UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA FACULTAD DE CIENCIAS ESCUELA DE BIOLOGÍA DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA...

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UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA

FACULTAD DE CIENCIAS ESCUELA DE BIOLOGÍA

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA CELULAR Unidad Docente de Biología Celular

GUIA DE LABORATORIO DE

BIOLOGÍA CELULAR

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Caracas, Abril 2015

LABORATORIO DE BIOLOGÍA CELULAR Semestre I-2015

Profesores de la Materia:

Coordinador: Prof. María Valentina Salas

Unidad I: Prof. Carolina Bernal y Prof. Elizabeth Valdivieso. Prof. Invitada

Fracehuli Dagger

Unidad II: Prof. Luis Luis y Prof. Valentina Salas. Prof. Invitado Víctor Aguilar

Unidad III: Prof. Carlos Torrealba y Prof. Vincenza Cervino

Plan de evaluación:

Quiz 40% Informe 20% Examen 40%

Recomendaciones para la elaboración de los informes:

1) Introducción: Máximo 2 páginas. Debe contener los aspectos teóricos relevantes al ejercicio realizado y cuyo contenido puede ser parcialmente comentado en la discusión de los resultados obtenidos.

2) Materiales y Métodos: En forma esquemática presentar los protocolos desarrollados, así mismo, indicar los materiales utilizados.

3) Resultados: Todo el conjunto de resultados en la forma de presentación adecuada: Tablas, Gráficos, etc. Indicar con precisión las variables considerables, ejes de coordenadas, unidades, parámetros, constantes de importancia.

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4) Discusión: Discutir los resultados obtenidos. Comparar con los resultados esperados, basados en la bibliografía, considerar los posibles errores cometidos, sus fuentes.

5) Conclusiones y recomendaciones: Basadas en la discusión realizada. En forma esquemática.

6) Bibliografía: referencias consultadas para la elaboración del informe.

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UNIDAD I

EJERCICIO Ia ESTRUCTURA Y

FUNCIÓN CELULAR

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UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA FACULTAD DE CIENCIAS ESCUELA DE BIOLOGÍA DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA CELULAR Unidad Docente de Biología Celular

UNIDAD I EJERCICIO Ia

ESTRUCTURA Y FUNCION CELULAR

ULTRAESTRUCTURA CELULAR. IDENTIFICACIÓN DE ORGANELOS.

USO DEL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO

EJERCICIO 1-A. ESTRUCTURA Y FUNCION CELULAR Temas de discusión: Nociones de Microscopía Electrónica Ultraestructura celular Identificación de organelos y estructuras sub-celulares Introducción En el año de 1855 Carl Nageli sugirió que la célula estaba cubierta por una membrana limitante, la plasmática, en base al comportamiento de organismos tales como algas y hongos unicelulares en presencia de colorantes. Sin embargo, no fue sino con el advenimiento de la microscopia electrónica de transmisión que la membrana plasmática y estructuras sub-celulares fueron observadas y se produce el nacimiento de la biología celular. Previamente a la aparición de este microscopio, ello no fue posible por limitaciones en la resolución del microscopio de luz compuesto. En efecto, de acuerdo a la formula de Abbe (la cual es aplicable a cualquier tipo de radiación): el límite de resolución (d) o distancia que debe existir entre dos partículas para que se vean separadas, se expresa de la siguiente manera: Donde λ: longitud de onda de la radiación utilizada n: índice de refracción del medio. En el caso de aceite de inmersión n: 1,6 Sen α: seno del ángulo de apertura de la lente. Para 90º es 1 Al simplificar la formula de Abbe, para n: 1,6 y 90º, d: λ/2

