Ririn Ariyani (B04110057)
Praktikum Mikrobiologi Medik I Laporan Minggu III
Pewarnaan Diferensial
1. Pewarnaan Gram
1.1. Deskripsi
Pewarnaan diferensial merupakan prosedur pewarnaan yang
menampilkan perbedaan di antara sel – sel mikroba atau bagian – bagian
mikroba. Prosedur pewarnaan ini biasanya menggunakan lebih dari satu zat
pewarna atau reagen pewarnaan (Pelczar dan Chan 2010).
Pewarnaan gram merupakan salah satu pewarnaan diferensial.
Pewarnaan gram merupakan suatu teknik pewarnaan diferensial yang paling
penting dan paling luas digunakan untuk bakteri. Bakteri lebih mudah diamati
dalam bentuk olesan yang diwarnai dengan reagen pewarna. Ukuran, bentuk,
susunan, dan keadaan struktur internal dapat diamati dengan mudah karena
adanya perbedaan antara bakteri dengan latar. Sel - sel individu bakteri dapat
berbentuk kokus, batang atau basil, maupun spiral (Pelczar dan Chan 2010).
Pewarnaan gram merupakan prosedur pewarnaan yang umum digunakan
untuk melakukan identifikasi bakteri, terutama di laboratorium diagnostik
rumah sakit. Pengamatan spesimen yang diwarnai dengan pewarnaan gram
mampu memberikan informasi dengan cepat mengenai organisme penyebab
infeksi sehingga dapat segera ditangani (Pelczar dan Chan 2010). Pewarnaan
bakteri dipengaruhi oleh fiksasi, pemucat, substrat, intensifikasi pewarnaan,
dan penggunaan zat warna tandingan (Sutedjo 1991).
Pewarnaan negatif menggunakan empat jenis reagen. Reagen pertama
merupakan warna dasar yaitu, ungu kristal. Bakteri gram positif maupun
negatif akan berwarna ungu setelah dilakukan pewarnaan. Reagen kedua
merupakan yodium atau larutan yang mengandung yodium seperti lugol.
Kompleks ungu kristal - yodium akan terbentuk di dalam sel. Kedua bakteri
1
gram akan tetap mempertahankan warna ungu di dalam sel masing – masing.
Reagen ketiga yang digunakan adalah aseton alkohol yang berfungsi sebagai
pemucat atau decolorizing agent (Tracy 2005). Dinding sel bakteri gram
positif akan mengalami dehidrasi dan pori – pori menciut. Bakteri gram
positif memiliki dinding sel yang kuat dan 30 lapis peptidoglikan sehingga
permeabilitas dinding sel berkurang (Madigan 2003). Hal tersebut
mengakibatkan daya rembes dinding sel dan membran bakteri menurun
sehingga kompleks ungu kristal - yodium tidak dapat keluar dan sel tetap
berwarna ungu. Bakteri gram negatif menunjukkan reaksi sebaliknya. Bakteri
gram negatif hanya memiliki 1‐2 lapis peptidoglikan sehingga memiliki
permeabilitas dinding sel lebih besar (Madigan 2003). Lipid yang terdapat
pada dinding sel bakteri akan terekstraksi sehingga pori – pori mengembang
dan kompleks ungu kristal – yodium keluar dari sel. Hal tersebut
mengakibatkan sel menjadi tidak berwarana. Reagen keempat yang digunakan
merupaka safranin yang berfungsi sebagai reagen tandingan. Bakteri gram
positif tidak akan terpengaruh dengan penambahan safranin. Namun, bakteri
gram negatif akan menyerap safranin sehingga sel berwarna merah (Pelczar
dan Chan 2010).
Contoh bakteri gram positif adalah Streptococcus, Bacillus,
Staphylococcus, Clostridia, Corynebacterium dhypteriae, Peptococcus,
Peptostreptococcus, dan lain - lain. Contoh bakteri gram negatif adalah
Neisseria, Klebesiella, Vellonella, Shigella, Salmonella, Hemophillus, dan
lain - lain (Cappuccino dan Sherman 1983).
