LAPORAN PRAKTIKUM
KULTUR JARINGAN TANAMAN
ACARA I
STERILISASI PERALATAN
Oleh:
Hilman Arifin
NIM A1L011045
KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN
UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS PERTANIAN
PURWOKERTO
2012
I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Kultur jaringan merupakan suatu teknik budidaya yang dilakukan secara
invitro, tanaman dikembangkan dengan cara dicukupi kebutuhannya secara
lengkap dan diperhitungkan secara tepat kadar kebutuhannya. Dasar dari teknik
budidaya kultur jaringan adalah teori totipotensi sel, suatu teori yang
mengungkapkan bahwa suatu sel mampu berkembang biak menjadi tanaman
yang sempurna apabila diletakkan pada media dan kondisi lingkungan yang
sesuai.
Berdasarkan teori tersebut maka dalam kultur jaringan harus
menggunakan media yang sesuai untuk tanaman yang dikulturkan dan kondisi
lingkungan juga harus sesuai. Kondisi lingkungan yang sesuai meliputi suhu,
kelembaban, pencahayaan dan hal yang paling utama yaitu kondisi harus
aseptis. Keadaan yang aseptis merupakan syarat mutlak dalam kultur jaringan.
Kondisi aseptis tidak hanya sebatas pada kondisi lingkungan, semua bahan dan
sesutu yang berhubungan dengan kegiatan tersebut haruslah dalam kondisi
aseptis.
Pelaksanaan teknik kultur jaringan tanaman dilakukan berdasarkan teori
totipotensi sel yaitu kemampuan setiap sel untuk tumbuh menjadi tanaman
sempurna apabila diletakkan pada lingkungan yang cocok dalam keadaan
aseptik.
Teknik kultur jaringan akan berhasil dengan baik apabila semua
persyaratan dipenuhi yaitu: media yang cocok, kondisi atmosfer yang sesuai
dan kondisi aseptik. Kondisi aseptik berlaku untuk eksplan (bahan tanam),
ruangan dan peralatan yang digunakan. Apabila kondisi aseptik tidak dipenuhi,
maka kultur akan gagal karena kontaminasi.
Untuk itu perlu dilakukan sterilisasi peralatan yang akan digunakan.
Sterilisasi dilakukan dengan menggunakan autoclave (pakai kompor atau
listrik), dengan suhu dan tekanan tertentu.
B. Tujuan Praktikum
Praktikum ini bertujuan untuk meningkatkan keterampilan mahasiswa
dalam melakukan sterilisasi peralatan dengan autoclave.
II. METODE PELAKSANAAN
A. Waktu
Praktikum dilakukan pada tanggal 26 November 2012
B. Tempat pelaksanaan
Praktikum dilakukan di Laboratorium Agronomi Fakultas Pertanian
C. Alat dan Bahan
- Autoclave.
- Kompor.
- Glass ware (botol kultur, erlenmeyer, petridish).
- Dissecting kit (pinset dan skalpel).
- Kertas payung
- Alumunium foil
- Karet gelang
- Pipet
- Pengaduk
- Sabun
- Air.
D. Prosedur Kerja
- Glass ware (botol kultur, erlenmeyer, petridish) dan dissecting kit (pinset
dan skalpel) dicuci bersih dengan sabun, dibilas dengan air lalu
dikeringkan. Setelah kering mulut botol ditutup dengan aluminium foil dan
kertas payung dan diikat dengan karet gelang. Pinset dan skalpel
dibungkus dengan kertas atau aluminium foil.
- Glass ware dan dissecting kit disterilisasi dengan autoclave pada suhu 1200
C pada tekanan 15 psi selama 15-30 menit.
- Selama sterilisasi autoclave ditutup rapat sehingga tekanan didalam
autoclave naik.
- Tekanan tinggi itu dipertahankan selama 30 menit dengan mengecilkan
api.
- Kompor dimatikan setelah proses sterilisasi selesai dan katup dibuka untuk
membuang uap air hingga tekanan 0 psi.