d: 0,612 x λ n x Sen α

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Con base en la aproximación anterior, podemos observar que para una longitud de onda de 500 nm, d: 0,25 µm, lo cual significa que con esa longitud de onda correspondiente al espectro visible, sería imposible ver estructuras tan pequeñas como por ejemplo un lisosoma. La resolución de un microscopio de luz compuesto podría mejorarse si se emplea la radiación ultravioleta cercana (banda 340 a 400nm). Más aun, la óptica de cuarzo podría permitir el uso de radiación ultravioleta lejana (banda 200 a 340 nm), con lo cual se podría obtener un límite de resolución de aproximadamente 100 nm, aun insuficiente para observar membranas biológicas de 8 y 9 nm de grosor. La demostración de que un haz de electrones podría ser enfocado con un campo magnético simétrico revolucionó a la morfología, puesto que la construcción de los microscopios electrónicos hizo posible visualizar estructuras con un diámetro de hasta 2nm. Este último representa por ejemplo la separación entre dos membranas plasmáticas en una unión Brecha. Se aprovecha el comportamiento ondulatorio de los electrones acelerados por una diferencia de potencial. Así electrones acelerados por un campo de 100 kV tienen una longitud de onda de 0.0037 nm. La resolución teórica sería aproximadamente la mitad. Se podría resolver detalles atómicos puesto que los átomos en un sólido están separados por un orden de 0.2 nm. En la práctica, debido a los detalles inherentes a las técnicas de preparación del material y a los defectos en la construcción de las piezas polares, se producen aberraciones en las lentes bastante difíciles de resolver. Así que la resolución obtenida es de 10-20 Å para materiales biológicos.

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El microscopio electrónico de transmisión Es un instrumento que como lentes utiliza un campo magnético simétrico, capaz de enfocar un haz de electrones y producir una imagen aumentada. El empleo de tales lentes conlleva a que en la microscopia electrónica se usen casi los mismos principios teóricos que rigen la microscopia de luz, aun cuando ambos microscopios difieren marcadamente Estructura del microscopio electrónico de transmisión

Para facilitar la comprensión de la estructura de un M.E.T. puede considerarse que éste está formado por un sistema de iluminación y uno de formación de imagen. I.- Sistema de iluminación Está conformado por: el cañón de electrones y dos lentes condensadores.

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1.- Cañón o fuente de electrones. A diferencia del microscopio óptico, que utiliza como fuente de iluminación la luz, el microscopio electrónico utiliza un haz de electrones, cuya emisión se produce por calentamiento de un filamento de tungsteno (efecto termoiónico). Los electrones son acelerados por una diferencia de potencial aplicada entre el cátodo y un ánodo y concentrados por el cilindro de Wehnelt. También es posible obtener emisión de electrones de un material aplicando una diferencia de potencial (voltaje extractor) a una punta muy fina (por ejemplo un cristal de Wolframio); de tal manera que aparezca un campo eléctrico suficientemente alto que permita la tunelización de los electrones, los cuales son luego acelerados por la aplicación de un voltaje acelerador; este proceso se conoce como emisión por efecto de campo. En los microscopios electrónicos se utilizan lentes magnéticos, es decir, se hace uso del efecto del campo magnético (que aparece al pasar una corriente por un electroimán) sobre un electrón de carga q y velocidad v. La fuerza F que actúa sobre el electrón puede expresarse como F = q v x B. 2- Lentes condensadores. En general el microscopio electrónico posee dos lentes condensadoras. La primera se utiliza para disminuir el tamaño del haz de electrones proveniente del cañón con la finalidad de aumentar la resolución y evitar el bombardeo innecesario que podría dañar la muestra. La segunda condensadora se utiliza para variar el ángulo de irradiación y a la vez cambiar la luminosidad del campo de observación, evitando también el bombardeo excesivo de la muestra. 3- Cámara de la muestra. La cámara de la muestra es el dispositivo donde se coloca el material a observar y tiene instalada un sistema de carro que permite desplazarla en varias direcciones. Algunos microscopios están equipados con un goniómetro que permite inclinar y rotar la muestra.

II.- Sistema de formación de imagen. 1- Lente objetivo: Esta lente, al igual que en el microscopio de luz, es la más importante del sistema ya que es la encargada de formar la imagen y por tanto determina la resolución y el contraste de la misma a través del uso de una apertura; conocida como apertura de contraste. 2- Lente intermedia: Aumenta la imagen formada por el lente objetivo. Esta lente permite observar la información que está en el plano imagen ó la que está en el plano focal posterior de la lente objetiva, dependiendo del enfoque de la misma 3- Lente proyectora: Los microscopios electrónicos poseen varias lentes proyectoras, que permiten un aumento final de la imagen.

III.- Sistema de observación y registro de la imagen. La imagen se observa sobre una placa fluorescente, la cual transforma la energía de los electrones que chocan contra ella, en luz. En general,

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las pantallas son de color verde o amarillo, debido a la mayor sensibilidad del ojo humano hacia estos colores. El registro permanente de la imagen, se obtiene mediante el uso de placas fotográficas.

