Medium Kultur Jaringan

23
Pokok bahasan III : MEDIUM KULTUR JARINGAN Pendahuluan Salah satu faktor penentu keberhasilan pelaksanaan kerja kultur jaringan adalah pemberian nutrisi dalam jumlah dan perbandingan yang benar pada medium kultur. Medium yang dipergunakan pada kultur in vitro tumbuhan ada bermacam-macam. Pemilihan medium tergantung pada jenis tanaman yang digunakan, selera, tujuan serta perhitungan masing-masing peneliti. Isi dan komposisi dari medium kultur dirancang secara khusus untuk tujuan yang berbeda. Medium MS, singkatan dari nama penemunya, Murashige dan Skoog atau LS singkatan dari Linsmaier dan Skoog merupakan medium yang sangat banyak digunakan untuk kultur kalus dan regenerasi berbagai tanaman, medium ini mengandung garam-garam mineral dengan konsentrasi tinggi dan senyawa N dalam bentuk ammonium dan nitrat ; medium B5 (Gamborg) banyak digunakan untuk kultur suspensi sel tanaman leguminosae; Nitsch & Nitsch, N6 (Chu) banyak digunakan untuk serealia dan tanaman lain; medium WPM (Lloyd dan McCown) untuk kultur jaringan tanaman berkayu; Vacin dan Went (VW) dan Knudson C banyak digunakan untuk anggrek; medium Kao dan Michayluk digunakan untuk kultur protoplas Cruciferae, Gramineae dan Leguminosae. Pada dasarnya tidak ada satu macam medium kultur yang dapat memberikan pertumbuhan optimal untuk semua sel, penggantian medium atau salah satu komponen medium seringkali diperlukan untuk merespon setiap type pertumbuhan dari satu macam eksplan. Studi literature sangat diperlukan untuk mengembangkan atau memodifikasi medium kultur, modifikasi dari medium kultur yang telah ada umumnya didasarkan pada trial and error. Tujuan Instruksional Khusus Setelah mengikuti kuliah ini diharapkan mahasiswa dapat menjelaskan komponen dasar medium kultur jaringan, kebutuhan zat-zat anorganik dan organik, substansi organik lamplek, bahan tambahan lain pada medium kultur dan proses pembuatan medium .

description

hi hey hello..

Transcript of Medium Kultur Jaringan

Page 1: Medium Kultur Jaringan

Pokok bahasan III : MEDIUM KULTUR JARINGAN

Pendahuluan Salah satu faktor penentu keberhasilan pelaksanaan kerja kultur jaringan

adalah pemberian nutrisi dalam jumlah dan perbandingan yang benar pada

medium kultur. Medium yang dipergunakan pada kultur in vitro tumbuhan ada

bermacam-macam. Pemilihan medium tergantung pada jenis tanaman yang

digunakan, selera, tujuan serta perhitungan masing-masing peneliti. Isi dan

komposisi dari medium kultur dirancang secara khusus untuk tujuan yang

berbeda. Medium MS, singkatan dari nama penemunya, Murashige dan Skoog

atau LS singkatan dari Linsmaier dan Skoog merupakan medium yang sangat

banyak digunakan untuk kultur kalus dan regenerasi berbagai tanaman, medium

ini mengandung garam-garam mineral dengan konsentrasi tinggi dan senyawa N

dalam bentuk ammonium dan nitrat ; medium B5 (Gamborg) banyak digunakan

untuk kultur suspensi sel tanaman leguminosae; Nitsch & Nitsch, N6 (Chu)

banyak digunakan untuk serealia dan tanaman lain; medium WPM (Lloyd dan

McCown) untuk kultur jaringan tanaman berkayu; Vacin dan Went (VW) dan

Knudson C banyak digunakan untuk anggrek; medium Kao dan Michayluk

digunakan untuk kultur protoplas Cruciferae, Gramineae dan Leguminosae. Pada

dasarnya tidak ada satu macam medium kultur yang dapat memberikan

pertumbuhan optimal untuk semua sel, penggantian medium atau salah satu

komponen medium seringkali diperlukan untuk merespon setiap type

pertumbuhan dari satu macam eksplan. Studi literature sangat diperlukan untuk

mengembangkan atau memodifikasi medium kultur, modifikasi dari medium

kultur yang telah ada umumnya didasarkan pada trial and error.

Tujuan Instruksional Khusus

Setelah mengikuti kuliah ini diharapkan mahasiswa dapat menjelaskan

komponen dasar medium kultur jaringan, kebutuhan zat-zat anorganik dan

organik, substansi organik lamplek, bahan tambahan lain pada medium kultur

dan proses pembuatan medium .

Page 2: Medium Kultur Jaringan

Subpokok Bahasan : KOMPONEN DASAR MEDIUM KULTUR JARINGAN

Pendahuluan

Pada prinsipnya medium diberikan kepada sel-sel tanaman in vitro

dengan maksud memberikan nutrisi sesuai dengan kebutuhan sel-sel tanaman

tersebut secara alami sebagai tanaman utuh yang tumbuh dialam. Tumbuhan

dialam bebas bersifat autotrof, memerlukan nutrient sederhana yang terdapat

didalam tanah berupa garam-garam mineral dan air untuk meneruskan siklus

hidupnya. Hal ini dapat dipahami karena sebagian terbesar tubuh tumbuhan

tersusun atas unsur-unsur penyusun zat anorganik tersebut. Pada kultur in vitro

tumbuhan, untuk keperluan hidupnya, sel-sel pada eksplan juga memerlukan

nutrient yang komposisinya jauh lebih komplek karena eksplan sedikit banyak

telah kehilangan sifat autotrofnya.