- Autoclave dibuka dan diambil peralatan yang sudah ada di dalamnya
diambil.
- Peralatan yang sudah disterilisasi disimpan ditempat yang bersih.
III. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil
No Nama Alat Gambar Fungsi
1 Autoclave Untuk mensterilisasi
peralatan dan media
2 Magnetic Stirer Untuk mengaduk dan
mencampur larutan
3 pH meter Untuk mengukur pH
4 Timbangan
analitik
Untuk menimbang
bahan-bahan kimia
No Nama Alat Gambar Fungsi
5 Laminar Air
Flow
Untuk melakukan
penanaman eksplan
dalam kultur jaringan
6 Erlenmeyer Untuk menampung
larutan
7 Beaker glass Untuk menampung dan
membuat media
8 Botol kultur Untuk tempat kultur
(eksplan)
9 Gelas ukur Untuk mengukur larutan
No Nama Alat Gambar Fungsi
10 Pinset Untuk mengambil
eksplan
11 Scalpel Untuk memotong
eksplan
12 Pipet Untuk mengambil dan
memindah larutan
13 Suntikan Untuk mengambil
larutan dalam jumlah
kecil
14 Hand sprayer Untuk sterilisasi dengan
alcohol
15 Petridish Untuk meletakkan
eksplan
16 Pembakar
Bunsen
Untuk memflamir
eksplan, pinset, scalpel
dan mulut botol
17 Alumunium foil Untuk menutup mulut
botol
18 Rak kultur Untuk meletakkan botol
kultur yang sudah
ditanami eksplan
19 Tisu Untuk mengeringkan
alat
20 Kertas payung Untuk membungkus
petridis dan alat-alat
dari logam untuk
disterilisasi
21 Pengaduk kaca Untuk mengaduk
larutan
B. Pembahasan
Ruang dan alat yang digunakan dalam kutur jaringan harus dalam kondisi
steril. Sterilisasi ruang dapat dilakukan dengan menggunakan lampu UV dan
alcohol 90%. Tujuan dari sterilisasi ruang adalah untuk menghindari kontaminasi
yang disebabkan mikroorganisme yang ada di alat maupun beterbangan di udara
sekitar ruangan. Srerilisasi ruang seperti tersebut mutlak dilakukan pada ruang
penabur atau tempat yang untuk jaringan. Ruang-ruang yang tidak lebih harus
100% steril karena tidak berhubungan langsung dengan media maupun jaringan
yang akan ditanam. Peralatan yang akan digunakan juga harus dalam keadaan
steril juga dapat biasanya menggunakan autoclave untuk sterilisasinya. Tujuan
dari sterilisasi alat ini untuk menghindari terjadinya kontaminasi oleh mikro
organisme seperti jamur dan bakteri, yang menempel pada alat sehingga dapat
mengggagalkan kultur jaringan (Soebardini M dan Slamet Rachadi, 2011).
Ada beberapa persyaratan yang harus dipenuhi jika kita akan menggunakan
teknik kultur jaringan untuk menumbuhkan suatu tanaman. Persyaratan tersebut
adalah adanya peralatan yang mendukung teknik kultur jaringan dan pengetahuan
dasar mengenai teknik kultur jaringan misalnya teknik aseptik dalam kultur
jaringan. Peralatan minimum yang harus dimiliki oleh suatu laboratorium seperti
alat sterilisasi, laminar atau kotak steril, peralatan untuk membuat media, bahan-
bahan kimia, alat-alat kaca, dan ruang penyimpanan kultur. Teknik aseptik dalam
kultur jaringan berhubungan dengan cara-cara melakukan sterilisasi. Ada
beberapa cara sterilisasi yang digunakan dalam teknik kultur jaringan adalah
sebagai berikut:
Sterilisasi Kering, Sterilisasi ini digunakan untuk peralatan yang terbuat dari
logam, kaca, atau kertas, contohnya pinset, gagang pisau, batang pengaduk, cawan
petri, dan kertas saring. Dalam sterilisasi ini, alat yang akan disteril harus
dibungkus terlebih dahulu dengan menggunakan aluminium foil atau kertas.