Un Microscopio electrónico tiene además los siguientes sistemas: I.- Sistema de evacuación: necesario obtener un alto vacío en el microscopio electrónico. El vacío deberá ser siempre superior a 1 x 10 -4 mbar Para la obtención de este alto vacío se utilizan dos sistemas de bombeo.

a) Bomba rotatoria que permite hacer un pre vacío; se obtiene así una presión de 10 -3mbar. b) Bomba difusora de aceite que permite obtener hasta 1 x 10 -6 mbar. c) El uso de una bomba criogénica de N 2 (l) permite obtener mejor nivel de vacío y evita contaminación de la muestra y la columna. Así mismo, se utiliza el llamado "dedo frío", alrededor del sitio de la muestra para evitar contaminación de la misma.

II.- Fuente de poder. Permite aplicar diferentes voltajes de aceleración. Preparación de las muestras para MET La técnica de preparación de muestras para su observación al Microscopio Electrónico de Transmisión (MET) conocida como Técnica del Corte Fino, puede ser dividida en cuatro pasos principales: fijación, deshidratación, infiltración e inclusión. Este proceso se inicia con la muestra hidratada y finaliza cuando la misma, libre de agua y preservada, es inmersa en una matriz de resina plástica. Esta penetra al interior de la célula sustituyendo al agua y le confiere suficiente firmeza para hacer posible la obtención de secciones (cortes) finas (50-120 nm). Los cortes obtenidos serán posteriormente contrastados y observados al MET. 1.-Fijación. La finalidad del proceso de fijación es la de preservar la ultraestructura biológica, lo más cercano a su estado original. El fijador ideal debe ser capaz de detener el proceso de degradación autolítico durante el tiempo de la fijación. Además debe proteger a la muestra de posibles alteraciones durante los procesos de inclusión, corte y observación al microscopio electrónico. En realidad, los fijadores podrían introducir artefactos durante el proceso de preparación de la muestra por lo que, frecuentemente, la selección de un protocolo particular de fijación depende de la capacidad para preservar un tipo estructural determinado. Históricamente, el tetróxido de osmio fue el primer fijador usado en microscopía electrónica (Claude y Fullan, 1946; Palade 1952), posteriormente fue utilizado el permanganato de potasio (Luft, 1956).

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En 1963 Sabatini y col. desarrollaron el protocolo estándar de la doble fijación (glutaraldehído-tetróxido de osmio), el cual es utilizado rutinariamente en todos los laboratorios de Microscopía electrónica. En dicho protocolo, una primera fijación se realiza con glutaraldehído, seguida de una segunda fijación (post-fijación) con tetróxido de osmio. A partir de entonces, se han desarrollado muchas modificaciones del procedimiento básico de dos pasos; por ejemplo, se han combinado glutaraldehído y paraformaldehído (aprox. 4%) permitiendo una penetración más rápida en los tejidos (Karnovsky, 1965) o se ha reducido el tetróxido de osmio con ferrocianuro con el fin de aumentar la preservación de las membranas y del glicógeno (Karnovsky, 1971). Para realizar una fijación satisfactoria se requieren las siguientes condiciones:

• Ajustar el pH y la osmolaridad de la solución fijadora de acuerdo a las necesidades del material. Se ha establecido una osmolaridad de aprox. 320 miliosmoles para la mayoría de los fluidos extracelulares de mamíferos. • Trabajar a 4º C.

El glutaraldehído es un dialdehído de 5 átomos de carbono con una estructura relativamente sencilla y con un peso molecular de 100,12. Su máximo atributo como fijador reside en su capacidad de establecer puentes de entrecruzamiento (Cross-link) con proteínas. El glutaraldehido enlaza a los grupos amino de las proteínas, específicamente el grupo aldehído reacciona con el grupo amino de la lisina ubicada en proteínas adyacentes originando los puentes de entrecruzamiento (Bozzola y Russell, 1992). El tetróxido de osmio tiene un peso molecular de 254,2 y reacciona primariamente con moléculas lípidicas. Se ha propuesto que las insaturaciones de los ácidos grasos son oxidados por el tetróxido de osmio, el cual, a su vez, es reducido a osmio metálico formando un precipitado -opaco- que añade densidad y contraste al tejido a observar (Bozzola y Russell, 1992). De este modo, actúa como fijador y contrastante del tejido aunque su efecto no es tan elevado en comparación a los contrastantes utilizados en la “coloración” de los cortes finos. Generalmente se prepara una solución de tetróxido de osmio al 2-4 % que se almacena a 4º C y protegida de la luz; de allí se toman las alícuotas necesarias para preparar la solución fijadora. 2.- Deshidratación. La deshidratación es el proceso de sustitución progresiva del agua de la muestra biológica por un líquido que actúa como solvente entre de la resina de inclusión (hidrofóbica). Los agentes de deshidratación más usados son el etanol y la acetona. Se pretende lograr el reemplazo del medio acuoso utilizando una serie de concentración ascendente del agente deshidratante. La serie comienza con una concentración de 30 o 50% seguida por 70, 90, 95 y 100% etanol o acetona. El etanol es utilizado más frecuentemente que

