Ririn Ariyani (B04110057)

Praktikum Mikrobiologi Medik I Laporan Minggu III

Pewarnaan Diferensial

1. Pewarnaan Gram

1.1. Deskripsi

Pewarnaan diferensial merupakan prosedur pewarnaan yang

menampilkan perbedaan di antara sel – sel mikroba atau bagian – bagian

mikroba. Prosedur pewarnaan ini biasanya menggunakan lebih dari satu zat

pewarna atau reagen pewarnaan (Pelczar dan Chan 2010).

Pewarnaan gram merupakan salah satu pewarnaan diferensial.

Pewarnaan gram merupakan suatu teknik pewarnaan diferensial yang paling

penting dan paling luas digunakan untuk bakteri. Bakteri lebih mudah diamati

dalam bentuk olesan yang diwarnai dengan reagen pewarna. Ukuran, bentuk,

susunan, dan keadaan struktur internal dapat diamati dengan mudah karena

adanya perbedaan antara bakteri dengan latar. Sel - sel individu bakteri dapat

berbentuk kokus, batang atau basil, maupun spiral (Pelczar dan Chan 2010).

Pewarnaan gram merupakan prosedur pewarnaan yang umum digunakan

untuk melakukan identifikasi bakteri, terutama di laboratorium diagnostik

rumah sakit. Pengamatan spesimen yang diwarnai dengan pewarnaan gram

mampu memberikan informasi dengan cepat mengenai organisme penyebab

infeksi sehingga dapat segera ditangani (Pelczar dan Chan 2010). Pewarnaan

bakteri dipengaruhi oleh fiksasi, pemucat, substrat, intensifikasi pewarnaan,

dan penggunaan zat warna tandingan (Sutedjo 1991).

Pewarnaan negatif menggunakan empat jenis reagen. Reagen pertama

merupakan warna dasar yaitu, ungu kristal. Bakteri gram positif maupun

negatif akan berwarna ungu setelah dilakukan pewarnaan. Reagen kedua

merupakan yodium atau larutan yang mengandung yodium seperti lugol.

Kompleks ungu kristal - yodium akan terbentuk di dalam sel. Kedua bakteri

1

gram akan tetap mempertahankan warna ungu di dalam sel masing – masing.

Reagen ketiga yang digunakan adalah aseton alkohol yang berfungsi sebagai

pemucat atau decolorizing agent (Tracy 2005). Dinding sel bakteri gram

positif akan mengalami dehidrasi dan pori – pori menciut. Bakteri gram

positif memiliki dinding sel yang kuat dan 30 lapis peptidoglikan sehingga

permeabilitas dinding sel berkurang (Madigan 2003). Hal tersebut

mengakibatkan daya rembes dinding sel dan membran bakteri menurun

sehingga kompleks ungu kristal - yodium tidak dapat keluar dan sel tetap

berwarna ungu. Bakteri gram negatif menunjukkan reaksi sebaliknya. Bakteri

gram negatif hanya memiliki 1‐2 lapis peptidoglikan sehingga memiliki

permeabilitas dinding sel lebih besar (Madigan 2003). Lipid yang terdapat

pada dinding sel bakteri akan terekstraksi sehingga pori – pori mengembang

dan kompleks ungu kristal – yodium keluar dari sel. Hal tersebut

mengakibatkan sel menjadi tidak berwarana. Reagen keempat yang digunakan

merupaka safranin yang berfungsi sebagai reagen tandingan. Bakteri gram

positif tidak akan terpengaruh dengan penambahan safranin. Namun, bakteri

gram negatif akan menyerap safranin sehingga sel berwarna merah (Pelczar

dan Chan 2010).

Contoh bakteri gram positif adalah Streptococcus, Bacillus,

Staphylococcus, Clostridia, Corynebacterium dhypteriae, Peptococcus,

Peptostreptococcus, dan lain - lain. Contoh bakteri gram negatif adalah

Neisseria, Klebesiella, Vellonella, Shigella, Salmonella, Hemophillus, dan

lain - lain (Cappuccino dan Sherman 1983).