Kemudian peralatan tersebut dmasukkan dalam oven bersuhu 120 0 C, dan waktu
yang dibutuhkan minimal 1 jam. Setelah steril, peralatan disimpan di tempat yang
kering dan bersih.
Sterilisasi Basah, Sterilisasi basah sering digunakan untuk peralatan dan
bahan-bahan, seperti media, akuades. Umumnya peralatan yang disterilkan
menggunakan cara ini adalah peralatan logam, kaca, atau peralatan apapun yang
tahan terhadap suhu dan tekanan yang tinggi. Hal ini karena teknik sterilisasi ini
menggunakan Autoclave dengan tekanan 1,5 atm dan suhu 121 0 C dengan waktu
yang dibutuhkan 1-20 menit. Setelah sterilisasi selesai, bahan atau peralatan
disimpan di tempat yang kering dan bersih.
Sterilisasi dengan Sinar Ultraviolet (UV), Sterilisasi ini dilakukan pada
laminar air flow atau kotak alir udara, dengan tujuan agar kotak menjadi steril
sehingga bisa digunakan untuk penanaman. Kotak alir udara dilengkapi dengan
lampu UV. Sebelum lampu UV dinyalakan, permukaan dalam kotak dibersihkan
dengan menggunakan alkohol 70%. Lampu UV dinyalakan minimal 1 jam
sebelum pemakaian, dan pada saat pemakaian jangan lupa untuk mematikan
lampu UV-nya.
Sterilisasi dengan Bahan Kimia, Bahan-bahan yang biasanya digunakan
untuk sterilisasi ini antara lain alkohol, natrium hipoklorit (NaOCl), kalsium
hipoklorit atau kaporit (CaOCl), sublimat (HgCl2 ), dan hidrogen peroksida
(H2O2).
Sterilisasi dengan Menggunakan Filter, Teknik sterilisasi ini adalah dengan
menggunakan sterilisasi filter untuk bahan-bahan yang tidak tahan terhadap panas
seperti antibiotika dan hormon. Sterilisasi biasanya dilakukan dengan filter ukuran
0,2 µm.
Ada beberapa peralatan yang digunakan dan fungsinya dalam teknik kultur
jaringan, antara lain :
1. Aluminium foil : alat ini digunakan untuk meletakkan bahan – bahan kimia
pada saat ditimbang dan juga digunakan untuk menutup serta membungkus
botol erlemeyer agar larutan stok tidak rusak.
2. Plastik dan karet : alat ini digunakan untuk menutup botol kultur agar
mikroba penyebab kontaminasi tidak dapat masuk ke dalam.
3. Petridish : digunakan sebagai tempat untuk meletakkan eksplan pada saat
penanaman.
4. Erlenmeyer : digunakan sebagai tempat untuk menuangkan air suling, sebagai
tempat menampung media maupun stok media. Erlenmeyer juga bisa
digunakan sebagai tempat pananaman karena mempunyai dasar yang lebar
dan mulut yang sempit. Sebab mulut yang lebar memperbesar peluang
kontaminasi.
5. Keras buram : alat ini digunakan untuk membungkus alat – alat kultur dan
petridish sebelum disterillisasikan.
6. Stirrer : digunakan sebagai pengaduk media hingga media menjadi menjadi
homogen secara otomatis.
7. Gelas ukur : untuk mengukur larutan bahan kimia atau larutan stok yang akan
digunakan untuk pembuatan media.
8. Gelas piala :digunakan sebagai tempat untuk pembuatan media Ms.
9. Pinset : untuk mengambil eksplan pada saat eksplan akan ditanam.
10. Kertas label : untuk memberi keterangan pada botol kultur yang digunakan.
11. Panci dan pengaduk : alat ini digunakan untuk memasak media yang akan
digunakan serta untuk mengaduk media.