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la acetona como agente deshidratante debido a que la acetona anhidra tiene una mayor tendencia a absorber agua de la atmósfera y es un poderoso extractor de lípidos intracelulares. Luego se sustituye el etanol por óxido de polipropileno.

3.- Infiltración Para este paso, se hace necesario el reemplazo del agente deshidratante por un compuesto intermediario miscible con la resina que se utilizará para la inclusión. Por ejemplo, si se utilizó etanol para deshidratar y se desea incluir en Epón, debe emplearse un compuesto intermediario (óxido de propileno) ya que el etanol es poco miscible en dicha resina (ver adelante). Es importante resaltar que el óxido de propileno es un líquido altamente volátil y potencialmente carcinogénico. La infiltración de la resina al interior de la muestra se realiza aumentando gradualmente su concentración en una mezcla resina: compuesto intermediario (por ejemplo, Epón: óxido de propileno). 4.-Inclusión El proceso de inclusión propiamente dicho, consiste en la sustitución de la mezcla resina: compuesto intermediario por resina pura que polimerizará a

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60ºC durante 48 horas, proporcionando a la muestra el soporte físico necesario para la obtención de cortes finos (60-90 nm). Microscopio Electrónico de Barrido MEB Este instrumento permite observar la topografía de una muestra utilizando los electrones (e-) secundarios producidos por la interacción de un haz de e- de alta energía con la muestra. Un haz de e- se genera en la parte superior de la columna, por el calentamiento de un filamento metálico, 10 a 30 kV de voltaje de aceleración. El haz de e- primarios sigue su recorrido a través de la columna al vacio del microscopio, con el objeto de evitar la dispersión de e-. Los e- acelerados salen del cañón y se enfocan mediante las lentes condensadoras y objetiva, cuya función es reducir el haz de e- lo más pequeño posible para así tener mejor resolución. Con las bobinas deflectoras se barre este fino haz de e- sobre la muestra, punto por punto y línea por línea. Los instrumentos que dirigen las bobinas de barrido (que obligan al haz a barrer la muestra) son los mismos que dirigen la parte de colección de e- y que producen la imagen Cuando el haz incide sobre la muestra se producen muchas interacciones entre los e- del mismo haz y los átomos de la muestra. Puede haber e- que rebotan como las bolas de billar. Por otra parte la energía que pierden los e- al chocar con la muestra puede hacer que otros e- salgan despedidos (e- secundarios) y producir además rayos X y e- Auger, además de otros de menor relevancia. Los e- secundarios son los responsables en su mayoría de la imagen que se produce en el MEB. Los e- secundarios que generan la imagen son atraídos por un colector donde se aceleran y se dirigen al generador donde la energía cinética es convertida en puntos de mayor o menor lumosidad, es decir en luz visible. Esta luz es dirigida a un amplificador donde se convierte en señal eléctrica, la cual pasa a una pantalla de observación donde la imagen se forma por líneas y puntos por punto. También podemos adquirir la señal de rayos X que se produce cuando se desprenden e- de la muestra y se pueden realizar espectrografías de la composición de la muestra. La preparación de la muestra a observar contempla fijación con glutaraldehído y vapores de Osmio, deshidratación con alcohol y/o acetona y sometidas a secado por punto crítico. Luego se pueden metalizar antes de colocarlo en el MEB para su observación y análisis de imagen. Generalmente

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se recubre con oro o carbón, solo se requiere que sean conductoras. Para las muestras recubiertas con metales se utilizan altos voltajes, así que la longitud de onda de los e- más pequeña y hay mejor resolución. Para algunas muestras biológicas muy sensibles las muestras no tienen preparación adicional para su observación, se trabajan a bajos voltajes La resolución del MEB es de 10 nm y profundidad de foco 10 µm, mucho menor que el MET lo cual permite que se enfoque a la vez una gran parte de la muestra. También se obtiene una imagen de alta resolución de tal manera que las características más pequeñas de la muestra puedan ser examinadas con alta amplificación. La ventaja del MEB es que se pueden apreciar texturas y proporciona imágenes 3D al examinar la superficie de las muestras. Estructura de Microscopio Electrónico de Barrido (MEB) Objetivos de la práctica