1.2. Hasil Pengamatan

1.2.1. Isolat Staphylococcus aureus

1.2.1.1. Hasil Pengamatan

2

Pembesaran : 100x

Sifat gram : Positif

Bentuk sel : Kokus

Susunan sel : Koloni berkelompok

Referensi

(http://www.microbeworld.org/component/jlibrary/?

view=article&id=7611)

1.2.1.2. Pembahasan

Staphylococcus aureus merupakan bakteri gram positif, tidak

bergerak, tidak memiliki spora, tidak berkapsul, serta dinding

selnya mengandung peptidoglikan dan asam teikhoat. Metabolisme

yang dimiliki Staphylococcus aureus dapat berupa aerob dan

3

anaerob. Staphylococcus aureus dapat membentuk koagulasi

sehingga berpotensi menjadi patogen invasif. Staphylococcus

aureus biasanya ditemukan di kulit dan hidung manusia serta

kadang menimbulkan infeksi. Infeksi yang ditimbulkan juga dapat

disebabkan oleh kontaminasi langsung pada luka (Jawetz 1996).

Pewarnaan gram yang dilakukan dengan menggunakan isolat

Staphylococcus aureus menunjukkan bahwa bakteri tersebut

merupakan bakteri gram positif. Staphylococcus aureus yang

diamati memiliki warna ungu pudar dan memiliki bentuk kokus

dengan koloni berkelompok seperti buah anggur. Namun, bentuk

koloni yang berkelompok tidak terlihat terlalu jelas. Hal tersebut

disebabkan pengolesan yang terlalu rata dan penekanan pada ose

yang berlebihan. Selain itu, warna ungu yang dicitrakan tidak

terlalu jelas atau pudar. Hal tersebut diduga akibat pencucian

dengan akuades dan aseton alkohol yang terlalu lama sehingga

kompleks ungu kristal – yodium ada yang ikut tercuci.

1.2.2. Isolat Bacillus subtilis

1.2.2.1. Hasil Pengamatan

Pembesaran : 100x

Sifat gram : Positif

4

Bentuk sel : Basil

Susunan sel : Koloni berantai

Referensi

(http://lib.jiangnan.edu.cn/ASM/116-2.jpg)

1.2.2.2. Pembahasan

Bacillus subtilis merupakan bakteri yang umum ditemukan

ditanah dan bukan merupakan bakteri patogen bagi manusia. Alat

gerak yang dimiliki Bacillus subtilis adalah flagela yang massif

sehingga dapat bergerak cepat untuk ukuran bakteri (Singleton dan

Sainsbury 2006). Bacillus subtilis merupakan kelompok bakteri

gram positif. Bacillus subtilis juga mampu memproduksi peptida

antibiotik yaitu Difficidin, Subtilin, Mycobacillin. Endospora

merupakan metode Bacillus subtilis untuk bertahan hidup, bukan

reproduksi. Endospora Bacillus subtilis terletak pada subterminal

(Pelczar dan Chan 2010).

Pewarnaan gram yang dilakukan dengan menggunakan isolat

Bacillus subtilis menunjukkan bahwa bakteri tersebut merupakan

bakteri gram positif. Bacillus subtilis yang diamati memiliki warna

ungu dan berbentuk basil yang ramping. Sel – sel bakteri Bacillus

subtilis membentuk koloni berantai. Pewarnaan yang dilakukan

memberikan hasil sesuai dengan literatur karena warna yang

terserap oleh Bacillus subtilis merupakan warna ungu, bakteri

5

tidak menumpuk, serta koloni tidak terpisah sehingga bentuk

berantai masih dapat diamati.

1.2.3. Isolat Escherichia coli

1.2.3.1. Hasil Pengamatan

Pembesaran : 100x

Sifat gram : Negatif

Bentuk sel : Basil tapi lebih pendek dan lebih lebar dari

Bacillus subtilis

Susunan sel : Koloni menyebar

Referensi

(http://biology.clc.uc.edu/fankhauser/labs/microbiology/

gram_stain/Gram_stain_images/index_gram_stain_images.html)

