MAKALAH TEKNOLOGI REPRODUKSI DAN INSEMINASI BUATAN Teknik Pemisahan Kromosom X atau Y dari Spermatozoa (Sexing)

Disusun oleh:1. Faizal Agung Pratomo 2. Jefri Hardyanto 3. Samha Sholikhatin 4. Firmansyah Abdul Hasan

0911310011 0911310015 0911310025 0911310041

Program Kedokteran Hewan Universitas Brawijaya Malang 2011

BAB I PENDAHULUAN1.1 Latar Belakang

Pada masa ini, bioteknologi berkembang sangat pesat, terutama di negara negara maju. Kemajuan ini ditandai dengan ditemukannya berbagai macam teknologi semisal rekayasa genetika, kultur jaringan, rekombinan DNA, pengembangbiakan sel induk, kloning, dan lain-lain. Pada prinsipnya bioteknologi merupakan pemanfaatan makhluk hidup (mikroba, tumguhan, hewan) beserta sistemnya, sehingga menghasilkan bahan atau sumber daya yang memiliki nilai tambah bagi kesejahteraan umat manusia. Beberapa contoh bioteknologi pada bidang peternakan, khususnya bioteknologi reproduksi adalah inseminasi buatan (IB), transfer embrio (TE), pemisahan jenis kelamin, pemisahan spermatozoa X dan Y (sexing), In Vitro Fertilization (IVF) atau lebih dikenal dengan bayi tabung, kloning dan sebagainya (Rahadi, 2011). Penemuanpenemuan teknologi di bidang reproduksi ternak tersebut dapat dimanfaatkan untuk mengatasi masalah-masalah dan tantangan yang dihadapi subsektor peternakan terutama dalam meningkatkan populasi, produksi dan produktivitas ternak baik secara kualitas maupun kuantitas (Nursyam,2010). Pemanfaatan teknologi sexing spermatozoa merupakan salah satu pilihan yang tepat dalam rangka peningkatan efisiensi reproduksi ternak yang mampu meningkatkan efisiensi usaha peternakan baik dalam skala peternakan rakyat maupun dalam skala peternakan komersial. Salah satu sasaran dalam bidang reproduksi ternak adalah memproduksi anak yang mempunyai jenis kelamin sesuai dengan keinginan peternak. Sebagai contoh, peternak sapi perah lebih mengharapkan sapi betina dari suatu kelahiran daripada sapi jantan, sebaliknya peternak sapi potong lebih mengharapkan kelahiran sapi jantan dari pada sapi betina. Berbagai penelitian yang telah dilakukan untuk mengontrol jenis kelamin anak ternak dari suatu kelahiran agar sesuai dengan keinginan peternak. Penelitian dimulai dengan pengkondisian saluran reproduksi ternak betina agar lingkungan itu menjadi lebih baik bagi spermatozoa X daripada spermatozoa Y atau sebaliknya. Selanjutnya pemisahan spermatozoa X dan spermatozoa Y sebelum dilakukan IB maupun IVF atau In Vitro Fertilization (Saili et al, 1998). Melihat pentingnya teknologi tersebut dalam bidang peternakan dan dampaknya yang cukup besar bila dinilai dari segi ekonomi, maka sudah sewajarnya mahasiswa kedokteran hewan termotivasi untuk memahaminya lebih dalam, khususnya dalam

teknologi reproduksi melalui penulisan makalah dengan bahasan teknik pemisahan kromosom X atau Y dari sperma, atau yang sering dikenal dengan sexing. Dengan demikian, mahasiswa diharapkan dapat mengaplikasikannya dengan tujuan meningkatkan tingkat ekonomi masyarakat di wilayah peternak.1.2 Tujuan

Mahasiswa mengetahui bagaimana teknik sexing dan keunggulan dari bioteknologi reproduksi tersebut.1.3 Manfaat

Diharapkan mahasiswa mendapatkan pengetahuan lebih mengenai salah satu contoh bioteknologi reproduksi yang telah dilakukan dalam penelitian, khususnya mengenai teknik sexing sehingga kedepannya dapat dijadikan bahan pertimbangan untuk penelitian selanjutnya maupun untuk aplikasi secara lapangan.

BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Teknologi Reproduksi Teknologi reproduksi adalah ilmu reproduksi atau ilmu tentang perkembangbiakan yang menggunakan peralatan serta prosedur tertentu untuk menghasilkan suatu produk atau keturunan (Beno, 1988). Perkembangan Teknologi Reproduksi di bidang peternakan digunakan untuk memperbaiki mutu genetik. Teknologi reproduksi yang berkembang saat ini adalah inseminasi buatan, sexing spermatozoa, transfer embrio, fertilisasi in vitro, clonning, dll. Akan tetapi tidak semua hasil teknologi reproduksi tersebut dapat diaplikasikan di masyarakat, karena masih tidak efisien. Tujuan dari perkembangan IPTEK dibidang reproduksi ternak dapat dimanfaatkan untuk mengatasi masalah-masalah dan tantangan yang dihadapi subsektor peternakan terutama dalam meningkatkan populasi, produksi dan produktivitas ternak baik secara kualitas maupun kuantitas. Perkembangkan teknologi di bidang reproduksi ternak diawali dengan pemanfaatan teknologi inseminsi buatan (IB), kemudian transfer embrio (TE), dan saat ini telah dikembangkan teknologi prosessing semen, fertilisasi in vitro, teknologi criopreservasi gamet, pembentukan ternak transgenik, cloning dan pembentukan ternak chimera. Upaya pengembangan dan pemanfaatan teknologi reproduksi ternak tersebut perlu dukungan peralatan yang memadai dan dana yang cukup serta tenaga ahli yang terampil. Aplikasinya oleh petani peternak di Indonesia baru sampai pada tahap inseminasi buatan (IB) dan transfer embrio (TE) (Nursyam,2010). Berikut beberapa jenis teknologi reproduksi yang ada: a. Inseminasi Buatan Inseminasi buatan (IB) adalah suatu teknologi di bidang reproduksi yang memanfaatkan pejantan unggul semaksimal mungkin. Teknik ini sudah lama berkembang di Indonesia dan teknik ini telah dapat digunakan untuk meningkatkan berat badan anak, oleh sebab itu perlu dipikirkan pejantan mana yang akan digunakan untuk meningkatkan berat badan anak tersebut. b. Transfer Embrio Teknik TE merupakan suatu manipulasi fungsi alat reproduksi dengan perlakuan berbagai hormon superovulasi pada betina donor dan menyebabkan pematangan dan ovulasi sel telur dalam jumlah yang besar. Transfer embrio adalah suatu teknologi reproduksi yang dapat memanfaatkan pejantan dan betina unggul semaksimal

mungkin. Di negara maju teknik ini sudah diaplikasikan di peternakan berskala besar, sedangkan di Indonesia dengan sistem peternakan yang berskala kecil sulit untuk diaplikasikan. c. Sexing Spermatozoa Sexing spermatozoa atau pengaturan jenis kelamin anak sesuai dengan yang diharapkan, dikembangkan untuk mendukung IB dan Transfer Embrio. Sexing spermatozoa ini dikembangkan dengan berbagai metode, yang paling mutakhir adalah dengan flow cytometry. Berhubung peralatannya cukup mahal, maka telah dikembangkan berbagai metode (misal sentrifugasi gradien densitas percoll, sephadex dan gradien putih telur) yang secara laboratorium telah berhasil dibekukan dengan kualitas yang layak untuk IB, pada skala penelitian lapang menunjukkan bahwa spermatozoa hasil sexing memungkinkan untuk diaplikasikan di lapang. d. Cloning Embrio Manipulasi mikro embrio (micromanipulation) merupakan cloning dalam pembentukan kembar identik pada saat ini tidak hanya terbatas pada hewan laboratorium, tetapi juga telah berhasil pada ternak pelihara. Kembar buatan identik telah berhasil dilakukan dengan pembelahan embrio (splitting embrio). e. Fertilisasi in Vitro Sel telur belum matang (oosit) diambil dari ternak hidup atau ovarium berasal dari ternak betina yang baru dipotong. Oosit tersebut kemudian dimatangkan dan dibuahi di laboratorium, dan dikultur sampai pada tahap tertentu dan selanjutnya ditransfer ke ternak resipien atau dibekukan untuk ditansfer kemudian. Proses ini dikenal sebagai pematangan in vitro atau fertilisasi buatan atau dikenal sebagai IVM / IVF (In Vitro Maturation/In Vitro Fertilization) (Nursyam, 2010).f. Criopreservasi, dsb.