1.2. Hasil Pengamatan
1.2.1. Isolat Staphylococcus aureus
1.2.1.1. Hasil Pengamatan
2
Pembesaran : 100x
Sifat gram : Positif
Bentuk sel : Kokus
Susunan sel : Koloni berkelompok
Referensi
(http://www.microbeworld.org/component/jlibrary/?
view=article&id=7611)
1.2.1.2. Pembahasan
Staphylococcus aureus merupakan bakteri gram positif, tidak
bergerak, tidak memiliki spora, tidak berkapsul, serta dinding
selnya mengandung peptidoglikan dan asam teikhoat. Metabolisme
yang dimiliki Staphylococcus aureus dapat berupa aerob dan
3
anaerob. Staphylococcus aureus dapat membentuk koagulasi
sehingga berpotensi menjadi patogen invasif. Staphylococcus
aureus biasanya ditemukan di kulit dan hidung manusia serta
kadang menimbulkan infeksi. Infeksi yang ditimbulkan juga dapat
disebabkan oleh kontaminasi langsung pada luka (Jawetz 1996).
Pewarnaan gram yang dilakukan dengan menggunakan isolat
Staphylococcus aureus menunjukkan bahwa bakteri tersebut
merupakan bakteri gram positif. Staphylococcus aureus yang
diamati memiliki warna ungu pudar dan memiliki bentuk kokus
dengan koloni berkelompok seperti buah anggur. Namun, bentuk
koloni yang berkelompok tidak terlihat terlalu jelas. Hal tersebut
disebabkan pengolesan yang terlalu rata dan penekanan pada ose
yang berlebihan. Selain itu, warna ungu yang dicitrakan tidak
terlalu jelas atau pudar. Hal tersebut diduga akibat pencucian
dengan akuades dan aseton alkohol yang terlalu lama sehingga
kompleks ungu kristal – yodium ada yang ikut tercuci.
1.2.2. Isolat Bacillus subtilis
1.2.2.1. Hasil Pengamatan
Pembesaran : 100x
Sifat gram : Positif
4
Bentuk sel : Basil
Susunan sel : Koloni berantai
Referensi
(http://lib.jiangnan.edu.cn/ASM/116-2.jpg)
1.2.2.2. Pembahasan
Bacillus subtilis merupakan bakteri yang umum ditemukan
ditanah dan bukan merupakan bakteri patogen bagi manusia. Alat
gerak yang dimiliki Bacillus subtilis adalah flagela yang massif
sehingga dapat bergerak cepat untuk ukuran bakteri (Singleton dan
Sainsbury 2006). Bacillus subtilis merupakan kelompok bakteri
gram positif. Bacillus subtilis juga mampu memproduksi peptida
antibiotik yaitu Difficidin, Subtilin, Mycobacillin. Endospora
merupakan metode Bacillus subtilis untuk bertahan hidup, bukan
reproduksi. Endospora Bacillus subtilis terletak pada subterminal
(Pelczar dan Chan 2010).
Pewarnaan gram yang dilakukan dengan menggunakan isolat
Bacillus subtilis menunjukkan bahwa bakteri tersebut merupakan
bakteri gram positif. Bacillus subtilis yang diamati memiliki warna
ungu dan berbentuk basil yang ramping. Sel – sel bakteri Bacillus
subtilis membentuk koloni berantai. Pewarnaan yang dilakukan
memberikan hasil sesuai dengan literatur karena warna yang
terserap oleh Bacillus subtilis merupakan warna ungu, bakteri
5
tidak menumpuk, serta koloni tidak terpisah sehingga bentuk
berantai masih dapat diamati.