Materi subpokok bahasan 1

Komponen dasar dari medium kultur dapat bermacam-macam, secara

umum medium kultur jaringan harus mengandung unsur-unsur sebagai berikut:

1. Garam-garam anorganik:

a. Unsur makro : C, H, O, N, S, P, K, Ca dan Mg

b. Unsur Mikro : Cl, B, Mo, Zn, Cu, Fe dan Co

2. Zat-zat organic

a. Gula

b. Myo-Inositol

c. Vitamin

d. Asam-asam amino

e. Zat pengatur tumbuh

3. Substansi organik komplek:

a. Air kelapa

b. Ekstrak buah-buahan

c. Ekstrak yeast

d. Pepton

e. Tripton

f. Hydrolisat kasein, dll

Page 3: Medium Kultur Jaringan

4. Bahan pemadat

a. Agar-agar

b. Gelrite

c. Phytagel

d. Sea Plaque Agarose, dll.

5. pH

6. Bahan tambahan lain misalnya arang aktip.

Kebutuhan zat-zat anorganik

Unsur makro.

Air merupakan zat terbanyak pada tubuh tumbuhan, oleh karena itu air

juga merupakan bagian terbesar didalam medium kultur. Air selain sebagai

bahan untuk membentuk material tubuh, juga sebagai medium untuk reaksi-

reaksi kimia dan fisika. Air juga berguna untuk transport dan distribusi zat-zat

yang terlarut didalamnya. Pada medium kultur jaringan digunakan air murni yang

sudah mengalami demineralisasi, deionisasi dan didestilasi dengan gelas dua

kali.

Kebutuhan garam-garam mineral didalam jaringan kurang lebih sama

dengan tanaman utuh. Garam-garam mineral merupakan gabungan unsur-unsur

esensial makro dan mikro. Konsentrasi optimum dari tiap-tiap komponen untuk

mencapai kecepatan pertumbuhan yang maksimal sangat bervariasi. Menurut

Gamborg dan Shylluk (1981) biasanya berkisar antara 25-60mM.

Unsur makro dibutuhkan dalam jumlah cukup besar, pada umumnya

diberikan dalam bentuk persenyawaan. George dan sherrington (1984)

menyebutkan beberapa persenyawaan makronutrien yang umum digunakan

pada medium kultur jaringan, antara lain: KNO3; NH4NO3; Ca(NO3).4H2O;

NaNO3; CaCl2. 2H2O; MgSO2. 7H2O; KCl; KH2PO4; NH4H2PO4; NaH2PO4. 2H2O;

Na2SO4; (NH4)2SO4; NH4Cl; K2SO4.

Nitrogen (N)

Nitrogen diberikan dalam bentuk persenyawaan yang bermacam-macam,

antara lain: KNO3; NH4NO3; Ca(NO3).4H2O; NaNO3; NH4H2PO4; (NH4)2SO4;

NH4Cl. Kebutuhan N terbesar adalah untuk menyusun asam-asam nukleat,

protein, sebagai koenzym atau persenyawaan lain yang mengandung N seperti

Page 4: Medium Kultur Jaringan

klorofil, alkaloid, derivat purin dan pirimidin dan beberapa hormon endogen.

Sumber nitrogen pada medium kultur adalah ion ammonium (NH4)+ dan nitrat

(NO3)-. Jumlah ion ammonium yang digunakan berkisar antara 2-8 mM,

sedangkan nitrat berkisar antara 25-40 mM. Pengambilan unsur nitrat

memerlukan pH rendah, sebaliknya pengambilan ammonium menyebabkan

pembebasan H+ sehingga medium menjadi asam. Medium Murashige dan Skoog

(MS) menyediakan nitrogen dalam bentuk garam NH4NO3, ini merupakan strategi

yang baik dan mempunyai keuntungan ganda, karena selain sumber N nya

lengkap juga dalam bentuk garam effeknya terhadap penurunan pH medium

berkurang (George dan Sherrington, 1984).

Fosfor (P)

Fosfor diberikan pada medium kultur jaringan dalam bentuk

persenyawaan KH2PO4 atau K2HPO4; NH4H2PO4; NaH2 PO4. Ion PO- total yang

diberikan pada medium bervariasi antara 0,5 - 20 mM/1. Unsur P didalam sel

diubah menjadi persenyawaan RNA dan DNA, zat-zat yang sangat penting yang

bertanggung jawab atas sifat-sifat keturunan. Unsur P diperlukan sebagai

aktifator ensim untuk memacu pertumbuhan pada jaringan meristematik.

Kelebihan unsur P dapat menghambat pertumbuhan eksplan, karena akan terjadi

persaingan penyerapan dengan unsur lain seperti seng (Zn), besi (Fe) dan

tembaga (Cu).

Kalium (K)

Kalium diberikan pada medium dalam bentuk KNO3; KH2PO4 atau

K2HPO4, KCl; dan K2SO4. Ion K+ total yang diberikan pada medium bervariasi

antara 1,837-25.18 mM/1. Unsur K sangat diperlukan untuk memacu

pembelahan sel, sintesa karbohidrat dan protein, pembuatan klorofil serta untuk

mereduksi nitrat (Kyte, 1983). Kalium berpengaruh pada hidratasi, menambah

atau mengurangi hidratasi pada misel seiiingga mempengaruhi keluar masuknya

nutrien ke dalam sel.

Sulfur (S)

Sulfur atau belerang diberikan pada medium dalam bentuk MgSO4. 7H2O;

(NH4)2SO4; K2SO4; FeSO4.7H2O; MnSO4.4H2O; ZnSO4. 7H2O; CuSO4. 5H2O.

Page 5: Medium Kultur Jaringan

Pemberian belerang berkisar antara 0,75 - 3 mM/1. Sulfur ada didalam beberapa

molekul protein dan koenzym. Memacu perkembangan akar, juga berguna untuk

ketahanan atau proteksi tubuh tumbuhan. Belerang diserap dalam bentuk SO4=,

antara lain dijadikan aneurin, biotin, persenyawaan asam amino yang ada

belerangnya misalnya, cystein, methionin.

Calcium (Ca)

Calcium atau kapur diberikan pada medium dalam bentuk Ca(NO3).

4H2O; CaCl2.2H2O; Ca3 (PO4)2. Pemberian ion Ca berkisar antara 1-3 mM/l.