Cañón de Electrones

Lente condensador

Bobina Deflectora

Lente Final

Muestra

Electrones de la muestra

Detector

Tubo Rayos C

Generador

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Al final del ejercicio, el estudiante debe ser capaz de: a. Describir en forma general las partes constituyentes de un microscopio

electrónico de transmisión y la formación de la imagen. b. Comprender las bases de la técnica de corte fino para el microscopio

electrónico de transmisión y técnicas especiales. c. Analizar en forma crítica el alcance de dichas técnicas. d. Identificar y describir la estructura y ultraestructura de una célula y de

los organelos que contiene. e. Establecer relaciones estructura- función.

Procedimiento: Cada grupo de laboratorio recibirá un cuaderno de práctica con 36 fotografías de Microscopía electrónica, para ser analizadas y discutidas durante el periodo de la práctica. El Informe a presentar deberá contener las respuestas solicitadas a continuación: Fotografía N° 1 Virus ¿Que son los virus? ¿Qué tamaño tienen? Relacione la ultraestructura que observa con sus componentes fundamentales y su actividad biológica. ¿Qué metodología se usó para observarlos? Recuadros A, B, C, D, E, G. Fotografías N° 2 y 3 Compare estas fotos de células procariotas ¿Hay diferencias ultraestructurales entre las bacterias Gram + y Gram-? Indique las diferencias y sus implicaciones, ¿Cómo se organiza el material genético en estas células? ¿Cuáles son las diferencias fundamentales con las células eucariotas? Fotografía N° 4 Describa las diferencias estructurales entre las células animales y vegetales. Cuál es la función de los cloroplastos. Identifique las estructuras en su interior. ¿Cómo está constituida la pared celular? Relacione la ultraestructura de los cloroplastos con la función que realizan. Fotografía N° 5, 6 y 7 ¿Cuáles son las estructuras que delimitan las células animales con el medio extracelular o con otras células? ¿A que se denomina glicocalix? ¿En qué se diferencia de la pared celular de las células vegetales? Describa la estructura subyacente al glicocalix en la foto 5 y 7. ¿A que corresponde? ¿Observa estructuras internas en los glóbulos rojos? ¿Qué técnica se utilizó para visualizar el estroma de los glóbulos rojos? ¿Cómo se obtiene el estroma? Fotografía N° 8 Se observa un núcleo interfásico. Cuáles son las características de un núcleo interfásico. Qué técnica de ME podría haber sido utilizada para observar el

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arreglo del DNA aislado (recuadro). ¿Cual estructura observa dentro del núcleo? ¿Observa cromosomas? Fotografía N° 9 Nucléolo. Describa brevemente su organización asociada a las funciones que realiza. ¿Observa Ud., membrana limitando el nucléolo? Fotografía N°10 Complejo del poro nuclear. Relacione la estructura del complejo del poro con la función que cumple. ¿Por qué se habla de envoltura nuclear? ¿Qué componentes están asociados a la membrana nuclear interna y qué papel desempeñan? ¿Cuál es la técnica que se utilizó para observar los detalles ultraestructurales del complejo del poro? (recuadro) Fotografía N° 11 Ribosomas. Relacione la función con la estructura de los ribosomas. Las micrografías muestran la relación entre la cantidad y disposición de los ribosomas y el tipo celular. ¿Están los ribosomas libres o asociados? Correlacione con la funcion celular. Fotografía N° 12 Aparato de golgi. Discuta la relación de la estructura del aparato de golgi con la función que realiza. Fotografía N° 13 Lisosomas. Describa los tipos de lisosomas que observa. ¿Cómo determinaría que se trata realmente de lisosomas? Fotografía N° 14 Retículo endoplasmático liso. Describa las funciones asociadas y ¿en qué tipos celulares es abundante? Fotografía N° 15 Peroxisomas. ¿Cómo distinguiría en una fotografía con ME de una célula entre peroxisomas y lisosomas primarios? Fotografía N° 16 Mitocondria. Realice un esquema de una mitocondria y ubique los componentes estructurales y la función asociada. ¿Qué le indicará la presencia de gran cantidad de mitocondrias en un tejido o célula? Explique. Fotografía N° 17 Gránulos de glicógeno y gotas de lípidos. Reconozca otras estructuras y organelos presentes. Haga un esquema. ¿Están presentes en todos los tipos celulares? ¿Cómo reconoce las gotas de lípidos? ¿Qué función realizan? Fotografía N° 18 Citoesqueleto. Microfilamentos de actina. ¿A que se denomina citoesqueleto? ¿Cuáles son sus componentes? ¿Qué técnica cree usted que se utilizó para evidenciar la presencia de actina en estas tres fotografías? ¿Cómo determinaría que esos filamentos son de actina? Fotografía N° 19

