PEWARNAAN KUMAN

Dian Widiyanti, SSi., MSi., Ph.D

Bagian Mikrobiologi

Fakultas Kedokteran Universitas YARSI

Pemeriksaan mikroskopik kuman

pewarnaan sediaan

Tujuan pemeriksaan mikroskopik adalah :

• melihat bentuk/morfologi kuman

• melihat struktur sel kuman

• mengetahui sifat kuman terhadap zat warna

Zat warna basa, asam dan netral

Zat warna basa (positif/kation berwarna) asam nukleat kuman kuman terwarnai

Zat warna asam mewarnai latar belakang sel kuman disebut pewarnaan negatif

Hasil pewarnaan baik harus memperhatikan

hal berikut :

1. preparat/sediaan kuman baik

2. zat warna harus baik/baru

3. waktu harus tepat

Syarat memperoleh sediaan kuman yang baik:

1. kaca/gelas objek bersih & bebas lemak

2. biakan kuman muda (18-24 jam), kecuali

M. tuberculosis.

3. preparat tipis & rata kuman tersebar &

zat warna merata

Sediaan fiksasi dgn api atau etil alkohol

perekatan kuman, kuman mati/kurang berbahaya,

zat warna mudah meresap, sediaan dpt disimpan

Jenis Pewarnaan

Positif Negatif

1.Sederhana

2.Diferensial (Gram &

tahan asam)

3.Khusus

1.Pewarnaan

negatif

JENIS PEWARNAAN :

1. PEWARNAAN NEGATIF

• Yang diwarnai latar belakang

kuman (back ground) karena

kuman sukar mengikat zat

warna

• Contoh : kuman Spirochaeta dan

simpai/ kapsul kuman

2. PEWARNAAN SEDERHANA

• Satu macam zat warna

• Hasilnya sesuai dgn zat warna yang digunakan,

biru metilen (kuman berwarna biru), air fuchsin

(merah), ungu gentian (ungu)

Bacillus sp (pew. biru metilen) Bacillus sp (pew. karbol fuchsin)

3. PEWARNAAN DIFERENSIAL

• Dua macam zat warna diferensiasi sifat kuman

terhadap zat warna

• Ada 2 (dua) jenis pewarnaan diferensial :

a. pewarnaan Gram

b. pewarnaan Tahan Asam

a. Pewarnaan Gram

• Membedakan kuman Gram positif (ungu) dgn kuman

Gram negatif (merah)

• Pewarnaan paling penting untuk identifikasi spesies

kuman langkah pertama

• Perbedaan sifat Gram karena perbedaan komposisi dinding sel kuman

Skema dinding sel bakteri Gram negatif & positif

Preparat difiksasi

Dituang zat warna UKK

(5 menit)

Lugol (45 – 60 detik)

Alkohol (30 detik)

Air fuchsin (1 – 2 menit)

Kuman berwarna ungu

Terbentuk kompleks

UKK-lugol

Dekolorisasi (Gram neg

tdk berwarna, Gram

pos tetap ungu)

Warna pembanding

(Gram neg berwarna

merah)

Perbedaaan sifat pewarnaan Gram :

1. Teori Salton

2. Permeabilitas dinding sel

• Kuman kokus umumnya bersifat Gram

positif,kecuali Neisseriaceae

• Kuman batang/basil umumnya bersifat Gram

negatif, kecuali genus Bacillus, Clostridium,

Corynebacterium, Listeria, Mycobacterium

Kuman Gram negatif Kuman Gram positif

b. Pewarnaan Tahan Asam

• Diferensiasi kuman bersifat tahan asam dgn tidak

tahan asam

• Dinding sel kuman tahan asam disusun terutama

oleh asam mikolat

• Ada 3 jenis pewarnaan tahan asam :

1. pewarnaan Ziehl-Neelsen

2. pewarnaan Kinyoun-Gabbett

3. pewarnaan Tan Thian Hok

Pewarnaan tahan asam

• Hasil : kuman tahan asam berwarna merah,

kuman tdk tahan asam berwarna biru

• Contoh kuman tahan asam : Mycobacterium

tuberculosis dan M. leprae.

4. PEWARNAAN KHUSUS

• Pewarnaan bagian tertentu sel kuman atau kuman yang

tidak dapat diwarnai dgn cara biasa

Jenis pewarnaan khusus, antara lain :

1. Pewarnaan flagel ( Gray, Novel, Zettnow dan Fontana-

Tribondeau)

2. Pewarnaan simpai/kapsul (Muir, Hiss,Gins-Burri)

3. Pewarnaan spora (Klein)

4. Pewarnaan nucleus/inti (Feulgen)

5. Pewarnaan Neisser untuk kuman C. diphtheriae

6. Pewarnaan kuman Spirochaeta (Becker-Krantz dan

Fontana-Tribondeau)

