna ungu tua setelah didiamkan selama 10 menit.

d. Test O-F (Oksidasi-Fermentasi)

Inokulasikan media O-F yang mengandung glukosa ( yang ditutup dengan parafi lunak dan

yang tidak ditutup) secara tusukan. Amati setelah 24 jam. Oksidase (terbentuk warna kuning pada

tabung yang tidak ditutup) terjadi pada organisme yang aerobic dan fermentasi ( pada tabung yang

ditutup dengan parafin) terjadi pada anaerobic.

24

e. Test pergerakan

Dengan menggunakan Hanging Drop metode.

2. Test untuk tabel II

a. Penggunaan sitrat

Menggunakan media Koser sitrat, mikroorganisme diinokulasi, kemudian diinkubasi pada

370C selama 48 jam.

b. Test dekarboksilase lisin

Pada medium yang mengandung lisin dan kontrol diinokulasi secara tusukan dan diinkubasi

pada 370C selama 24-48 jam. Positif jika terjadi perubahan warna dari ungu-kuning dan kembali ke

ungu, sementara pada kontrol dari ungu-kuning.

c. Hidrolisis gelatin

Dengan cara tusukan, inokulasikan mikroorganisme pada media yang mengandung gelatin

sekurang-kurangnya 72 jam pada temperatur 370C. Positif berarti terjadi pencairan.d. Pembentukan H2S.

Dengan menggunakan TSI medium, positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna hitam.

Inkubasikan selama 24-48 jam.

e. KCN

Inokulasikanlah KCN broth, tutuplah botol dan inkubasikan ada 370C selama 24 jam. Adanya

kekeruhan menunjukan pertumbuhan yang berarti positif. Catatan: test ini harus dibaca setelah 24

jam, kemungkinan terjadi kesalahan jika terjadi penguapan KCN.

f. Fermentasi karbohidrat.

Inokulasikan media yang mengandung karbohidrat dengan 2 tetes kultur. Inkubasikan selama

24-48 jam. Hasil positif jika terjadi perubahan warna.

g. Pembentukan indol

Inokulasikan tripton atau air pepton dengan 2 tetes kultur tak dikenal. Inkubasikan pada 370C

selama 48 jam. Tambahkan reagen Kovac pada tabung bagian bawah. Adanya warna merah/merah

muda menunjukkan adanya pembentukan indol.

h. VP (Voges Proskauer)

Inokulasikan mikroorganisme pada VP media dan inkubasikan selama 48 jam. Tambahkan 0,6

ml larutan nafto 5% dilanjutkan 0,2 ml KOH 40%. Kocoklah, longgarkan tutupnya, kocok kembali,

ulangi setiap 5 menit, bacalah perubahan warnanya setelah 10-15 menit. Bila tes positif, terjadi

warna merah agak muda.

i. Urease

Inokulasikan urea broth yang mengandung indikator fenol merah dengan 1 tetes kultur.

Amatilah perubahan warna menjadi merah setealah 24 jam pada temperatur 370C

3. Lengkapilah tabel dibawah ini

25

Gram pos Gram neg

Bentuk

PergerakanTumbuh dengan adanya O2

Katalase

Oksidase

Gukosa

O-F test

Identifikasi

Gram neg

Penggunaan sitrat

KCN

Hidrolisis gelatin

Arabinosa

Laktosa

Sukrosa

Adonitol

Dulcitol

Mannitol

Inositol

IndolH2S

Urease

Dekarboksilase lisin

Kontrol dekarboksilase

Identifikasi

Pertanyaan:

1. Mengapa untuk identifikasi bakteri pengecatan gram perlu dilakukan?

26