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Citoesqueleto. Microtúbulos. ¿Cuales estructuras celulares están compuestas fundamentalmente de Microtúbulos y cuáles son sus funciones? Compare la estructura de los cilios y flagelos. Fotografía N°20 Citoesqueleto. Filamentos intermedios. Describa una técnica de microscopía electrónica que le permitiría reconocer la presencia de filamentos intermedios en una célula. Investigue la importancia de los FI en determinar la presencia de tumores. Fotografía N° 21 y 22 Complejos de uniones. Haga un esquema de la estructura, composición y función de estos complejos de uniones. ¿Existen en todos los tipos celulares? Fotografía N° 23 Uniones “Gap” o comunicantes. ¿Qué otras estructuras subcelulares reconoce en esta micrografía? Describa la estructura y función de las uniones “gap”. Fotografía N° 24 y 25 Describa y compare morfológica y estructuralmente estas especializaciones apicales. ¿En cuales tejidos se encuentran? Compare con los flagelos de eucariotas inferiores (Leishmania, Leptomonas, Critidia) Fotografía N° 26 Fibroblasto. Describa los aspectos más relevantes de la ultraestructura de esta célula. Relaciónela con su función. Fotografía N° 27 Colágeno y fibras elásticas Haga un esquema. Diferencie entre colágeno y fibras elásticas. Fotografía N° 28 Macrófagos. Describa este tipo celular y mencione los componentes ultraestructurales relevantes a su función. Fotografía N° 29 Fibras musculares. En forma esquemática describa las diferencias ultraestructurales entre los tipos de fibras y asócialas con su función, ¿Dónde se encuentran? Fotografía N° 30 Músculo esquelético. Identifique triadas y su función. Fotografía N° 31 Músculo esquelético. Miofilamentos Fotografía N° 32 Músculo esquelético. Sarcómero, haga un esquema identificando componentes Fotografía N° 33

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Músculo esquelético. Fibras y miofibrillas, ¿Cómo se organizan? ¿A qué se denomina retículo sarcoplasmático? ¿Qué función tiene? ¿Donde se encuentra el núcleo? ¿Dónde se ubican y que aspecto tienen las mitocondrias? Explique brevemente. Fotografía N° 34 Músculo liso. ¿En qué tipos de órganos se encuentra? Esquematice las diferencias entre este tipo muscular y el esquelético. ¿Qué elementos del citoesqueleto están presentes en este tipo muscular? Investigue como se contrae este tipo muscular. Fotografía N° 35 y 36 Diferencias y semejanzas con el músculo estriado. Ubique las mitocondrias y explique la presencia de la gran cantidad de ellas. ¿Qué importancia tiene los discos intercalares?

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UNIDAD I

EJERCICIO Ib FRACCIONAMIENTO

CELULAR

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UNIDAD I EJERCICIO Ib

FRACCIONAMIENTO CELULAR Separación e identificación de fracciones provenientes de células hepáticas. Objetivos: Al concluir el ejercicio, el estudiante deberá ser capaz de: - Discutir acerca de la importancia de la compartamentalización celular en el funcionamiento de la célula. - Describir la técnica de fraccionamiento utilizada. - Explicar las razones para la realización de cada etapa de fraccionamiento en la forma indicada en la guía. - Discutir formas alternativas que permitan realizar un fraccionamiento celular. - Identificar una o varias de las fracciones obtenidas en base a los siguientes criterios:

a. Tipo de centrifugación usada b. Tiempo y velocidad de centrifugación c. Presencia o ausencia de la actividad de una enzima marcadora

- Analizar la validez de los criterios de pureza utilizados para evaluar las

fracciones. - Señalar aquellas funciones relacionadas a las estructuras presentes en

cada fracción. - Identificar algunas estructuras celulares aisladas.