1.2.3.2. Pembahasan

6

Escherichia coli merupakan anggota famili Enterobacteraceae

yang berbentuk batang, fermentatif, dan termasuk kelompok

bakteri gram negatif. Escherichia coli hidup dalam jumlah besar di

dalam usus manusia dan bertugas membantu sistem pencernaan

serta melindungi dari serangan bakteri patogen. Namun,

Escherichia coli pada strain baru ditemukan berupa bakteri

patogen berbahaya karena menjadi penyebab diare, sindrom diare

lanjutan, muntaber, hemolitic uremic , infeksi usus, infeksi saluran

urin, dan neonatal meningitis. Kelebihan yang dimiliki Escherichia

coli adalah dapat dimanfaatkan sebagai indikator level pencemaran

air dan mendeteksi patogen pada feses manusia yang disebabkan

oleh Salmonella typhi. Bakteri lain yang berfungsi sebagai

indikator pencemaran selain Escherichia coli adalah

Streptococcus (Enterococcus) fecal, dan Clostridium perfringens.

Selain itu, Escherichia coli juga digunakan dalam teknologi

rekayasa genetika. Escherichia coli biasa digunakan sebagai vektor

untuk menyisipkan gen - gen tertentu yang diinginkan untuk

dikembangkan karena Escherichia coli memiliki tingkat

pertumbuhan yang sangat cepat dan mudah dalam penanganannya

(Lay dan Hastowo 1992).

Pewarnaan gram yang dilakukan dengan menggunakan isolate

Escherichia coli menunjukkan bahwa bakteri tersebut merupakan

bakteri gram negatif. Escherichia coli yang diamati memiliki

warna merah dan berbentuk basil yang lebih pendek serta lebih

lebar dibandingkan Bacillus subtilis. Preparat Escherichia coli

agak sulit diamati karena bakteri tersebut menumpuk dibeberapa

tempat dan sangat padat. Kesalahan tersebut diakibatkan oleh

pengolesan ose yang kurang merata. Warna merah yang terlihat

sesuai dengan literatur.

7

1.2.4. Isolat Campuran (Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, dan

Escherichia coli)

1.2.4.1. Hasil Pengamatan

Pembesaran : 100x

Sifat gram : Negatif (E. coli)

Positif (S. aureus dan B. subtilis)

Bentuk sel : Basil tapi lebih pendek dan lebih lebar dari

Bacillus subtilis (E. coli)

Kokus (S. aureus)

Basil (B. subtilis)

Susunan sel : Koloni kelompok (E. coli)

Koloni berantai (S. aureus)

Koloni menyebar (B. subtilis)

8

Referensi

(http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/

S0092867406004338)

(http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/

S0167701201003037)

1.2.4.2. Pembahasan

Staphylococcus aureus merupakan bakteri gram positif, tidak

bergerak, tidak memiliki spora, tidak berkapsul, serta dinding

selnya mengandung peptidoglikan dan asam teikhoat (Jawetz

1996). Bacillus subtilis merupakan bakteri yang umum ditemukan

ditanah dan bukan merupakan bakteri patogen bagi manusia. Alat

gerak yang dimiliki Bacillus subtilis adalah flagela yang massif

sehingga dapat bergerak cepat untuk ukuran bakteri (Singleton dan

Sainsbury 2006). Bacillus subtilis merupakan kelompok bakteri

gram positif. Escherichia coli merupakan anggota famili

Enterobacteraceae yang berbentuk batang, fermentatif, dan

termasuk kelompok bakteri gram negatif (Lay dan Hastowo 1992).

Pengamatan yang dilakukan pada preparat isolat menunjukkan

ketiga bakteri yang masing – masing terwarnai sesuai sifatnya. Sel

Staphylococcus aureus dan Bacillus subtilis menunjukkan warna

ungu yang menandakan bahwa keduanya mampu menyerap reagen

warna ungu kristal dengan baik. Escherichia coli berwarna merah

menandakan bakteri tersebut menyerap warna safranin.

Kesimpulan yang diambil dari pengamatan isolat campuran adalah

9

meskipun beberapa bakteri dicampur dan diwarnai secara

bersamaan, bakteri – bakteri tersebut akan tetap menyerap reagen

warna sesuai dengan sifat dinding selnya.

1.3. Acuan

Campbell NA, Reece JB. 2005. Biologi Jilid 2. Jakarta : Erlangga.

Cappuccino JG, Sherman N. 1983. Microbiology A Laboratory Manual. New

York : Addison-Wesley Publishing Company.

