SISTEM PENGHANTARAN TERAPI GEN
Sistem penghantaran terapi gen menurut Lundstrom et all terbagi menjadi 2
kelompok, yakni melalui vektor viral dan non viral. Adapun yang termasuk ke dalam vektor
viral seperti menggunakan retrovirus, adenovirus, virus terkait adeno/ Adeno Associated
Viruse (AVV). Sedangkan vektor non viral dibedakan menjadi tiga kategori yakni, partikel
inorganik, bahan sintetik/partikel biodegradable, dan metode fisika. (Gascon, 2013). Ponder
dalam buku An Introduction To Molecular Medicine and Gen Therapy menyebutkan
pertimbangan utama dalam menentukan vektor dan sistem penghantaran yang optimal adalah:
1. Sel target serta kemampuannya untukdi transduksi secara viral
2. Waktu yang diperlukan gen untuk berekspresi
3. Ukuran materi Genetik yang akan ditransfer
Desain Unit Perekaman untuk Terapi Gen Sel Somatik
DNA rekombinan pelengkap (complementary DNA-cDNA) atau gen yang mengkode
protein terapeutik, seperti semua gen prokarot atau eukariot, harus mengandung seluruh
elemen yang diperlukan untuk mengarahkan rekaman gen, meliputi tempat mulai, dan
pembimbing serta penguat yang menentukan tingkat dan pengaturan sel spesifik
produksimRNA yang mengkode produk gen terapeutik. Kontrol rekaman gen yang
dimasukkan diarahkan pada rangkaian nukleotida elemen yang memerankan cis) yang
dikenali oleh protein nukleus yang terdapat pada sel sasaran.
Faktor yang memerankan trans ini mengarahkan rekaman produksi RNA dari DNA)
pada gen yang disisipkan. Elemen-elemen perekaman, yang meliputi penguat, pembimbing,
penenang, tempat awal perekaman, tempat sambungan-donor RNA, isyarat penghentian dan
poliadenilasi yang dapat digabungkan untuk mencapai tingkat mRNA yang dikehendaki,
serta spesifitas sel dan jaringan atau tanda-tanda pengaturan gen lain yang diperlukan untuk
mencapai perbaikan fisiologis yang dibawa oleh protein rekombinan.
Sistem Vektor
Vektor ideal akan mampu mengarahkan pemberian secara in vivo lewat berbagai rute,
menyediakan untuk penghantaran yang ditargetkan pada sel yang diinginkan,dengan aman
terintegrasi ke dalam genom sel somatik, dan dipindahkan ke semua sel anakan. Tempat
integrasi gen akan bersifat spesifik meliputi pemotongan gen yang tidak sempurna dan
penggantiannya dengan gen normal. Akhirnya vektor harus diintegrasikan ke tempat
nononkogenik pada genom dan memerlukan pemberian tunggal. Sementara kemajuan yang
berarti telah dibuat dalam menyelesaikan beberapa hambatan teknis, vektor yang tersedia
tidak dapoat memenuhi salah satu dari kriteria-kriteria ini. Virus, sasaran ligan, dan vektor
berselimut DNA dapat digunakan untuk menghantar gen. Setiap metode ini memiliki
keterbatasan dan kelebihan, tetapi tidak ada satupun yang telah dimanfaatkan untuk
penggunaan terapeutik.
Sistem Vektor Pada Virus
Teknik virus menggunakan berbagai kelas virus sebagai alat untuk
pengiriman gen . Virus memperkenalkan DNA mereka ke dalam sel dengan efi siensi tinggi.
Oleh karena itu untuk mengambil keuntungan ini dengan memperkenalkan gen asing ke
dalam virus dan kemudian menggunakan sifat virus untuk memberikan gen ini dengan
efisiensi tinggi ke sel target. Terapi gen vektor sedang dikembangkan oleh genetik modifi
kasi retrovirus, adenovirus, parvoviruses (adeno terkait
virus ), dan lain-lain. Vektor ini digunakan untuk mentransfer terapi gen ke dalam sel target
dan dengan demikian direkayasa dengan menghapus gen penting yang memungkinkan
replikasi , perakitan , atau infeksi. Gen ini dapat diganti dengan gen terapeutik untuk
membuat genom vektor terapi gen . Replikasi defi siensi menjamin keamanan vektor virus ,
namun di sisi lain , vektor perlu diproduksi di sejumlah besar partikel virus . Untuk tujuan
ini , ada baris sel khusus yang disebut " garis sel kemasan " ( kbs) direkayasa untuk
menggantikan fungsi dari gen virus dihapus dan untuk produksi virus rekombinan
Retrovirus, adenovirus dan vektor terkait-adeno (VTA) (adeno-associated
vector(AAV)) kini digunakan sebagai protokol terapi gen manusia. Vektor virus untuk terapi
gen harus bersifat tidak toksik, monogenik dan replikasi tidak sempurna. Penggunaan vektor
virus pada terapi gen manusia memerlukan banyak modifikasi pada genom virus sebelum
digunakan.