1.2.3. Isolat Escherichia coli
1.2.3.1. Hasil Pengamatan
Pembesaran : 100x
Sifat gram : Negatif
Bentuk sel : Basil tapi lebih pendek dan lebih lebar dari
Bacillus subtilis
Susunan sel : Koloni menyebar
Referensi
(http://biology.clc.uc.edu/fankhauser/labs/microbiology/
gram_stain/Gram_stain_images/index_gram_stain_images.html)
1.2.3.2. Pembahasan
6
Escherichia coli merupakan anggota famili Enterobacteraceae
yang berbentuk batang, fermentatif, dan termasuk kelompok
bakteri gram negatif. Escherichia coli hidup dalam jumlah besar di
dalam usus manusia dan bertugas membantu sistem pencernaan
serta melindungi dari serangan bakteri patogen. Namun,
Escherichia coli pada strain baru ditemukan berupa bakteri
patogen berbahaya karena menjadi penyebab diare, sindrom diare
lanjutan, muntaber, hemolitic uremic , infeksi usus, infeksi saluran
urin, dan neonatal meningitis. Kelebihan yang dimiliki Escherichia
coli adalah dapat dimanfaatkan sebagai indikator level pencemaran
air dan mendeteksi patogen pada feses manusia yang disebabkan
oleh Salmonella typhi. Bakteri lain yang berfungsi sebagai
indikator pencemaran selain Escherichia coli adalah
Streptococcus (Enterococcus) fecal, dan Clostridium perfringens.
Selain itu, Escherichia coli juga digunakan dalam teknologi
rekayasa genetika. Escherichia coli biasa digunakan sebagai vektor
untuk menyisipkan gen - gen tertentu yang diinginkan untuk
dikembangkan karena Escherichia coli memiliki tingkat
pertumbuhan yang sangat cepat dan mudah dalam penanganannya
(Lay dan Hastowo 1992).
Pewarnaan gram yang dilakukan dengan menggunakan isolate
Escherichia coli menunjukkan bahwa bakteri tersebut merupakan
bakteri gram negatif. Escherichia coli yang diamati memiliki
warna merah dan berbentuk basil yang lebih pendek serta lebih
lebar dibandingkan Bacillus subtilis. Preparat Escherichia coli
agak sulit diamati karena bakteri tersebut menumpuk dibeberapa
tempat dan sangat padat. Kesalahan tersebut diakibatkan oleh
pengolesan ose yang kurang merata. Warna merah yang terlihat
sesuai dengan literatur.
7
1.2.4. Isolat Campuran (Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, dan
Escherichia coli)
1.2.4.1. Hasil Pengamatan
Pembesaran : 100x
Sifat gram : Negatif (E. coli)
Positif (S. aureus dan B. subtilis)
Bentuk sel : Basil tapi lebih pendek dan lebih lebar dari
Bacillus subtilis (E. coli)
Kokus (S. aureus)
Basil (B. subtilis)
Susunan sel : Koloni kelompok (E. coli)
Koloni berantai (S. aureus)
Koloni menyebar (B. subtilis)
8
Referensi
(http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/
S0092867406004338)
(http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/
S0167701201003037)
1.2.4.2. Pembahasan
Staphylococcus aureus merupakan bakteri gram positif, tidak
bergerak, tidak memiliki spora, tidak berkapsul, serta dinding
selnya mengandung peptidoglikan dan asam teikhoat (Jawetz
1996). Bacillus subtilis merupakan bakteri yang umum ditemukan
ditanah dan bukan merupakan bakteri patogen bagi manusia. Alat
gerak yang dimiliki Bacillus subtilis adalah flagela yang massif
sehingga dapat bergerak cepat untuk ukuran bakteri (Singleton dan
Sainsbury 2006). Bacillus subtilis merupakan kelompok bakteri
gram positif. Escherichia coli merupakan anggota famili
Enterobacteraceae yang berbentuk batang, fermentatif, dan
termasuk kelompok bakteri gram negatif (Lay dan Hastowo 1992).
Pengamatan yang dilakukan pada preparat isolat menunjukkan
ketiga bakteri yang masing – masing terwarnai sesuai sifatnya. Sel
Staphylococcus aureus dan Bacillus subtilis menunjukkan warna
ungu yang menandakan bahwa keduanya mampu menyerap reagen
warna ungu kristal dengan baik. Escherichia coli berwarna merah
menandakan bakteri tersebut menyerap warna safranin.
Kesimpulan yang diambil dari pengamatan isolat campuran adalah
9
meskipun beberapa bakteri dicampur dan diwarnai secara
bersamaan, bakteri – bakteri tersebut akan tetap menyerap reagen
warna sesuai dengan sifat dinding selnya.
1.3. Acuan
Campbell NA, Reece JB. 2005. Biologi Jilid 2. Jakarta : Erlangga.
Cappuccino JG, Sherman N. 1983. Microbiology A Laboratory Manual. New
York : Addison-Wesley Publishing Company.