Jawetz E. 1996. Mikrobiologi Kedokteran Edisi 20. Jakarta : EGC.

Lay BW, Hastowo S. 1992. Mikrobiologi. Bogor : IPB Press.

Madigan MT. 2003. Brock Biology of Microorganism. USA : Pearson

Education, inc.

Pelczar MJ, Chan ECS. 2010. Dasar – Dasar Mikrobiologi 1. Jakarta : UI

Press.

Singleton P, Sainsbury D. 2006. Dictionary of Microbiology and Molecular

Biology 3rd Edition. Sussex, England : John Wiley and Sons.

Sutedjo M. 1991. Mikrobiologi Tanah. Jakarta : Rineka Cipta.

Tracy. 2005. Gram Staining. www.tracy.k12.ca.us/thsadvbio/pdfs/gram

%20stain.pdf. Terhubung berkala. Diakses tanggal 28 Februari 2013.

2. Pewarnaan Ziehl Neelsen

2.1. Deskripsi

Pewarnaan Ziehl Neelsen, atau disebut juga pewarnaan tahan asam

merupakan salah satu bentuk pewarnaan diferensial. Pewarnaan ini membagi

bakteri menjadi kelompok bakteri tahan asam dan tidak tahan asam

(Dwidjoseputro 1998). Pewarnaan tahan asam merupakan suatu metode

pewarnaan yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri yang memiliki

dinding sel dengan kandungan peptidoglikan, arabinogalaktan, dan lipid yang

50% tersusun atas asam mikolat, sehingga tidak dapat diwarnai dengan

10

pewarnaan gram. Asam mikolat merupakan asam lemak rantai panjang yang

terdiri atas 34‐90 karbon (Madigan 2003).

Pewarnaan Ziehn Neelsen, selanjutnya ditulis ZN, terdiri dari

pewarnaan ZN‐A berupa pewarna merah yaitu, karbol fuchsin, asam –

alcohol, fenol, dan akuades. Pewarnaan ZN‐B yang tidak berwarna yaitu, HCl

dan etil alcohol. Pewarnaan ZN‐C berupa pewarna biru sebagai pewarna

tandingan yaitu, biru metilen dan akuades. Bakteri tahan asam akan berwarna

merah setelah pemberian asam ‐ alkohol. Sedangkan bakteri tidak tahan asam

akan berwarna biru karena dekolorisasi oleh asam ‐ alkohol, jadi digunakan

biru metilen sebagai pewarna tandingan (Madigan 2003).

Bakteri yang termasuk kelompok tahan asam BTA adalah

Mycobacterium tuberculose, Mycobacterium avium, Mycobacterium bovis,

Mycobacterium leprae, Nocandia meningitidis, dan Nocandia gonorrhoeae

(Syahrurachman 1994). Kelompok bakteri tersebut disebut dapat

mempertahankan zat warna karbol fuchsin saat dicuci dengan larutan pemucat

yaitu, asam alkohol (Lay 1994).

2.2. Hasil Pengamatan Mycobacterium avium

Pembesaran : 100x

Sifat tahan asam : Tahan asam

Bentuk sel : Batang ramping, sedikit bengkok, dan kedua

ujungnya membulat

11

Susunan sel : Koloni berkelompok

Referensi

(http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1201971211001020)

2.3. Pembahasan

Mycobacterium avium merupakan bakteri dengan bentuk batang

langsing, namun beberapa bakteri memiliki ujung yang melengkung. Ukuran

Mycobacterium avium sekitar 1 hingga 3 μm, tidak memproduksi spora,

namun dapat ditemukan granul pada sitoplasmanya (Thoen 1997).

Mycobacterium avium dapat tumbuh pada temperatur 250C hingga 430C,

meskipun suasana yang paling disukai adalah 390C hingga 450C.

Mycobacterium avium dapat bertahan hidup dalam waktu yang lama di tanah

atau lingkungan yang tercemar selama berbulan – bulan bahkan bertahun -

tahun .

Infeksi Mycobacterium avium pada unggas dapat menyebabkan

penyakit Avian tuberculosis yang juga dapat menginfeksi manusia apabila

mengalami kontak langsung dengan unggas. Infeksi pada manusia dewasa

menyebabkan gangguan pernapasan karena adanya kerusakan paru – paru.