Criopreservasi adalah suatu penyimpanan gamet dalam waktu lama yang dilakukan dalam bentuk beku pada suhu -196oC (dalam nitrogen cair) dalam media dengan penambahan crioprotectan. Prinsip terpenting dari criopreservasi adalah pengeluaran sebagian besar air intraselluler dari sel-sel sebelum membeku (Susilawati, 2002). Tekniknologi reproduksi yang lainnya seperti splitting embrio, ICSI (Intra Cytoplasmic Sperm Injection), dan masih beberapa lagi teknik manipulasi yang masih dikembangkan.

BAB III PEMBAHASAN 3.1 Pemisahan Kromosom X atau Y dari Spermatozoa atau Sexing Pemisahan spermatozoa adalah upaya untuk mengubah perolehan spermatozoa yang berkromosom jenis X atau Y dengan metode tertentu, sehingga berubah dari proporsi normal (rasio alamiah), 50% : 50%. Secara umum, proporsi perbandingan spermatozoa X dan Y dalam satu ejakulat semen adalah seimbang (50:50) sehingga jenis kelamin keturunannyapun 50:50. Dengan teknik sexing maka komposisi tersebut dapat di modifikasi. Sexing spermatozoa X dan Y didasarkan atas perbedaan karakteristik yang dimiliki oleh masing-masing jenis spermatozoa antara lain kandungan DNA, ukuran spermatozoa, motilitas, muatan permukaan serta fluoresensi kromosom. Spermatozoa X mengandung kromatin lebih banyak daripada sperma Y sehingga ukuran kepalanya lebih besar daripada spermatozoa Y (Hafez, 2000), selain itu spermatozoa X mengandung DNA 3,8% lebih banyak daripada Y (Garner dan Seidel, 2000). Seperti halnya menurut Saili et al (1998) bahwa perbedaan potensial antara spermatozoa X dan Y adalah kandungan DNA, sensitivitas pH dan perbedaan morphologi kepala serta motilitas. Perbedaan yang utama adalah kontribusi dari kromosom seksnya, yaitu spermatozoa X mengandung kromatin lebih banyak pada inti spermatozoa yang terdapat dalam kepalanya, sehingga ukuran kepala spermatozoa X lebih besar. Spermatozoa Y ukuran kepalanya kepalanya lebih kecil, lebih ringan dan lebih pendek dibandingkan spermatozoa X, sehingga spermatozoa Y lebih cepat dan lebih banyak bergerak serta kemungkinan mengandung materi genetik dan DNA lebih sedikit dibandingkan dengan spermatozoa X. 3.2 Teknik Sexing Beberapa metode pemisahan spermatozoa dapat dilakukan adalah menggunakan kolom albumin, kecepatan sedimentasi, sentrifugasi dengan gradient densitas percoll, motilitas dan pemisahan elektroforesis, isoelectric focusing, teknik manipulasi hormonal, H-Y antigen, flow sorting, dan metode penyaringan menggunakan kolom Sephadex. Metode yang dianggap paling valid diantara beberapa metode tersebut adalah metode kolom albumin dan metode penyaringan menggunakan kolom Shepadex (Saili et al, 1998). Berikut beberapa teknik sexing menurut Hafez (2000) Teknik Separasi Hasil

Sedimentasi pada media

Hasil inseminasi dengan semen tersebut menghasilkan 70%

dengan imobilisasi betina Skim milk, glycin, sodium Meningkatkan jumlah anak jantan yang dilahirkan bila sitrat, gliserol Albumin kolom Velocity sedimentation Sentrifugasi gradien densitas menggunakan lapisan atas Spermatozoa berhasil dibekukan Sedimentasi berdasarkan ukuran, densitas dan bentuk kepala. Faktor dominan: ukuran kepala Dikembangkan dengan waktu yang pendek, sentrifugasi dengan waktu pendek tidak berpengaruh signifikan pada difusi Spermatozoa yang imotil akan bergerak ke anoda pada pH netral. Ketika kondisi konsisten, spermatozoa motil akan Motilitas dan elektroforesis bergerak menuju katoda Spermatozoa membentuk lapisan atau suspensi yang akan Iso-electric focusing bergerak ke arah iso-elektrik Spermatozoa diperlakukan dengan serum H-Y. Inseminasi terhadap tikus menghasilkan 45,4% jantan sedangkan H-Y antigen Flow sorting by DNA kontrol 53% Spermatozoa Y yang berhasil disorting sebanyak 72-80% Diperoleh 70% spermatozoa X dengan cara spermatozoa dimasukkan dibagian atas. Filtrat diperoleh spermatozoa X Sephadex koloma. Sexing dengan albumin

sebanyak 65-85%.