Jawetz E. 1996. Mikrobiologi Kedokteran Edisi 20. Jakarta : EGC.
Lay BW, Hastowo S. 1992. Mikrobiologi. Bogor : IPB Press.
Madigan MT. 2003. Brock Biology of Microorganism. USA : Pearson
Education, inc.
Pelczar MJ, Chan ECS. 2010. Dasar – Dasar Mikrobiologi 1. Jakarta : UI
Press.
Singleton P, Sainsbury D. 2006. Dictionary of Microbiology and Molecular
Biology 3rd Edition. Sussex, England : John Wiley and Sons.
Sutedjo M. 1991. Mikrobiologi Tanah. Jakarta : Rineka Cipta.
Tracy. 2005. Gram Staining. www.tracy.k12.ca.us/thsadvbio/pdfs/gram
%20stain.pdf. Terhubung berkala. Diakses tanggal 28 Februari 2013.
2. Pewarnaan Ziehl Neelsen
2.1. Deskripsi
Pewarnaan Ziehl Neelsen, atau disebut juga pewarnaan tahan asam
merupakan salah satu bentuk pewarnaan diferensial. Pewarnaan ini membagi
bakteri menjadi kelompok bakteri tahan asam dan tidak tahan asam
(Dwidjoseputro 1998). Pewarnaan tahan asam merupakan suatu metode
pewarnaan yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri yang memiliki
dinding sel dengan kandungan peptidoglikan, arabinogalaktan, dan lipid yang
50% tersusun atas asam mikolat, sehingga tidak dapat diwarnai dengan
10
pewarnaan gram. Asam mikolat merupakan asam lemak rantai panjang yang
terdiri atas 34‐90 karbon (Madigan 2003).
Pewarnaan Ziehn Neelsen, selanjutnya ditulis ZN, terdiri dari
pewarnaan ZN‐A berupa pewarna merah yaitu, karbol fuchsin, asam –
alcohol, fenol, dan akuades. Pewarnaan ZN‐B yang tidak berwarna yaitu, HCl
dan etil alcohol. Pewarnaan ZN‐C berupa pewarna biru sebagai pewarna
tandingan yaitu, biru metilen dan akuades. Bakteri tahan asam akan berwarna
merah setelah pemberian asam ‐ alkohol. Sedangkan bakteri tidak tahan asam
akan berwarna biru karena dekolorisasi oleh asam ‐ alkohol, jadi digunakan
biru metilen sebagai pewarna tandingan (Madigan 2003).
Bakteri yang termasuk kelompok tahan asam BTA adalah
Mycobacterium tuberculose, Mycobacterium avium, Mycobacterium bovis,
Mycobacterium leprae, Nocandia meningitidis, dan Nocandia gonorrhoeae
(Syahrurachman 1994). Kelompok bakteri tersebut disebut dapat
mempertahankan zat warna karbol fuchsin saat dicuci dengan larutan pemucat
yaitu, asam alkohol (Lay 1994).
2.2. Hasil Pengamatan Mycobacterium avium
Pembesaran : 100x
Sifat tahan asam : Tahan asam
Bentuk sel : Batang ramping, sedikit bengkok, dan kedua
ujungnya membulat
11
Susunan sel : Koloni berkelompok
Referensi
(http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1201971211001020)
2.3. Pembahasan
Mycobacterium avium merupakan bakteri dengan bentuk batang
langsing, namun beberapa bakteri memiliki ujung yang melengkung. Ukuran
Mycobacterium avium sekitar 1 hingga 3 μm, tidak memproduksi spora,
namun dapat ditemukan granul pada sitoplasmanya (Thoen 1997).
Mycobacterium avium dapat tumbuh pada temperatur 250C hingga 430C,
meskipun suasana yang paling disukai adalah 390C hingga 450C.
Mycobacterium avium dapat bertahan hidup dalam waktu yang lama di tanah
atau lingkungan yang tercemar selama berbulan – bulan bahkan bertahun -
tahun .
Infeksi Mycobacterium avium pada unggas dapat menyebabkan
penyakit Avian tuberculosis yang juga dapat menginfeksi manusia apabila
mengalami kontak langsung dengan unggas. Infeksi pada manusia dewasa
menyebabkan gangguan pernapasan karena adanya kerusakan paru – paru.