Vektor untuk Terapi Gen
1. DNA plasmid (liposom,kompleks DNA-ligan, telanjang)
3. Retrovirus (Virus RNA)
4. Adenovirus (Virus DNA)
5. Virus terkait Adeno (VTA/AVV)
Misalnya, retrovirus adalah onkovirus, ekspresi genomnya yang belum dimodifikasi
memungkinkan organisme yang terinfeksi paru-paru yang parah, menstimulasi sistem imun
hospes dan harus diberikan berulang untuk perbaikan gangguan genetik karena mereka tidak
dapat terintegrasi. Meskipun VTA tidak bersifat patogen pada manusia,kapasitasnya yang
kecil untuk penyisipan DNA dan persyaratan adanya adenovirus untuk menjadi pelengkap
produksinya, penggunaannya terbatas. Karena perlu membuat vektor non-patogen, banyak
bagian genom virus dibuang, sehingga melumpuhkan kapasitas replikasi virus in vivo.
Deretan sel yang memungkinkan kapasitas replikasi dan penyelimutan virus rekombinan
yang tidak sempurna secara invitro diperlukan untuk vektor-vektor ini.
Vektor-Vektor Retrovirus
Retrovirus menggambarkan desain sistem pengemasan sel yang menghasilkan virus
noninfeksius yang mampu memindahkan gen. Struktur genom dan siklus hidup retrovirus
bisa digambarkan sebagai berikut :
Virus leukimia tikus Moloney dan virus leukimia kera telah digunakan paling luas
guna menghasilkan vektor pemindah gen.Retrovirus mengenali reseptor pada permukaan sel
dan diinternalisasi lewat endositosis lewat perantara reseptor. Genom RNA retrovirus
berhasil melewati proses pencernaan di dalam endosom sel yang ditransfeksi dan
dihantarakan ke nukleus sel yang sedang membelah, dimana transkriptase-balik virus yang
dibentuk sebelumnya mensintesis sifat khusus DNA genom virus selama mitosis. Genom
virus mengarahkan proses sintesis sel hospes untuk menghasilkan genom RNA virus dan
protein kapsidnya. Setelah pembentukan kapsid, partikel virus yang telah matang lepas dari
membran plasma sel pengemas untuk menghasilkan partikel virus infeksius. Proses
penggabungan genom RNA virus serta penggunaan transkriptase balik yang dibentuk
sebelumnya ke dalam partikel virus yang lengkap disebut pengemasan dan memerlukan
rangkaian spesifik yang disebut dengan psi.
Genom retrovirus mengandung 5 elemen utama, yang mencakup terminal panjang
yang merupakan pembimbing yang kuat, rangkaian psi yang mengisyarati peristiwa
pengemasan dan tiga gen yang disebut GAG, POL, dan ENV. Tiga gen ini mengkode protein
peng-enkapsidasi, transkriptase balik dan protein pembungkus. Trankriptase balik yang
dibentuk sebelumnya, diangkut ke dalam sel dengan virus yang dibutuuhkan untuk produksi
genom DNA dari genom RNA virus sebelum replikasi virus dan produksi virus baru.
Replikasi dan ekspresi gen-gen virus dapat dipisahkan dari proses pengemasan dan produksi
partikel virus infektif. Kebanyakan genom retrovirus dan terutama gen yang megkode
infektifitas dan onkogenesis GAG, POL, dan ENV), dapat dibuang dan gen terapi disisipkan
ke dalam daerah gen yang hilang tersebut. Selama virus dikemas dengan tepat, gen virus
dihantarkan ke sel yang tepat dan trankriptase balik yang dibentuk sebelumnya menghasilkan
DNA virus untuk pengintegrasian ke genom hospes. Rekaman produk gen terapeutik
diarahkan oleh pembimbing gen, seperti LTR retrovirus atau rangkaian pembimbing-penguat
lainnya dapat direkayasa menjadi vektor. Untuk mencapai pelepasan hubungan antara
patogenesis danreproduksi vektor virus yang membawa gen yang diinginkan.