Pewarnaan kapsul Pewarnaan spora

Pewarnaan Neisser Pewarnaan flagel

ISOLASI & KOLONI KUMAN

CARA MELAKUKAN ISOLASI (MEMBIAK/MENANAM) KUMAN

Tujuan melihat/identifikasi koloni kuman untuk identifikasi

spesies kuman, memperbanyak jumlah kuman

serta mendapatkan biakan murni (pure culture)

Pada media cair : • mencelupkan 1 öse/sengkelit (inoculating loop) berisi kuman dalam spesimen/suspensi • dengan pipet tetes, diteteskan beberapa tetes (2-5 tetes) spesimen/suspensi kuman

Pada media padat :

1. Streak culture (metode goresan) dengan membuat goresan-goresan pada permukaan

media padat (plat) memakai öse yang berisi kuman (biakan lempeng/plat) Goresan-goresan dibuat sejajar tdk bersentuhan

supaya terjadi penipisan jumlah kuman, sehingga diperoleh koloni-koloni terpisah (tdk berhimpitan) untuk memudahkan identifikasi koloni kuman

2. Slant culture dengan membuat goresan-goresan pada permukaan

media padat di tabung (permukaannya dibuat miring) biakan miring

3. Stab culture (biakan tusuk) dengan cara menusukkan öse berisi kuman secara

tegak lurus pada media padat dalam tabung (misalnya media “agar tegak”)

4. Pour culture (biakan tuang)

biakan kuman yg dibuat dengan cara mencampurkan

kuman yang akan dibiak ke dalam media agar yang belum membeku (suhunya tidak terlalu panas sehingga kuman tidak mati), kemudian campuran tersebut dituang ke dalam plat dan dibiarkan membeku (dingin)

• Setelah melakukan inokulasi (penanaman) dilanjutkan dgn inkubasi (pengeraman) dalam alat inkubator pada suhu yg sesuai (biasanya 37C) selama 18-24 jam (kuman aerob) • Untuk kuman anaerob sebelum dimasukkan ke dalam inkubator, dimasukkan dahulu ke dalam “anaerob jar” (sungkup anaerob) untuk menciptakan suasana anaerob, karena kuman anaerob tdk dpt hidup pada suasana aerob (suasana yg terdpt oksigen)

KOLONI KUMAN

• Kuman pada media padat membentuk koloni

• Koloni kuman

sekelompok/kumpulan kuman sebagai hasil pertumbuhan dan perkembangbiakan suatu kuman • Koloni kuman dapat dilihat dan diamati berbeda bentuk dan sifatnya, tergantung jenis kumannya maka

koloni kuman dapat digunakan untuk membantu identifikasi spesies kuman (langkah kedua)

• Untuk identifikasi koloni kuman, diperlukan pengamatan suatu koloni yang terpisah tidak saling berhimpitan koloni terpisah diperoleh dengan cara

inokulasi penipisan goresan yang sejajar tidak saling bersentuhan

Hal-hal yang diperhatikan dalam identifikasi koloni kuman : 1. ukuran/diameter koloni kuman dlm. mm

2. bentuk koloni (bulat/menjalar/bersulam /tidak teratur) 3. penampang permukaan koloni (cekung/cembung/datar) 4. permukaan & tepi halus (Smooth = S) atau kasar

(Rough = R) 5. mengkilap/buram (glossy/opaque) 6. warna koloni (pigmen : putih/kekuningan /kuning emas/ kehijauan/ ungu/merah) 7. jernih atau keruh 8. viskositas koloni : lunak seperti mentega, kering, keras, berlendir/mukoid = M (koloni kuman yg punya kapsul)

9. bila kuman tumbuh pd media agar darah zona

hemolisis.

Jenis zona hemolisis :

> hemolisis (ada zona kehijauan di sekitar koloni) > hemolisis (ada zona hemolisis jernih transparan di sekitar koloni)

> hemolisis gamma (tidak ada zona hemolisis di sekitar koloni)

• kadang-kadang dijumpai koloni yang kerdil (koloni D = dwarf) • Beberapa contoh koloni berpigmen : > koloni pigmen merah mis. Serratia marcesens > koloni pigmen ungu mis. Chromobacterium violaceum > koloni hijau mis. Pseudomonas aeruginosa > koloni kuning emas mis. Staphylococcus aureus > koloni putih mis. Staphylococcus epidermidis > koloni kuning kering mis. M. tuberculosis

Serratia

marcescens colony

Chromobacterium

violaceum colony

Pseudomonas

aeruginosa colony

Staphylococcus

aureus colony

Staphylococcus

epidermidis colony

Mycobacterium

tuberculosis colony

• Beberapa contoh bentuk koloni kuman :

> koloni menjalar mis. kuman Proteus vulgaris > koloni bersulam mis. kuman Bacillus mycoides > koloni mukoid mis. kuman Klebsiella pneumoniae > koloni jernih seperti titik-titik air, dgn zona hemolisis beta mis. Streptococcus pyogenes > koloni jernih dengan zona hemolisis alpha, mis. Streptococcus viridans