Sedangkan pada anak – anak menimbulkan limfadenitis (Kearns 2003).

Mycobacterium avium dapat menginfeksi semua spesies unggas. Infeksi

12

Mycobacterium avium complex yang disebabkan Mycobacterium avium dan

Mycobacterium intracellular sering ditemukan pada penderita AIDS.

Pewarnaan Ziehl Neelsen yang dilakukan dengan menggunakan isolat

Mycobacterium avium menunjukkan bahwa bakteri tersebut merupakan

bakteri tahan asam. Mycobacterium avium yang diamati memiliki warna

merah dan berbentuk basil ramping, sedikit bengkok, dan ujungnya membulat.

Koloni bakteri Mycobacterium avium berkelompok diantara jaringan yang

terinfeksi. Pewarnaan Ziehl Neelsen bakteri Mycobacterium avium dilakukan

sebagai demo karena bakteri tersebut berbahaya dan memerlukan ketelitian

yang lebih.

Identifikasi Mycobacterium avium menggunakan pewarnaan Ziehl

Neelsen karena bakteri tersebut memiliki dinding sel yang dilapisi lipid tebal

yang sebagian besar disusun oleh asam mikolat (Madigan 2003). Asam

mikolat memiliki rantai karbon yang panjang dan dinding sel Mycobacterium

avium juga dilapisi lilin. Mycobacterium avium menghasilkan koloni halus,

lembut, dan tidak tidak berpigmen sehingga tidak dapat diwarnai dengan

pewarnaan gram. Mycobacterium avium tidak dapat mempertahankan zat

warna karbol fuchsin saat dicuci menggunakan larutan asam – alkohol

(Pelczar dan Chan 2010).

Fiksasi pada pewarnaan Ziehl Neelsen dilakukan dengan cara

memanaskan preparat yang telah ditutup oleh kertas dan ditetesi kabol fuchsin

hingga berasap namun tidak terbakar. Langkah tersebut bertujuan untuk

memutus ikatan karbon lipid pada dinding sel bakteri tahan asam sehingga

reagen warna dapat masuk kedalam sel. Selain itu, fiksasi juga berfungsi

untuk mematikan tetapi tidak mengubah struktur sel bakteri dan

melekatkannnya pada kaca preparat. Pencucian dengan akuades mengalir

bertujuan untuk menutup kembali ikatan karbon lipid yang terbuka sehingga

reagen warna tidak ikut tercuci (Pelczar dan Chan 1986).

2.4. Acuan

13

Campbell NA, Reece JB. 2005. Biologi Jilid 2. Jakarta : Erlangga.

Dwijoseputro D. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : Djambatan.

Kearns KS. 2003. Avian Mycobacteriosis Recent Advances in Avian Infectious

Diseases. http://www.ivis.org/. terhubung berkala. Diakses tanggal 28

Februari 2013.

Lay BW. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta : PT Raja Grafindo

Persada.

Madigan MT. 2003. Brock Biology of Microorganism. USA : Pearson

Education, inc.

Pelczar MJ, Chan ECS. 2010. Dasar – Dasar Mikrobiologi 1. Jakarta : UI

Press.

Sutedjo M. 1991. Mikrobiologi Tanah. Jakarta : Rineka Cipta.

Thoen CO. 1997. Tuberculosis In Disease of Poultry Tenth Edition. Edited By

B.W. Calnek, H.J. Barnes, C.W. Beard, L.R. McDougald, and Y.M.Saif.

pp. 167-178.

Volk W, Wheeler MF. 1998. Mikrobiologi Dasar Jilid 1. New York : Wesky

Publishing Company.

3. Jawab pertanyaan

3.1. Melekatkan Organisme pada kaca objek, memperjelas pengamatan,

dan melekatkan bakteri pada kaca preparat.

3.2. Safranin dan ungu kristal-yodium

3.3. A. Iodine

B. Memfiksasi pewarna primer yang diserap bakteri dan mengintendifkan

warna utama

3.4. Karbolfuchsin dan biru metilen.

Asam alcohol

3.4. Merah

14