Metode sexing dengan menggunakan putih telur (albumin) merupakan metode yang didasarkan atas perbedaan motilitas spermatozoa X dan Y yang disebabkan oleh perbedaan massa dan ukurannya. Ukuran spermatozoa Y lebih kecil sehingga bergerak lebih cepat atau mempunyai daya penetrasi yang lebih tinggi untuk memasuki suatu larutan. Spermatozoa Y akan bergerak ke bawah sedangkan spermatozoa X tetap berada di lapisan atas (Pratiwi, et al. 2006). Pemisahan spermatozoa dengan menggunakan Bovine Serume Albumin (BSA) sebagai sumber albumin telah dilakukan sebelumnya. BSA merupakan bahan kimia yang berisi albumin yang berasal dari sapi dengan kandungan albumin 100 mg/ml. Pemisahan dengan menggunakan albumin merupakan metode yang cukup fleksibel dan mudah diterapkan di lapangan (Susilawati et al, 2005). Pemisahan Spermatozoa dengan Metode Kolom Bovine Serum Albumin (BSA). Pemisahan spermatozoa X

dan Y dengan menggunakan metode kolom yang mengandung larutan BSA didasarkan pada perbedaan motilitas (kecepatan pergerakan) antara spermatozoa X dan Y dalam menembus larutan yang mengandung BSA. Pemisahan spermatozoa dilakukan dengan cara memasukan sampel semen ke dalam kolom yang berisi larutan BSA. Kolom yang digunakan dilengkapi dengan kran pada masing-masing bagian (atas dan bawah) untuk memudahkan pengambilan semen pada setiap bagian proses pemisahan. Sedangkan larutan BSA yang digunakan mengandung campuran Tris (hydroxy-methyl aminomethan), asam sitrat, fruktosa, BSA dan aquades. Sampel semen dibiarkan selama kurang lebih dua jam untuk mengendap. Pada proses ini diharapkan spermatozoa Y akan bergerak lebih cepat menembus larutan BSA, karena memiliki bentuk dan ukuran yang lebih kecil dan kandungan DNA nya lebih sedikit dibanding spermatozoa X. Selanjutnya semen bagian bawah dan atas diambil dengan cara memutar kran pada masing-masing bagian dan ditampung dengan menggunakan tabung sentrifuge. Sentrifuge masing-masing bagian semen pada kecepatan 2.800 3.200 rpm selama 15 menit untuk mendapatkan endapan semen yang bersih, sedangkan supernatannya dibuang. Endapan semen tersebut selanjutnya diencerkan kembali dengan menggunakan jenis pengencer awal, kemudian disentrifuge untuk mendapatkan endapan semen yang lebih bersih. Hasil sentrifuge selanjutnya diencerkan dengan menggunakan pengencer yang mengandung Tris, glukosa, asam sitrat, kuning telur, dan aquades dengan perbandingan sama 1 : 1.b. Filtrasi dengan Sephadex Column

Pemisahan spermatozoa dengan filtrasi sephadex column dapat menghasilkan spermatozoa X 7075% , telah melakukan filtrasi spermatozoa menggunakan Sephadex G-200 dan sentrifugasi gradien densitas percoll. Metode pemisahan dengan menggunakan Sephadex G-200 pada lapisan bawah dapat menghasilkan spermatozoa X sebanyak 86%, sedangkan dengan sentrifugasi gradien densitas percoll menghasilkan spermatozoa X pada lapisan bawah sebanyak 89%. (Pratiwi et all, 2006).c. Teknik Sexing Flowcytometry