Introducción Un fraccionamiento celular consiste en una serie de procedimientos que permitan:

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1) Romper la membrana plasmática de las células para liberar los

organelos e inclusiones al medio. 2) Separar los distintos componentes celulares de acuerdo a sus

características de peso, tamaño y forma. 3) Caracterizar las distintas fracciones separadas en base a las

propiedades, morfología y funciones de los organelos e inclusiones celulares.

El ejercicio se ha organizado en etapas que tienen en cuenta las anteriores

fases necesarias para el fraccionamiento y el análisis de las

microfotografías electrónicas.

Primera parte: Fraccionamiento celular – 1° etapa Separación y ruptura de células hepáticas. El llamado fraccionamiento celular consiste en la separación de los diferentes componentes (organelos e inclusiones) celulares. Se puede lograr, de una manera secuencial mediante la centrifugación diferencial o usando centrifugación en gradientes de densidad. Las fracciones obtenidas pueden ser procesadas para su observación al microscopio electrónico. Para separar los organelos e inclusiones celulares, es necesario destruir la integridad celular sin dañar las de las estructuras de interés. En el caso de células organizadas en tejidos, es necesario separar a las células en sí.

Las células se pueden romper en diversas formas: bien sea mediante el uso de un homogeneizador, que rompe las células mecánicamente o por medio de un choque osmótico, al colocar a las células en un medio que altere el equilibrio osmótico celular.

Un homogeneizador está constituido por un tubo de vidrio de paredes gruesas y boca ensanchada, dentro del cual se hace girar un bulbo cilíndrico de superficie pulida (teflón o vidrio esmerilado). Los tubos tienen capacidad variable con una luz de 0.08 a 0.15 mm (entre el bulbo central y las paredes del tubo). El tejido seleccionado para homogeneizar debe tener un tipo celular predominante y en lo posible blando y fácil de fragmentar.

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Materiales:

Cava con hielo Solución de NaCl 0.15 M.

2 placas de Petri 1 pipeta de 1 ml.

Inyectadora, Tubos de ensayos 1 homogeneizador.

Procedimiento:

1. Pesar las dos placas de Petri suministradas. 2. Exponer el hígado de rata. 3. Cortar trozos de tejido pertenecientes al borde de los lóbulos 4. Colocar los trozos de tejido en una de las cápsulas de Petri conteniendo solución salina. Debe tener entre 0,5 y 1.5 gramos de tejido, el peso óptimo es 1gr.

Nota: A partir de éste punto, todo debe ser trabajado en FRIO. Mantener el NaCl 0.15 M y la cápsula de Petri con el tejido en la cava. El proceso de homogeneización también debe ser realizado en frío, manteniendo el homogeneizador en el hielo. Asegúrese que no le caiga hielo al tejido, al homogeneizado o alguna de las fracciones.

5. Lavar con NaCl 0.15 M frío, con la ayuda de una inyectadora prefunda el tejido, introduzca la aguja de la inyectadora en el tejido y pase suavemente la solución salina fría. Repita hasta que la mayor parte del tejido tenga un color más blanco por eliminación de la sangre. 6. Eliminar los restos de la solución de lavado con sangre y agregar, a la placa con tejido, 1ml de NaCl 0.15 M frío. 7. Cortar el tejido en trozos muy pequeños (en frío) con la ayuda de una tijera pequeña. Consulte en caso de duda. 8. Introducir el tejido fragmentado en el homogeneizador. Lavar la placa de Petri con 1ml de NaCl 0.15 M y agregarlo al homogeneizador. 9. Homogeneizar con 8 a 10 golpes en frío. 10. Transferir el homogenato a un tubo de centrífuga plástico de 10 ml. 11. Lavar el homogeneizador con 1 ml de NaCl 0.15 M frío y agregarlo al homogenato. 12. Medir y anotar el volumen del homogenato obtenido. 13. Guardar (en frío) 0.5 ml en un tubo de ensayo pequeño y rotulado. 14. Mantenga el resto del homogenato en frío para separar las fracciones según el método que se le indique.