Pemakaian Ca-nitrat ada kelemahannya karena sangat higroskopis, sehingga

didalam wadahnya seringkali (dijumpai kristalnya berair. Sebaiknya Ca-nitrat

dibuat larutan stok dan disimpan didalam kulkas. Ca-fosfat juga ada

kelemahannya yaitu tidak mudah larut. Untuk melarutkannya, sejumlah tertentu

Ca-fosfat dimasukan kedalam Erlenmeyer 50 ml, kemudian diberi beberapa tetes

HCl 0,1 N campuran ini digojok sambil dipanasi sampai larut (tampak jemih).

Calcium diperlukan untuk pembentukan dinding primitive, sebagai Ca-

pectat yaitu bagian integral dari dinding sel, penting sebagai kation selular dan

kofaktor enzym. Calcium mempengaruhi hidratasi, permeabilitas dan penyerapan

nutrient. Calcium juga mempengaruhi tingginya pH, menetralisir racun, misalnya

pada asam oksalat. Asam oksalat dengan Ca akan menjadi Ca-oksalat

berbentuk kristal dan diisolasi atau dimumifikasikan ikklam sel tertentu menjadi

sel-sel kristal.

Magnesium (Mg)

Magnesium terutama diberikan pada medium dalam bentuk MgSO4.

7H2O. Magnesium diperlukan sebagai elemen utama dalam pembentukan

klorofil, berperan penting sebagai aktivator ensim terutama dalam proses

fosforilasi dan sintesis protein dengan cara membentuk komplek ensim-substrat.

Unsur mikro

Unsur hara mikro adalah unsur yang diperlukan dalam jumlah sedikit.

Fungsinya belum diketahui secara pasti, tetapi tidak adanya zat-zat ini dapat

menyebabkan kelainan pertumbuhan. Air dan bahan kimia yang tingkat

kemurniannya rendah seringkali terkontaminasi oleh unsur hara mikro. Bentuk

Page 6: Medium Kultur Jaringan

persenyawaan hara mikro yang umum digunakan pada beberapa medium kultur

menurut George dan Sherrington (1984) adalah: MnSO4.4H2O; ZnSO4. 7H2O;

H3BO3; KI; CuSO4. 5H2O; NaMoO4. 2H2O; CoCl2. 6H2O; FeCl3. 6H2O; Fe III

citrate; FeSO4.7H2O; NaFeEDTA; Na2EDTA. 2H2O; Fe(SO4)3; Fe III tartrate.

Besi (Fe)

Besi diperlukan dalam jumlah sedikit lebih banyak daripada unsur mikro

yang lain, diberikan dalam bentuk chelat. Pemberian Fe bersama-sama dengan

NaEDTA dimaksudkan agar besi tetap pada jangkauan pH yang luas dalam

jangka waktu yang lama sehingga dapat diserap oleh jaringan tanaman. Fe

berperan penting dalam sintesis klorofll, konfersi energi pada fotosintesis dan

respirasi dengan melakukan reduksi oksidasi, bagian dari sitokrom. Besi

diberikan pada medium kultur jaringan berupa FeCl3. 6H2O; Fe III citrate;

FeSO4.7H2O; NaFeEDTA 2H2O; Fe(SO4)3; Fe III tartrate.

Boron (B)

Boron diberikan pada medium kultur sebagai asam borak (boric acid,

H3BO3). Berperan dalam translokasi karbohidrat, juga terlibat dalam difsrensiasi

seluler dan perkembangan. Ikatan boron organis memungkinkan adanya

diferensiasi dan penyusunan struktur halus dari dinding sel sehingga

memudahkan transport karbohidrat dan penyerapan ion kedalam sel; sebagai

aktifator dan inaktifator bagi zat pengatur tumbuh. Kalau boron kurang zat

pengatur tumbuh menjadi terlalu banyak sehingga menghambat pertumbuhan.

Molybdenum (Mo)

Molybdenum diberikan pada medium sebagai sodium molybdat

(Na2MoO4. 2H2O) berpartisipasi pada konfersi nitrogen ke ammonia dan fiksasi

nitrogen, ikut dalam metabolisme protein, sintesis asam askorbat, kofaktor enzim.

Manganese (Mn)

Manganese merupakan elemen esensial yang terdapat pada membran

kloroplas, berperan sebagai aktifator ensim dengan bertindak sebagai perantara

pada proses fosforilasi atau sebagai gugus redok Mn++. Bahan pembentuk klorofil

dan aktip dalam fotosintesa, metabolisme protein dan pembentukan vitamin C.

Page 7: Medium Kultur Jaringan

Pada medium kultur diberikan dalam bentuk MnSO4.

Cobalt (Co)

Cobalt merupakan elemen dari molekul vitamin B komplek, esensial untuk

fiksasi nitrogen. Pada medium kultur jaringan diberikan dalam bentuk

persenyawaan Cobalt Oiloride (CoCl2).

Zincum (Zn)

Zincum berperan sebagai aktifator ensim, penyusun khlorofil, pemacu

pembentukan zat pengatur tumbuh terutama IAA. Pada medium kultur jaringan

diberikan dalam bentuk one sulfate (ZnSO4).

Cuprum (Cu)

Cuprum merupakan bagian dari ensim, Cu bereaksi menjadi komponen

phenolase, lactase dan askorbat oksidase. Ikut ambil bagian dalam proses

fotosintesis dan reduksi nitrit. Cuprum diberikan pada medium kultur jaringan

dalam bentuk Cupric sulfate (CuSO4 5H20).

Chlorine (Cl)

Chlorine sebagai ion berpengaruh terhadap aktifitas ensim, memacu

proses fotosintesis. Chlorine diberikan pada medium kultur jaringan berupa

calcium chloride (CaCl2)

Kebutuhan zat-zat organik

Zat-zat organik adalah persenyawaan yang mengandung karbon,

ditambahkan pada medium kultur jaringan berupa gula, myo-Inositol, vitamin,

asam-asam amino dan zat pengatur tumbuh. Zat-zat organik tersebut biasanya

tidak diberikan pada tanaman karena tanaman dapat mensintesis sendiri, tetapi

pada kultur in vitro, karena eksplan yang digunakan umumnya berukuran sangat

kecil dan tidak marnpu mensintesis sendiri semua zat-zat organik tersebut, maka

zat-zat organik harus ditambahkan pada medium.