Saat ini ada prosedur yang mudah dan cepat untuk memisahkan komposisi dari kromosom seks dari sperma individu atau rasio jenis kelamin dari sebuah populasi sperma dari individu. Paling mudah, paling cepat dan paling tepat yang digunakan

sebagai analisa proporsi pemisahan sperma X dan Y adalah menggunakan metode flow citometry (Johnson and Welch, 1999) Meskipun secara substansial sperma teridentifikasi memiliki fenotipe yang identik, ada satu metode pemisahan kromosom sperma yang akurat hingga 90%, yang dinamakan flow citometry adanya pewarnaan sperma dengan pewarna fluorescence DNA-binding, Hoechst 33342. Teknik ini memanfaatkan perbedaan isi DNA yang terdiri dari kromosom X dan Y dari sperma, yang berada di urutan 3-5%, tergantung pada spseisesnya. Ukuran geometris sperma yang simetris membuat deteksi ini menjadi akurat, meskipun perbedaan yang kecil dan sulit. Sperma tegak lurus yang terwarnai kurang bisa memancarkan fluorescence ke dimensi yang lebih tipis dari ketebalan mereka, (Johnson and Welch, 1999) dengan demikian detektor harus memiliki orientasi yang mirip dengan sperma. Upaya yang baik untuk mengoptimalkan flow cytometry / pemisahan sel (Johnson dan Welch, 1999) ditambah mengoptimalkan kondisi inseminasi buatan (IB) dapat memungkinkan IB pada sapi-sapi dara bisa menghasilkan akurasi sekitar 90% dengan jenis kelamin yang diinginkan, tetapi dalam beberapa kasus justru bisa mengurangi kesuburan (Seidel dkk., 2000). Prosedur ini telah dikomersialisasikan untuk ternak di Inggris, dengan penjualan dimulai pada 1 September 2000; komersialisasi serupa akan segera terlaksana di negara lain. Prosedur ini akan dikomersialisasikan untuk spesies lain termasuk manusia, awalnya untuk aplikasi seperti fertilisasi in vitro (IVF) dan pembuatan hewan transgenik yang berharga.

Gambar 1. Prinsip Kerja Teknik Sexing Flowcitometry

last attached drop

Gambar 2. Alat untuk teknik sexing flowcitometry (Garner and Seidel, 2000) Manfaat/Keunggulan dari teknik flowcitometry Penggunaan flowcitometry atau pemisahan kelamin ini pada mamalia bisa sangat akurat dan hasilnya keturunan akan menjadi normal (Tubman et al., 2003) Bagaimanapun, meningkat atau menurunnya abnormalitas tidak bisa dihitung atau diatur tanpa adanya kontrol yang jelas, seperti studi epidemiologi dengan skala besar. Meskipun proses sexing bisa menghilangkan sperma yang mati dan beberapa sperma yang aneuploid, ini tidak sepenuhnya bisa mengurangi abnormalitas pada perkawinan karena kebanyakan abnormalitas terjadi pada sperma yang tidak mengalami proses sexing dan hasilnya adalah terjadi abortus. Penggunaan sexing dengan flowcitometry atau pemisahan sel ini memeiliki kelebihan yaitu sperma bisa dievaluasi secara

berkala. Prosedur ini bisa dilakukan cepat atau prosesnya tidak memakan waktu lama (Seidel, 2003). Pemisahan kromosom X dan Y menggunakan flowcitometry mampu menghasilkan 25.000/detik, (Garner and Seidel, 2000), 40.000 X- dan Y- spermatozoa/detik (Sharpe and Evans, 2009). Tingkat akurasi nya mencapai 90%. Teknik sexing sperma menggunakan fl ow cytometry dapat diperoleh 85%-95% kelahiran anak dengan jenis kelamin sesuai. Harga peralatan flow cytometry yang cukup mahal mendorong pengembangan teknik yang lebih sederhana yaitu dengan metode kolom albumin dengan menggunakan serum albumin sapi (BSA). 3.3. Keunggulan dari Teknik Sexing Pada dasarnya teknik sexing spermatozoa memiliki banyak keuntungan. Kualitas semen beku hasil sexing ternyata masih sangat bagus, dengan tingkat motilitas lebih dari 40%. Beberapa sumber dari Balai Inseminasi Buatan (BIB), didapatkan data telah lahir pedet jantan sapi potong basil IB yang menggunakan semen beku Y sebanyak 33 ekor dari kelahiran 47 ekor (70,21%) dan 29 ekor pedet betina sapi perah basil lB yang menggunakan semen beku X dari 30 kelahiran (96,66%) sesuai program. Dari data yang tercatat dengan baik telah diketahui bahwa fertilitas semen beku sexing adalah S/C = 1,71 dan CR = 56,45% . Angka-angka tersebut setara dengan keberhasilan IB dengan semen beku yang tidak di sexing (Susilawati, 2005).