Sedangkan pada anak – anak menimbulkan limfadenitis (Kearns 2003).
Mycobacterium avium dapat menginfeksi semua spesies unggas. Infeksi
12
Mycobacterium avium complex yang disebabkan Mycobacterium avium dan
Mycobacterium intracellular sering ditemukan pada penderita AIDS.
Pewarnaan Ziehl Neelsen yang dilakukan dengan menggunakan isolat
Mycobacterium avium menunjukkan bahwa bakteri tersebut merupakan
bakteri tahan asam. Mycobacterium avium yang diamati memiliki warna
merah dan berbentuk basil ramping, sedikit bengkok, dan ujungnya membulat.
Koloni bakteri Mycobacterium avium berkelompok diantara jaringan yang
terinfeksi. Pewarnaan Ziehl Neelsen bakteri Mycobacterium avium dilakukan
sebagai demo karena bakteri tersebut berbahaya dan memerlukan ketelitian
yang lebih.
Identifikasi Mycobacterium avium menggunakan pewarnaan Ziehl
Neelsen karena bakteri tersebut memiliki dinding sel yang dilapisi lipid tebal
yang sebagian besar disusun oleh asam mikolat (Madigan 2003). Asam
mikolat memiliki rantai karbon yang panjang dan dinding sel Mycobacterium
avium juga dilapisi lilin. Mycobacterium avium menghasilkan koloni halus,
lembut, dan tidak tidak berpigmen sehingga tidak dapat diwarnai dengan
pewarnaan gram. Mycobacterium avium tidak dapat mempertahankan zat
warna karbol fuchsin saat dicuci menggunakan larutan asam – alkohol
(Pelczar dan Chan 2010).
Fiksasi pada pewarnaan Ziehl Neelsen dilakukan dengan cara
memanaskan preparat yang telah ditutup oleh kertas dan ditetesi kabol fuchsin
hingga berasap namun tidak terbakar. Langkah tersebut bertujuan untuk
memutus ikatan karbon lipid pada dinding sel bakteri tahan asam sehingga
reagen warna dapat masuk kedalam sel. Selain itu, fiksasi juga berfungsi
untuk mematikan tetapi tidak mengubah struktur sel bakteri dan
melekatkannnya pada kaca preparat. Pencucian dengan akuades mengalir
bertujuan untuk menutup kembali ikatan karbon lipid yang terbuka sehingga
reagen warna tidak ikut tercuci (Pelczar dan Chan 1986).
2.4. Acuan
13
Campbell NA, Reece JB. 2005. Biologi Jilid 2. Jakarta : Erlangga.
Dwijoseputro D. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : Djambatan.
Kearns KS. 2003. Avian Mycobacteriosis Recent Advances in Avian Infectious
Diseases. http://www.ivis.org/. terhubung berkala. Diakses tanggal 28
Februari 2013.
Lay BW. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta : PT Raja Grafindo
Persada.
Madigan MT. 2003. Brock Biology of Microorganism. USA : Pearson
Education, inc.
Pelczar MJ, Chan ECS. 2010. Dasar – Dasar Mikrobiologi 1. Jakarta : UI
Press.
Sutedjo M. 1991. Mikrobiologi Tanah. Jakarta : Rineka Cipta.
Thoen CO. 1997. Tuberculosis In Disease of Poultry Tenth Edition. Edited By
B.W. Calnek, H.J. Barnes, C.W. Beard, L.R. McDougald, and Y.M.Saif.
pp. 167-178.
Volk W, Wheeler MF. 1998. Mikrobiologi Dasar Jilid 1. New York : Wesky
Publishing Company.
3. Jawab pertanyaan
3.1. Melekatkan Organisme pada kaca objek, memperjelas pengamatan,
dan melekatkan bakteri pada kaca preparat.
3.2. Safranin dan ungu kristal-yodium
3.3. A. Iodine
B. Memfiksasi pewarna primer yang diserap bakteri dan mengintendifkan
warna utama
3.4. Karbolfuchsin dan biru metilen.
Asam alcohol
3.4. Merah
14
Top Related