Genom retrovirus secara permanen dapat disisipkan ke dalam kromosom deretan sel
pengemas tetapi tidak memiliki rangkaian. Akibatnya, retrovirus tidak sempurna, tidak
memiliki GAG, POL, dan ENV tetapi mengandung pembimbing, rangkaian, dan gen
terapeutik dipindahkan ke dalam deretan sel pengemas. Retrovirus rekombinan yang tidak
sempurna memanfaatkan protein pengemas dan enkapsidasi dari genom deretan sel pengemas
untuk membuat partikel virus yang infeksius. Partikel virus yang dihasilkan tidak
mengandung gen yang diperlukan untuk patogenesis virus namun menggabungkan protein
berkapsul dan genom RNA virus rekombinan yang bereplikasi tidak sempurna. Titer virus
infeksius yang tinggi selanjutnya diperoleh dengan berkali-kali melewatkan melalui deretan
sel pengemas. Virus rekombinan yang “cacat” digunakan untuk transfeksi sel penerima yang
diinginkan,menggabungkan gen eksogen ke dalam genom sel hospes. Kejadian integrasi
tunggal ini tidak menghasilakn partikel virus tambahan dan disebut transfeksi.
Vektor Adenovirus
Adenovirus adalah virus DNA yang mampu menginfeksi ke banyak tipe sel dan
sedang diuji untuk terapi berbagai penyakit pada manusia. Siklus hidup adenovirus mulai
dengan infeksi pada sel hospes dengan cara berikatan pada reseptor permukaan sel, diikuti
oleh endositosis ke dalam endosom sel sasaran. Adenovirus melewati penghancuran di dalam
ruang endosom/lisosim dan mampu secara efisien memindahkan DNAnya ke dalam nukleus
sel hospes, yang selanjutnya mengarahkan replikasi dan reproduksi partikel adenovirus
infektif yang dilepaskan saat sel mengalami lisis.
Genom adenoviral terdiri dari DNA untai ganda yang menetap pada episom , yaitu di
dalam nukleus tetapi tidak terintegrasi ke dalam kromosom sel . Oleh karena itu , modifikasi
genetik dapat hilang selama proliferasi sel . Vektor adenoviral adalah vektor yang digunakan
untuk dalam transduksi vivo dari berbagai sel somatik manusia termasuk sel nonproliferasi .
Daerah penyisipan daerah coding gen terapi di atas 10 kb yang berpasangan dan tidak terkait
dengan risiko terdeteksi penambahan onkogenesis. Adenoviral dapat ditransfer dengan
inhalasi aerosol dan inflamasi.
Vektor Adeno Associated Viral (AAV)
AVV merupakan famili dari parvovirus. Terdiri dari untai tunggal DNA. Siklus
hidupnya memerlukan infeksi bersama dengan adenovirus. AAV/VTA adalah non patogen,
menginfeksi sel yang sedang membelah dan yang tidak, berintegrasi ke dalam genom
manusia, dan tidak mengeskpresikan genomnya sendiri setelah mentransfeksi sel sasaran.
AAV/VTA mampu mengintegrasi tempat spesifik pada kromosom 19. Seperti halnya
retrovirus dan adenovirus, produksi VTA memerlukan suatu deretan sel pengemas guna
replikasi vektor rekombinan yang mengandung gen yang diinginkan adenovirus harus
ditambahkan secara in vitro agar replikasi virus tercapai. Kebutuhan adenovirus yang berasal
dari siklus hidup VTA.
Perbedaan Tipe Virus sebagai Vektor Terapi Gen
Retrovirus : Sebuah kelas virus yang dapat membuat salinan DNA
beruntai ganda dari RNA genom. Salinan genom
dapat terintegrasi ke dalam kromosomal sel inang.
Adenovirus : Sebuah kelas virus dengan genom DNA untai ganda
yang menyebabkan infeksi pernafasan, pencernaan
dan infeksi mata pada manusia.
Adeno-Associated Virus : Sebuah kelas kecil, DNA beruntai tunggal yang dapat
menyisipkan material genetik pada lokasi tertentu di
kromosom 19.