BAB IV PENUTUP 4.1 Kesimpulan Pemisahan kromosom X atau Y dari Spermatozoa atau dikenal sebagai sexing dapat menggunakan beberapa teknik seperti kolom albumin, kecepatan sedimentasi, sentrifugasi dengan gradient densitas percoll, motilitas dan pemisahan elektroforesis, isoelectric focusing, teknik manipulasi hormonal, H-Y antigen, flow cytometry, dan metode penyaringan menggunakan kolom Sephadex. Metode yang yang paling efektif adalah metode flow cytometry,tetapi karena harganya terlalu mahal maka lebih baik memakai metode kolom albumin yang lebih murah. Metode flowcitometry bisa menghasilkan keakuratan hingga sekitar 90%. Namun, apapun teknik sexing yang digunakan, pastinya hasil yang diperoleh bertujuan mendapatkan keturunan dengan jenis kelamin yang diinginkan, sehingga pola dan arah pengembangan populasi ternak semakin jelas. 4.2 Saran Diperlukan suatu aplikasi pembelajaran dari beberapa teknologi reproduksi bagi mahasiswa bidang kedokteran hewan, sehingga mahasiswa dapat memahami langsung secara praktek lapangan. Semakin menipisnya jumlah populasi betina murni lokal produktif dari tahun ke tahun maka sudah saatnya diterapkan aplikasi IB menggunakan semen beku sexing.

DAFTAR PUSTAKA Beno, E. 1988. Bioteknologi Dan Bioetika. Kanisius. Jakarta. Garner D.L.and Seidel, G.E.Jr. 2000. Current Status of Sexing Mammalian spermatozoan. Reproduction 124:733-743 Hafez, E. S. E. 2000. Reproduction in Farm Animals. Lea and Febiger, Philadelphia. Johnson, L.A., Welch, G.R., 1999. Sex preselection: high-speed flow cytometric sorting of X and Y sperm for maximum efficiency. Theriogenology 52, 13231341. Nursyam, A. 2010. Perkembangan Iptek di Bidang Reproduksi Ternak untuk Meningkatkan Produktivitas Ternak. PS. Produksi Ternak, Jurusan Budidaya Pertanian Fakultas Pertanian Unlam. Banjarbaru. Pratiwi., W. C. Pamungkas. Affandhy., & Hartati. 2006. Evaluasi Kualitas Spermatozoa Hasil Sexing Pada Kemasan Straw Dingin Yang Disimpan Pada Suhu 5C Selama 7 Hari. Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner. Rahadi, S. 2011. Mengenal Teknologi Reproduksi. http://ilmuternak.wordpress.com/ materikuliah/reproduksi-ternak/mengenal-teknologi-reproduksi/, Diakses tanggal 14 Oktober 2011. Saili, T., M.R. Toelihere, A. Budiono, B. Tappa. 1998. Pengendalian Jenis Kelamin Anak Melalui Sexing Spermatozoa Untuk Reproduksi Ternak. Warta Biotek Tahun XII No. 1 2 (Maret Juni) : 1- 5. Seidel G, 2003. Sexing mammalian sperm intertwining of commerce, technology, and biology. Animal Reproduction and Biotechnology Laboratory, Colorado State University, Fort Collins, CO 80523, USA. Elsevier B.V. All rights reserved. Sharpe, J and Evans. 2009. Advacess in flow citometry for sperm sexing. Theriogenology. 71:4-10 Susilawati, T. 2002. Teknologi Preservasi dan Kriopreservasi Spermatozoa dan Ova. Makalah Kursus Singkat Teknik Biologi Reproduksi dalam Meningkatkan Produktivitas Ternak Kerjasana Fakultas Peternakan Unhas dengan Dirjen Dikti Depdiknas. Fakultas Peternakan Unhas, Makassar. Susilawati, T. 2005. Keberhasilan Inseminasi Buatan Menggunakan Semen Sexing Setelah Dibekukan. Pros. Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner. Puslitbang Peternakan. Bogor. Tubman, L., Brink, Z., Suh, T.K., Seidel Jr., G.E., 2003. Normality of calves resulting from sexed sperm. Theriogenology 59, 517 (abstract)