Gula

Tumbuhan dialam bebas mencukupi kebutuhan gula dengan mengasimilasi CO2

Page 8: Medium Kultur Jaringan

pada proses fotosintesa, dengan pertolongan klorofil dan sinar matahari,

dijadikan glucose kemudian dijadikan pati, selulose dan persenyawaan-

persenyawaan lain. Pada kultur in vitro, sel dan jaringan tumbuhan belum

sempurna dalam melakukan asimilasi fotoautotrof, sehingga diperlukan gula

sebagai sumber karbon dan enersi. Selain sebagai sumber enersi bagi sel dan

jaringan, gula juga berfungsi sebagai penjaga keseimbangan tekanan osmotik

potensial didalam medium. Gula pada umumnya diberikan pada medium kultur

berupa sukrosa atau komponen-komponennya seperti monosakarida glukosa

atau fruktosa. Sukrosa pada medium kultur ditambahkan sebanyak 30 gr/l.

Glukosa atau D-glukosa biasanya ditambahkan dengan konsentrasi 20 - 30 gr/l,

tergantung dari jenis eksplan. Sukrosa ternyata lebih berpengaruh dalam

perkembangan kalus, sedangkan pengaruhnya terhadap organogenesis belum

dapat dipastikan (George dan Sherrington, 1984). Pada kultur mikrospora

beberapa spesies tanaman digunakan maltosa, maltosa dihidrolisis lebih lambat

dibandingkan dengan sukrosa, ini memberi pengaruh yang lebih baik pada

mikrospora yaitu dapat memacu embryogenesis (Indrianto et al. 1999).

Myo-Inositol

Myo-Inositol ditambahkan pada medium untuk membantu diferensiasi dan

pertumbuhan jaringan. Myo-Inositol ikut serta dalam beberapa reaksi metabolik

penting yang berhubungan dengan pembelahan sel. Myo-Inositol merupakan

perantara pada perubahan glukosa menjadi asam galakturonat juga sebagai

prazat untuk pektin dan penyusun dinding sel.

Vitamin

Vitamin ditambahkan pada medium untuk mempercepat pertumbuhan,

diferensiasi kalus. Vitamin berfungsi sebagai kofaktor atau bagian dari molekul

kofaktor dari reaksi-reaksi ensimatis penting, vitamin juga berfungsi protektif.

Seperti halnya zat pengatur tumbuh, vitamin juga mempengaruhi (menstimulasi)

inisiasi, pertumbuhan dan perkembangan akar. George dan Sherrington (1984)

memasukan beberapa macam vitamin yang umum digunakan pada berbagai

medium dasar, antara lain: Thiamin-HCl, Nicotinic acid, Pyridoxin-HCl, Ca D-

panthothenate, Folic acid, Choline chloride, Riboflavin, yang kesemuanya

merupakan anggota dari vitamin B kompleks. Ascorbic acid dan adenin juga

Page 9: Medium Kultur Jaringan

sering ditambahkan pada medium. Vitamin labil terhadap pemanasan, dianjurkan

untuk selalu menggunakan filter steril jika akan ditambahkan pada medium.

Thiamin merupakan vitamin yang esensial terdapat pada hampir semua

medium kultur jaringan tumbuhan, cenderung mempercepat pembelahan sel

pada meristem akar tetapi tidak berpengaruh terhadap pemanjangan sel.

Thiamin merupakan bagian prostetik yang terdapat didalam sel, berperan

sebagai koensim dalam reaksi yang menghasilkan enersi dari karbohidrat dan

memindahkan enersi. Thiamin diberikan dalam jumlah yang bervariasi dari kira-

kira 0,1 sampai 30 mg/l (Doods dan Roberts, 1983).

Nicotinic acid (niacin) penting dalam reaksi-reaksi ensimatis disamping

peranannya sebagai prekursor dari beberapa alkaloid. Ascorbic acid sering

ditambahkan pada medium, terutama untuk mencegah terjadinya pencoklatan

pada permukaan irisan jaringan yang disebabkan karena terjadinya reaksi

oksidasi senyawa polyphenol menjadi quinon yang berwarna coklat, vitamin disini

berfungsi sebagai antioksidan.

Asam-asam amino

Asam amino merupakan sumber N organik , penyusun protein dan asam

nukleat, lebih cepat diambil oleh sel dan jaringan tanaman dari pada N anorganik

didalam medium kultur jaringan. Adapun asam amino yang umum ditambahkan

pada medium adalah: Glutamine, Glycine, L-Cyteine, L-Arginine, L-Aspartic acid,

L-Methionine.

Zat pengatur tumbuh

Selain nutrisi, zat pengatur tumbuh sangat diperlukan sebagai komponen

medium bagi pertumbuhan, perkembangan dan diferensiasi. Zat pengatur

tumbuh aktif pada konsentrasi rendah dan diproduksi didalam tubuh tanaman itu

sendiri (endogen). Untuk keperluan kultur jaringan telah dibuat zat pengatur

tumbuh sintetik, tanpa zat pengatur tumbuh pertumbuhan eksplan akan

terhambat bahkan mungkin tidak tumbuh sama sekali. Zat pengatur tumbuh

dikelompokan dalam beberapa grup: Auksin, Sitokinin, Gibberellin, Abscisic acid,

dan Ethylene.

Page 10: Medium Kultur Jaringan

Auksin

Indole-3-acetic acid (IAA) merupakan auksin alamiah yang terdapat pada

sebagian besar tumbuhan. Disintesis dari tryptophane terutama di primordia

daun, daun muda dan pada kecambah. IAA ditransport dari sel ke sel dengan

arah basipetal (dari pucuk ke akar). IAA berperan dalam mempengaruhi

pemanjangan sel; pembelahan sel; diferensiasi jaringan faskuler; inisiasi

pembentukan akar; mempengaruhi dominasi apikal; zona absisi pada daun dan

buah; pembungaan; pemasakan buah, dll.