Koloni mukoid Koloni menjalar Koloni rough

Koloni smooth

(Staphylococcus)

Koloni smooth

(Streptococcus) Koloni bersulam

PERBENIHAN/MEDIA KUMAN

Manfaat membiak/ isolasi kuman

Tujuan mempelajari koloni kuman guna

mengidentifikasi spesies kuman

Syarat perbenihan/media kuman :

1.mengandung bahan nutrisi, garam, air

yang diperlukan kuman (dalam jumlah

cukup)

2.bebas bahan kimia,dll. yang menghambat

pertumbuhan kuman

3.pH sesuai dengan sifat kuman

4.steril

JENIS-JENIS PERBENIHAN

KONSISTENSI NUTRISI MANFAAT

1.Cair

2.Semisolid

3.Padat

1.Sederhana

2.Diperkaya

1. Transport

2. Persemaian

3. Diferensial

4. Selektif

5. Eksklusif

6. Khusus

Jenis media berdasarkan konsistensi :

1. Perbenihan cair

Tempat : botol/tabung

Contoh : air pepton, kaldu nutrient, kaldu darah, kaldu

BHI (brain heart infusion), kaldu thioglikolat.

Bentuk pertumbuhan:

• keruh (turbidity)

• pellicle mis. Vibrio, Pseudomonas

• sedimen mis. Kuman anaerob

• granulasi mis. Yersinia

Granulasi

2. Perbenihan semisolid (1/2 padat)

Tempat : tabung

Mengandung 0.5% agar-agar

Contoh : Media untuk melihat gerak kuman dan

media transport

3. Perbenihan padat/solid Tempat : tabung / cawan Petri (plat)

Bahan pemadat mengggunakan

a. agar-agar 1.5-2.0% (agar-agar murni)

b. serum sapi, kelinci, kuda (mis. Perbenihan

Loeffler untuk kuman C. diphtheriae)

c. telur, mis. Perbenihan Loewenstein Jensen

(mengandung telur bebek) utk kuman

M. tuberculosis

• Kuman tumbuh koloni

• Koloni berbeda bentuk dan macamnya

membantu identifikasi (langkah ke-dua)

Jenis media berdasarkan nutrisi

1. Perbenihan/media sederhana

Mengandung bahan nutrisi pokok

saja

Contoh : media agar nutrient ( isi :

agar-agar + pepton)

2. Perbenihan/media diperkaya (enriched)

Penambahan bahan tertentu

Contoh :

• Darah (agar darah),

• Serum (Loeffler)

• Telur, cairan ascites, as.Amino esensial,

vitamin, yeast dsb.

Jenis media berdasarkan guna/manfaat :

1. Media transport • Fungsi transport spesimen ke lab.

• Bentuk semisolid dalam tabung tertutup (prop

plastik)

• Mengandung cukup nutrisi utk kuman kuman tdk

mati

Contoh media Charcoal, Carry-Blair, Stuart, Amies.

2. Media persemaian

• Bentuk cair, dalam tabung/botol

• Fungsi memperbanyak jumlah kuman ttt

dlm spesimen dgn menyingkirkan

faktor-faktor penghambat

pertumbuhan kuman tsb.

Contoh :

• media empedu (Gal/bile) S. typhosa

• media air pepton alkalik Vibrio (pH 8.0)

• media selenit dan Kauffman kuman enteric

3. Media diferensial • Fungsi untuk membedakan sifat

pertumbuhan kuman, karena mengandung bahan tertentu

Contoh :

• media Agar Darah diferensiasi kuman berdasarkan sifat

hemolisanya thdp eritrosit • media agar Endo diferensiasi kuman peragi laktosa

dgn non peragi laktosa

Agar darah Agar Endo

4. Media selektif

• Fungsi membiak kuman yang diinginkan

• Mengandung bahan yg menghambat

pertumbuhan kuman yg tdk diinginkan

Contoh

• media untuk kuman enteric, mis. Media

SS (Salmonella-Shigella); media WB

(Wilson-Blair)

5. Media eksklusif

Media yang daya seleksinya lebih baik

Contoh :

- media TCBS (thiosulphate citrate bile

sucrose) utk Vibrio

6. Media khusus

Mis. untuk kuman anaerob, kuman Gonococcus,

Leptospira dsb.

Media utk kuman anaerob, a.l. :

a. media thioglikolat mengandung Na-thioglikolat

(reduktor O2) dan rezasurin (indikator O2)

b. media Tarozzi mengandung potongan jaringan

segar, mis. hati (sumber enzim katalase,peroksidase &

superoksid-dismutase)

Media untuk Gonococcus Thayer Martin (mengandung

antibiotik vancomicin, colistin, nistatin)

Media untuk Leptospira EMJH & Korthof (mengandung

albumin serum)

• Kuman anaerob tdk memiliki enzim

yg mengubah H2O2 (bersifat toksis)

sehingga akan mati, karena itu perlu

media khusus dan suasana khusus

(anaerob)