12. Magnetic stirrer : Alat ini berfungsi untuk menggojog dan pemanas. Alat ini
digunakan dalam pembuatan stok media. Batang pengaduk magnetik
dimasukkan ke dalam erlenmeyer, sehingga pada saat dinyalakan pengaduk
akan bergerak memutar. Sehingga bahan kimia di dalamnya dapat larut
dengan cepat dan baik.
13. Bunsen : digunakan untuk membakar dissecting kit, blade dan pinset pada
saat penanaman eksplan.
14. Tissue : untuk membersihkan alat – alat kultur dan LAF.
15. Sprayer : digunakan sebagai alat penyemprot yang berisi alkohol 70% dan
90% untuk mensterilkan alat dan ruang penanaman.
16. Corong : untuk menuangkan media ke dalam botol kultur.
17. Pipet tetes : untuk mengambil larutan yang akan digunakan atau protoplas.
18. Scalpel :digunakan sebagai tempat untuk meletakkan blade.
19. Blade : untuk memotong eksplan pada saat penanaman.
20. Botol kutur : sebagai tempat yang berisi media yang bernutrisi dan juga
sebagai tempat pertumbuhan serta perkembangan eksplan.
21. pH meter : digunakan untuk mengukur pH larutan stok.
22. Timbangan analitik : untuk menimbang larutan stok yang akan digunakan.
23. LAF : berfungsi sebagai tempat untuk penanaman eksplan. LAF harus selalu
dalam kondisi steril. Sterilisasi LAF dapat dilakukan dengan menyemprot dan
mengelapnya menggunakan alkohol 96 % atau formalin 5 % dan disinari
dengan sinar UV.
24. Rak kultur : untuk meletakkan botol – botol kultur.
25. Kompor gas : untuk memanaskan autoclave dan untuk memasak media.
26. Autoclave : Autoclave digunakan untuk sterilisasi peralatan dan media.
Pemanasan autoclave biasanya digunakan kompor gas. Pengaturan tekanan
dapat dilakukan dengan mengatur katup pada tutup autoclave. Bila tekanan
dalam autoclave naik maka secara otomatis katupnya akan terbuka untuk
mengurangi tekanan. Dengan demikian tekanan akan dapat dipertahankan
disebabkan sebagaian uap keluar (Daisy dan Ari, 2002). Pada praktikum kali
ini . untuk sterilisasi alat dibutuhkan waktu sekitar 30 menit. Suhu dalam
autoclave dipertahankan antara 1200C dan tekanan 17,5 Psi dengan cara
membesar atau mengecilkan nyala api kompor.
Cara kerja menggunakan Autocalve, LAF, pH meter, dan Hot Plate Magnetic
Stirer.
1. Autoclave:
- Botol bersih diberi beberapa tetes aquadest dan tutup dengan kertas atau
aluminium foil (jangan terlalu kencang bila menggunakan aluminium foil).
Untuk botol-botol yang mempunyai tutup yang autoclaveable, jangan tutup
terlalu kencang, karena selama pemanasan terjadi pemuaian.
- Alat-alat yang perlu disterilkan sebelum penanaman adalah: pinset, gunting,
gagang skalpel, kertas saring, petridish, botol kultur, jarum dan pipet.
- Alat-alat dan kertas saring dibungkus rapi dengan kertas tebal atau ditaruh
dalam baki stainless steel dan bakinya dibungkus dengan kain tebal sebelum
dimasukkan dalam autoklaf. Alumunium foil tidak direkomendasikan sebagai
pembungkus, karena uap tidak dapat masuk ke dalam bungkusan. Alat-alat
sektio seperti pinset, gunting, gagang skalpel, dan jarum, dibungkus dengan
kertas kopi atau kertas merang. Hindarkan penggunaan Al-foil karena uap
sukar masuk kedalam bungkusan sehingga sterilisasi kurang efektif.
- Petridish akan disterilkan, juga dibungkus dengan kertas kopi atau kertas
merang.