IAA mudah larut dalam alkohol. Penggunaan IAA pada medium kultur

kerap kali kurang menguntungkan karena mudah rusak oleh cahaya, oksidasi

ensimatik dan pemanasan pada saat proses sterilisasi dengan autoclave.

Penggunaan auksin sintetik lebih menguntungkan karena lebih stabil. Auksin

sintetik yang umum digunakan pada medium adalah: 2,4-dichlorophenoxyacetic

acid (2,4-D); 1-naphthaleneacetic acid (NAA) dan indole-3-butyric acid (IBA).

Beberapa persenyawaan seperti dicamba (3,6-dichloro-O-anisic acid) dan

picloram (4-amino-3,5,6-trichloro-2-pyridinecarboxilic acid) pada konsentrasi

tinggi merupakan herbisida, digunakan sebagai auksin substitusi.

Kultur in vitro tumbuhan yang pada mulanya memerlukan auksin eksogen

untuk pertumbuhannya, secara gradual atau bahkan secara tiba-tiba dapat hilang

dan tidak memerlukan auksin lagi, hal yang demikian disebut sebagai habituasi

terhadap auksin. Penggunaan auksin secara tunggal pada umumnya sudah

cukup mampu untuk menginduksi pembentukan dan pertumbuhan kalus, tetapi

untuk beberapa tanaman yang rekalsitran akan lebih membantu jika

menggunakan lebih dari satu jenis auksin secara simultan. Pada kultur jaringan

tanaman monokotil, terutama rumput-rumputan dan palem, juga pada kultur in

vitro umbi akar wortel, memerlukan auksin sintetik seperti 2,4-D dengan dosis

yang cukup tinggi. Penghilangan atau pengurangan kadar auksin pada sub kultur

berikutnya dapat memacu produksi embrio somatik atau organ adventiv.

Pertumbuhan kultur juga dapat dipacu dengan penambahan substansi yang

dapat mengatur tingkatan IAA endogen misalnya, dopamine dapat menghambat

aktifitas IAA oksidase sehingga tidak terjadi oksidasi terhadap IAA, akibatnya

pertumbuhan jaringan dan organ pada kultur in vitro menjadi lebih baik.

Penghambat sintesis auksin seperti 5-hydroxy-nitrobenzyl bromide (HNB) dan 7-

azaindole memacu embryogenesis somatik pada kultur kalus citrus yang telah

Page 11: Medium Kultur Jaringan

mengalami habituasi.

Sitokinin

Sitokinin adalah derivat dari adenin, kinetin (6-furfurylaminopurin) dan

zeatin adalah sitokinin alami yang umum digunakan secara meluas pada medium

kultur. Sitokinin disintesis melalui modifikasi biokimia dari adenin, terjadi pada

ujung akar dan biji yang tumbuh. Kebalikan dari auksin, sitokinin ditransport

melalui xylem dari akar ke pucuk. Sitokinin hanya aktip jika ada auksin,

pemberian sitokinin bersama auksin pada medium kultur dapat memacu

pembelahan sel dan morfogenesis. Sitokinin mempengaruhi transport auksin,

pertumbuhan kuncup lateral (mematahkan dominasi apikal), perkembangan

daun, menghambat proses penuaan daun dan mempengaruhi perkembangan

kloroplas. Sitokinin sintetik seperti N6-benzylaminopurine (BAP) lebih sering

digunakan pada medium kultur jaringan.

Phenylurea, substansi aktip yang terdapat pada air kelapa mempunyai

efek yang sama dengan zeatin, penggunaannya memerlukan konsentrasi yang

lebih tinggi. Thidiazuron (N-phenyl-N-l,2,3-thiazol-5-ylurea), yang secara

komersial digunakan sebagai defoliant, karena kemampuannya untuk

menstimulasi produksi ethylene, dapat digunakan untuk memacu pembentukan

dan proliferasi tunas in vitro. Substansi lain yang mempunyai aktifitas seperti

sitokinin adalah endosperm cair pada kecambah jagung.

Diferensiasi selular dan morfogenesis in vitro terutama dikendalikan oleh

interaksi antara konsentrasi auksin dan sitokinin yang diberikan pada medium

kultur. Manipulasi rasio auksin: sitokinin dapat mempengaruhi organogenesis,

pada perbandingan auksin/sitokinin tinggi memacu pembentukan akar,

perbandingan yang sebaliknya akan memacu pembentukan tunas. Jika

perbandingan auksin sitokinin seimbang hanya terbentuk kalus.

Page 12: Medium Kultur Jaringan

Gambar 3.1. Efek auksin + sitokinin (George dan Sherrington, 1984)

Ada beberapa perkecualian:

1. Proliferasi tunas aksiler pada beberapa spesies tanaman dapat dipacu

dengan auksin bersama sitokinin.

2. Induksi kalus pada beberapa monokotil dapat dipacu pada medium yang

ditambahkan auksin dengan konsentrasi tinggi tanpa sitokinin.

3. Morfogenesis in vitro pada monokotil dipacu pada medium dengan auksin

konsentrasi rendah atau tanpa auksin.

Gibberellin (GA)

Pada 1926 Kurasawa mendapatkan kecambah padi yang tumbuh

abnormal karena terinfeksi oleh sejenis jamur Gibberella fujikuroy. Substansi

yang menyebabkan pertumbuhan seddling padi menjadi sangat cepat (abnormal)

tadi diketahui sebagai gibberelic acid (GA3). Gibberellin merupakan zat pengatur

tumbuh yang dalam bentuk larutan pada temperatur tinggi mudah kehilangan

sifatnya sebagai zat pengatur tumbuh. Gibberellin merupakan keluarga

persenyawaan yang didasarkan pada struktur entgibberellane. Ada 34 gibberellin

Page 13: Medium Kultur Jaringan

yang telah diidentifikasi secara kimia, beberapa diantaranya ditemukan pada

embryo dimana dapat memicu produksi alfa amilase yang dapat mengubah

cadangan makanan pada biji menjadi gula sehingga dapat digunakan oleh

embryo untuk pertumbuhannya. Gibberellin disintesis dari asam mevalonat pada

jaringan muda dari tunas dan biji yang sedang berkecambah, ditransport di

dalam xylem dan phloem. Gibberellin berpengaruh pada pertumbuhan batang,

pembesaran dan pembelahan sel, induksi perkecambahan biji, produksi ensim

selama perkecambahan, pembentukan bunga. Seperti halnya auksin, gibberellin

juga dapat memacu pembentukan akar, George dan Sherrington (1984)

mengatakan bahwa pacuan pembentukan akar dapat terjadi karena gibberellin

dapat menyebabkan peningkatan jumlah auksin endogen. Pada medium kultur

yang biasa digunakan adalah GA3.