- Temperatur yang digunakan untuk sterilisasi botol kultur kosong dan alat-alat
yang akan digunakan untuk menanam eksplan, adalah 121°C pada tekanan 15
psi (pound per square inch) atau 1 atm selama 30-60 menit. Penghitungan
waktu sterilisasi dimulai setelah tekanan dan temperatur yang diinginkan
tercapai.
2. LAF:
- Nyalakan lampu U.V., minimum selama 30 menit, sebelum laminar air flow
digunakan. Hindarkan sinarnya dari badan dan mata.
- Siapkan semua alat-alat steril yang akan dipergunakan. Alat-alat yang
dimasukkan ke dalam Laminar Air Flow Cabinet, disemprot terlebih dahulu
dengan alcohol 70% atau spiritus.
- Meja dan dinding dalam LAF disemprot dengan alkohol 70% atau spiritus
untuk mensterilkan LAF.
- Blower pada LAF dihidupkan untuk menjalankan air flow.
- Nyalakan lampu dalam LAF.
- LAF sudah siap untuk digunakan.
3. pH meter:
- Meletakkan pH-meter pada keadaan standby on jika tidak dipakai; jangan
ditekan off.
- Menyiram electrode dengan aquades perlahan sebelum digunakan. Lalu
masukkan ujung pH meter ke dalam larutan. Menyiram electrode dengan
aquades kembali sesudah digunakan dan letakan pada silinder kembali.
- Jangan dibiarkan elektrode diluar larutan pada waktu yang lama.
4. Hot Plate Magnetik Stirer:
- Nyalakan Heater, lalu letakkan bekker glass di atas heater.
- Letakkan stirrer di dalam becker glass.
- Masukkan larutan satu per satu ke dalam bekker glass.
- Tunggu beberapa saat sampai larutan menjadi homogen.
IV. PENUTUP
A. Kesimpulan
Berdasarkan praktikum yang sudah dilakaukan dapat diketahui, bahwa
Sterilisasi adalah salah satu prosedur yang digunakan untuk menghilangkan
mikroorganisme. Semua alat – alat dan media yang akan digunakan dalam
kultur jaringan harus disterillisasi dahulu menggunakan autoclave agar mikroba
penyebab kontaminasi hilang dan mati, dan dalam kegiatan kultur jaringan,
semua ruangan dan peralatan kultur harus selalu dalam keadaan steril.
DAFTAR PUSTAKA
Chatimatun Nisa dan Rodinah, 2005. Kultur Jaringan Beberapa Kultivar Buah
Pisang (Musa paradisiaca L.) Dengan Pemberian Campuran Naa Dan
Kinetin. Volume 2, Nomor 2, Juli 2005, Halaman 23-36.
Rahardja, P. C. 1995. Kultur Jaringan : Teknik Perbanyakan Tanaman Secara
Modern. Penerbit Swadaya, Jakarta.
M, Soebardini dan Slamet Rochdi. 2011. “Handout Kultur Jaringan Tanaman
Hortikultura”. Fakultas Pertanian Universitas Jenderal Soedirman,
Purwokerto.
Murashige, T. 1974. Plant propogation through tissue culture. Ann. Rev. Plant
Physiology.Pierik, R. L. M. 1975. Callus multiplication of Aunthurium
andraenum L. in liquid media. Neth. J. Agric. Sci.: 229.
Sriyanti, Daisy P. dan Ari Wijayani. 2002. Teknik Kultur Jaringan : Pengenalan
dan Petunjuk Perbanyakan Tanaman Secara Vegetatif-Modern. Kanisius,
Yogyakarta.
Suryowinoto, Moeso. 2000. Pemuliaan Tanaman Secara In-Vitro. Kanisius,
Yogyakarta.
Widarto, L. 2000. Perbanyakan Tanaman dengan Biji, Stek, Cangkok, Sambung,
Okulasi dan Kultur Jaringan. Kanisius, Yogyakarta.