Abscisic acid (ABA)

Abscisic acid (ABA) adalah persenyawaan tunggal dengan berat molekul

264,31, larut dalam NaHCO3 cair, kloroform, aceton dan ether. ABA disintesis

dari asam mevalonat pada daun-daun tua terutama sebagai respon terhadap

stres air (kekeringan). ABA ditransport dari daun melalui phloem, ABA dapat

bergerak ke akar didalam phloem dan kemudian kembali ke pucuk melalui xylem.

ABA berperan pada penutupan stomata, transport fotosintat kearah biji-biji yang

sedang tumbuh. Pada kultur in vitro tumbuhan, ABA digunakan untuk

menginduksi embryogenesis mikrospora, ABA juga dapat menghambat proses

perkecambahan yang terlalu dini pada embryo somatik.

Ethylene

Ethylene adalah zat pengatur tumbuh yang berbentuk gas, disintesis dari

methionine didalam berbagai jaringan tumbuhan sebagai respon terhadap stres.

Pada umumnya gas ethylene disintesis pada jaringan-jaringan yang mengalami

senescence atau yang mengalami penuaan. Ethylene bergerak secara berdifusi

dari tempat sintesisnya. Perananya adalah dalam membebaskan dormansi,

diferensiasi dan pertumbuhan tunas, pembentukan akar adventiv, pemasakan

buah, induksi pembungaan dll. Ethylene jarang dipergunakan pada kultur in vitro.

Penggunaan ethylen inhibitor seperti silver nitrate atau sulfat (ZnSO4), cobalt

atau nickel chloride (CoCl2) dan asam salisilat pada medium kultur dapat

Page 14: Medium Kultur Jaringan

iraeningkatkan regenerasi pucuk dan produksi embryo somatik, tetapi hasilnya

sering kali koetradiktif. Ethylen dapat mempercepat perusakan sitokinin dan

menstimulasi perakaran pada kultur in vitro.

Zat pengatur tumbuh yang umum digunakan pada kultur jaringan

Zat pengatur tumbuh Singkatan Berat Molekul

Abscisic acid

Indole-3-acetic acid

Naphthaleneacetic acid

2,4-Dicholorophenoxyacetic

Indole-3-butyric acid

6-Furfurylaminopurine

6-Benzyl-aminopurine

N6(Δ2-isopentenyl)-adenine

Trans-6-(4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl)

amino purine

Gibberelic acid

ABA

IAA

NAA

2,4-D

IBA

Kinetin

BA

2Ip

Zeatin

GA3

264,3

175,2

186,2

221,04

203,2

215,2

225,2

203,3

219,2

346,4

Sabstansi organik komplek

Substansi organik komplek biasanya belum dikenal benar isi

komposisinya, termasuk didalamnya pepton, tripton, hydrolisat casein, yeast

ekstrak, malt ekstrak, dan bermacam-macam tanaman seperti, air kelapa,

endosperm jagung, ekstrak pisang, tomat, kentang, jeruk, nanas dll. Substansi-

substansi komplek ini jika digunakan terlalu tinggi dapat merugikan pertumbuhan

sel, disarankan untuk melakukan pengujian dahulu dengan interval 1- 5 g/1,

untuk menetapkan pengaruhnya terhadap pertumbuhan. Jumlah air kelapa yang

biasanya ditambahkan pada medium adalah 2-15 % v/v. Substansi organik

kompleks ini kelemahannya tidak konsisten kadarnya dan tidak diketahui dengan

pasti komposisinya.

pH medium

pH merupakan simbol dari derajat keasaman atau kebasaan dari larutan

Page 15: Medium Kultur Jaringan

yang ditunjukan dengan konsentrasi ion hidrogen. pH tertentu diperlukan untuk

pertumbuhan jaringan tanaman agar tidak mengganggu fungsi membran sel dan

sitoplasma. pH yang diperlukan pada medium kultur biasanya berkisar antara 4,6

-5,8. Pengaturan pH medium dilakukan dengan menggunakan sodium hydroxyde

(1M NaOH), digunakan untuk menaikan pH medium (menjadi lebih alkalin, basa)

dan hydrochloric acid (1M HC1), untuk menurunkan menjadi lebih asam. pH

medium harus dipertahankan konstan selama kultur berlangsung karena akan

mempengaruhi ketersediaan nutrien yang dapat diserap oleh sel dan jaringan

tanaman untuk pertumbuhannya. Ada suatu persenyawaan komplek yang

mampu membuat pH suatu medium tetap pada jangkauan tertentu, misalnya besi

yang berikatan dengan chelat. KH2PO4 juga dapat berfungsi sebagai buffer.

pH juga penting pada proses embryogenesis somatik pada kultur umbi

akar wortel, stadium preglobular embryo dapat dipertahankan dan ditingkatkan

jumlahnya pada medium dengan pH dibawah 4,5. Jika pH dinaikkan, embryo

somatik melanjutkan pertumbuhannya melalui tahapan-tahapan yang normal

seperti pada embryo zygotik, yaitu globular, jantung, torpedo dan cotyledonary

(atau equivalen dengan system yang berlaku pada monokotil).

Bahan pemadat (Gelling agent) Gelling agent digunakan untuk memadatkan medium, bahan pemadat

yang sering digunakan pada medium adalah agar-agar (7-10 g/l), bahan pemadat

lain (Jarang digunakan) adalah gelrite, gelrite lebih bening dari agar-agar.

Pemakaian gelrite juga lebih sedikit untuk mencapai kepadatan yang sama

dengan agar, yaitu 2 g/l. Agarose juga sering digunakan untuk kultur protoplas

dan mikrospora. Penggunaan bahan pemadat ini megandung banyak

kelemahan:

1. Hanya sebagian eksplan yang kontak dengan medium

2. Terjadi gradient nutrisi yang tidak sama

3. Mobilitas hara menjadi kurang baik

4. Terjadi akumulasi zat-zat toksik yang dikeluarkan oleh eksplan.

Beberapa macam medium dasar Ada beberapa macam medium dasar, pada umumnya diberi nama sesuai

dengan nama penemunya. Beberapa diantaranya adalah:

Page 16: Medium Kultur Jaringan

1. Medium Murashige dan Skoog (MS) (1962), medium yang paling populer

digunakan untuk hampir semua macam tanaman, terutama tanaman

herbaceus. Medium ini paling banyak digunakan untuk kultur kalus dan

tunas, mempunyai konsentrasi garam-garam mineral yang tinggi, dan

senyawa N dalam bentuk ammonium dan nitrat.

2. Medium Gamborg (B5) (1968), digunakan untuk kultur suspensi sel

kedele, alfalfa dan legume lain.

3. Medium White (W63) (1963), merupakan medium dasar dengan

konsentrasi garam-garam mineral yang rendah, digunakan untuk kultur

akar.

4. Medium Vacint dan Went (VW) (1949), digunakan untuk kultur embryo

anggrek.

5. Medium Nitsch dan Nitsch, digunakan untuk kultur mikrospora dan kultur

sel pada tembakau

6. Medium N6, Chu (1978), digunakan untuk kultur jaringan serealia

terutama padi

7. Medium WPM (Lloyd dan McCown, 1980), untuk tanaman berkayu

8. Medium Kao dan Michayluk (1975) digunakan untuk kultur protoplas

Cruciferae, Grarmneae dan Leguminosae.

(George & Sherrington, 1984).

PEMBUATAN MEDIUM MURASHIGE & SKOOG

Untuk membuat medium kultur jaringan, kita harus menimbang setiap

komponen bahan kimia yang tertera pada resep. Langkah ini menjadi kurang

praktis, memakan banyak waktu dan mengurangi ketepatan. Selain itu timbangan

yang digunakan untuk menimbang sejumlah kecil bahan kimia kadang-kadang

tidak tersedia. Jalan keluar yang harus ditempuh adalah dengan membuat

larutan stok, setiap larutan stok dapat dipergunakan untuk 40, 50 dan bahkan

100 liter medium.

Larutan stok dibuat menjadi beberapa kelompok : stok besi (iron), stok

mikronutrien, stok vitamin dan stok hormon. Untuk makronutrien tidak dibuat

stok, jadi harus ditimbang satu persatu, tetapi jika diperlukan dapat dibuat larutan

stok secara tunggal, tidak dikelompokkan menjadi satu.

Page 17: Medium Kultur Jaringan

Yang perlu diperhatikan dalam pembuatan larutan stok adalah

kepekatannya. Larutan stok yang dibuat terlalu pekat akan mengalami

pengendapan sejalan dengan lama waktu penyimpanan, jika hal ini terjadi stok

harus dilarutkan dengan pemanasan terlebih dahulu sebelum digunakan. Larutan

stok harus disimpan dalam lemari es (kulkas). Larutan stok kadang-kadang

terkontaminasi, ditumbuhi mikroorganisme, stok yang terkontarninasi tidak dapat

dipergunakan lagi. Jadi kebersihan harus dijaga dan jangan membuat larutan

stok terlalu banyak.

Bahan dan alat:

1. Tabel formula dan bahan-bahan kimia untuk medium MS

2. Akuades

3. Aluminum foil, kertas timbang, tissue, kertas label

4. Timbangan analitik

5. Gelas piala 600 ml, 50 ml

6. Labu takar 100 ml, gelas ukur 100 ml

7. Erlenmeyer 1000 ml, 100 ml, 50 ml, atau botol kultur

8. Pipet, pengaduk

9. Magnetic stirrer dengan hot plate

10. pH meter

11. Autoclave, millipore filter, pompa fakum

I. Pembuatan larutan stok untuk medium MS

A. Stok besi (IRON): dalam 200 ml (40 kali konsentrasi)

1. Ditimbang 1.492 mg Na2EDTA dan 1.112 mg Fe2SO4.7H2O, kedua bahan

tersebut dilarutkan dalam kira-kira 75 ml akuades secara terpisah.

Larutan Fe2SO4.7H2O dipanaskan sampai hampir mendidih, kemudian

masukan larutan Na2EDTA sedikit demi sedikit sambil diaduk (dengan

magnetik stirrer). Kedua larutan akan tercampur, bening dan berwarna

kuning emas, jika larutan keruh, tambahkan beberapa tetes HCl 1 N lalu

dipanaskan. Biarkan mendingin pada suhu kamar, tambahkan akuades

sampai volume menjadi 200 ml. Masukan dalam botol khusus berwarna

gelap, beri label:

IRON. MS 40X, 5 ml/I

Page 18: Medium Kultur Jaringan

2. Simpan dalam kulkas, untuk membuat 1 liter medium MS, diperlukan 5 ml

larutan stok besi.

B. Stok Mikronutrien : dalam 100 ml (100 kali konsentrasi)

Mikronutrien diperlukan dalam jumlah sangat sedikit, oleh karena itu stok

mikronutrien dibuat dalam satu wadah sebagai stok campuran.

1. Ditimbang bahan-bahan kimia mikronutrien dengan timbangan analitik,

masing-masing

MnSO4. H2O 2.230 mg

ZnSO4.4 H2O 860 mg

H3BO3 620 mg

KI 83 mg

NaMoO4. 2H2O 25 mg

CuSO4. 5H2O 2,5 mg

CoCl2. 6H2O 2,5 mg

2. Masukan satu persatu dalam gelas piala 200 ml yang berisi akuades

kurang lebih 80 ml. Setiap kali memasukan bahan kimia harus segera

dilarutkan (diaduk), baru kemudian bahan berikutnya. Jangan

memasukan semua bahan kimia kemudian dilarutkan, akan terjadi

presipitat (endapan). Untuk melarutkan bisa dibantu dengan magnetik

stirrer.

3. Larutan yang sudah jadi ditambahkan akuades sampai volume menjadi

100 ml.

4. Masukan dalam botol khusus, tutup yang rapat, beri label:

MIKRO MS 100X, 1 ml/I.

5. Simpan dalam kulkas, untuk membuat medium MS 1 liter, diperlukan 1 ml

stok mikro

C. Stok Vitamin, dalam 200 ml (50 kali konsentrasi) Vitamin dapat dibuat dalam

satu wadah sebagai stok campuran

1. Ditimbang bahan-bahan dibawah ini:

Glycine 100 mg

Nicotinic acid 25 mg

Page 19: Medium Kultur Jaringan

Pyridoxine-HCl 25 mg

Thiamine-HCl 5 mg

2. Larutkan satu persatu dalam gelas piala 600 ml yang berisi akuades

(steril) kira-kira sebanyak 150ml.

3. Tambahkan akuades steril sampai volume mencapai 200 ml

4. Masukan dalam botol khusus, tutup yang rapat, beri label:

VITAMIN MS. 5OX, 4 ml/I

5. Simpan dalam kulkas, untuk membuat 1 liter medium MS, diperlukan 4 ml

stok vitamin.

D. Stok zat pengatur tumbuh

Zat pengatur tumbuh diperlukan dalam jumlah yang sangat terbatas.

Kelarutan dari masing-masing zat juga berbeda-beda. Biasanya stok zat

pengatur tumbuh dibuat dengan kepekatan 100-500 mg/l.

Siok Kinetin : 500 mg/l (500 ppm)

1. Timbang kinetin 50 mg, masukan dalam gelas piala 100 ml

2. Teteskan sedikit larutan HCl 1 N dan dipanaskan sebentar sampai larut,

sambil diaduk tambahkan 20 ml akuades panaskan sebentar sampai

larutan menjadi jernih.

3. Setelah dingin, masukan dalam labu takar 100 ml, tambahkan akuades

sampai volume menjadi 100 ml.

4. Pindahkan dalam erlenmeyer 100 ml atau wadah lain yang bersih, tutup

rapat, beri label:

KINETIN 500 ppm 5. Simpan dalam kulkas.

Stok IAA; NAA; 2,4-D; IBA : 500 mg/l (500 ppm)

1. Timbang IAA; NAA; 2,4-D dan IBA secara terpisah masing-masing

sebanyak 50 mg, masukan masing-masing bahan dalam gelas piala 100

ml.

2. Teteskan beberapa tetes larutan KOH 1 N dengan hati-hati panaskan

sampai larut benar (jernih), sambil diaduk tambahkan 20 ml akuades,

untuk mempercepat proses pelarutannya dapat dibantu dengan

Page 20: Medium Kultur Jaringan

pemanasan

3. Pindahkan dalam labu takar 100 ml, tambahkan akuades sampai volume

menjadi 100 ml.

4. Pindahkan dalam wadah stok, tutup yang rapat, beri label pada masing-

masing wadah :

IAA 500 ppm 2,4-D 500 ppm NAA 500 ppm IBA500 ppm.

5. Simpan dalam lemari es.

E. Myo-Inositol dan Sukrose: karena jumlahnya cukup banyak,tidak dibuat stok,

ditimbang setiap kali membuat media.

II. Pembuatan medium MS padat sebanyak 1 liter 1. Siapkan erlenmeyer 1000 ml yang berisi 500 ml akuades 2. Timbang setiap komponen bahan kimia makronutrien (sesuai dengan

label), larutkan satu persatu, untuk mempercepat pelarutan dapat dibantu

dengan magnetic stirrer. 3. Masukan 5 ml larutan stok IRON 4. Masukan 1 ml larutan stok MIKRONUTRIEN 5. Masukan 4 ml larutan stok VITAMIN 6. Masukan zat pengatur tumbuh (sesuai kebutuhan) 7. Timbang 100 mg Myo-Inositol, masukan dalam erlenmeyer dan larutkan 8. Timbang 30 g sukrose, masukan dalam erlenmeyer dan larutkan. 9. Tambahkan akuades sampai volume mencapai 1000 ml 10. Ukur pH menjadi 5,6 - 5,8 dengan penambahan HCl atau KOH. 11. Timbang 8 g agar-agar, masukan dalam erlenmeyer, panaskan (sambil

diaduk) sampai agar-agar larut. 12. Dalam keadaan masih cair, bagilah media kedalam botol kira-kira 40

ml/botol. 13. Tutup rapat dengan aluminum foil dan beri label sesuai dengan

perlakuan. 14. Masukan kedalam autoclave dan sterilisasi pada suhu 121°C selama 15

menit dengan tekanan 15 psi. 15. Setelah tekanan turun sampai 0, medium yang sudah steril segera

Page 21: Medium Kultur Jaringan

dikeluarkan dari autoclave, jangan menunggu sampai dingin didalam

autoclave. 16. Medium yang sudah steril disimpan dalam ruang penyimpanan.

Page 22: Medium Kultur Jaringan
Page 23: Medium Kultur Jaringan

Latihan soal-soal 1. Sebutkan dan jelaskan dengan singkat 5 komponen dasar dari medium

kultur!

2. Apa keunggulan medium Murashige dan Skoog !

3. Jelaskan apa kelemahan digunakannya medium agar!

4. Jelaskan peranan auksin dan sitokinin pada proses diferensiasi in vitro!

5. Jelas mengapa micronutrient harus dibuat larutan stok!

Petunjuk jawaban latihan soal-soal

1. Ingat komponen dasar medium kultur j aringan!

2. Ingat keunggulan medium MS

3. Ingat kelemahan medium agar!

4. Ingat peran auksin dan sitokinin!

5. Ingat pembuatan medium!