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Preguntas:

a- ¿Qué características del tipo celular utilizado pueden afectar la ruptura y la escogencia del método de ruptura?

b- ¿Qué propiedades de la solución en la cual se homogeneiza se deben controlar cuidadosamente? Explique.

c- ¿Qué ventajas presenta la zona del tejido hepático escogida?

d- ¿Cuál es la ventaja de eliminar al máximo la sangre del tejido?

e- Usted puede variar el tiempo y la intensidad de la homogeneización, ¿cómo cree que influirían dichas variaciones las fracciones por obtener?

Segunda parte: Fraccionamiento celular – 2° etapa

Separación de fracciones mediante centrifugación.

A. Centrifugación diferencial:

En éste método se realizan sucesivas centrifugaciones, con aceleración creciente y tiempo crecientes, a medida que se van obteniendo las fracciones. Las propiedades de un organelo o inclusión que determinan el tiempo y la aceleración de centrifugación (medida en g*) necesarios para sedimentarlos, son principalmente el tamaño (o peso) y la forma. La forma de los diversos organelos en suspensión es bastante similar, de modo que se puede asumir que se separan básicamente en función de las diferencias existentes en su tamaño.

*g: es la fuerza gravitacional que actúa sobre un gramo de masa a una distancia (en cm) del eje de rotación.

Materiales:

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3 tubos de centrífugación de 15 ml de capacidad. Cava con hielo Pipetas Pasteur 6 tubos de ensayo. Procedimiento: 1.- Tomar el resto del homogenato que se tiene en el tubo de centrífuga. 2.- Balancear dicho tubo con el de otro equipo con la ayuda del Preparador. 3.- Centrifugar a 5.000 xg durante 10 min. 4.- Obtendrá el sedimento 1 y el sobrenadante 1. Separar el sobrenadante 1 con una pipeta Pasteur. Medir el volumen del sedimento 1. 5.- Colocar el sobrenadante 1 en otro tubo de centrífuga. Identifíquelo. Balancear con el tubo de otro equipo con la ayuda del Preparador. 6.- Centrifugar a 10.000 xg durante 20 min. 7.- Observar el tubo. Obtendrá el sedimento 2 y el sobrenadante 2. 8.- Separar el sobrenadante 2 con pipeta Pasteur y medir su volumen en un tubo graduado. Medir el volumen del sedimento 2. 9.- Centrifugar a 16.000 xg durante 30 min. 10.- Observar el tubo. Obtendrá el sedimento 3 y el sobrenadante 3. 11.- Separar el sobrenadante 3 con pipeta Pasteur y medir su volumen en un tubo graduado. Medir el volumen del sedimento 3. 12.- Mantener todas las fracciones en frío. B- Centrifugación por gradiente discontinuo: Debido a las diferencias de tamaño de una población de un mismo organelo frecuentemente se encuentra, que algunas de las fracciones logradas mediante la técnica de centrifugación diferencial, está contaminada con otros organelos. Además, en una misma fracción pueden existir diferentes grupos de un mismo organelo, los cuales pueden distinguirse en base a una densidad algo diferente.

Para lograr una mayor purificación y la separación más efectiva de las diferentes Poblaciones de un organelo, es muy útil la técnica de centrifugación por gradientes de densidad, pudiendo ser de dos tipos: gradiente continuo y gradiente discontinuo. Para la preparación de un gradiente de densidades continuo, se mezclan de manera progresiva dos soluciones de concentraciones y densidades diferentes, de manera que en el tubo de centrífuga se produce una gradación continua de soluciones de mayor a menor densidad.

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El gradiente discontinuo, por su parte, puede servir para objetivos preparativos de separación de grandes cantidades de material o para mejorar la separación obtenida por una centrifugación diferencial. Esta constituido por soluciones de diferentes densidades y concentración, pero no mezcladas como en el caso anterior sino formando bloques de concentraciones, el límite entre una solución de una concentración y otra se denomina interfase. Materiales: Dos tubos de centrífuga de 40 ml. de capacidad 3 pipetas de 10 ml y 1 de 5 ml 25 ml de solución de sacarosa 45% 6 tubos de ensayo 25 ml de solución de sacarosa 30% Pipetas Pasteur 25 ml de solución de sacarosa 15% Procedimiento: 1.- Colocar los tubos de centrífuga en hielo en posición vertical. 2.- Introducir 10 ml. de sacarosa 45% en el fondo de cada tubo cuidando de no tocar las paredes. 3.- Agregar con otro pipeta 10 ml. de sacarosa 30%, teniendo cuidado de dejar correr la solución por las paredes del tubo, de manera que no se produzca mezcla con la solución subyacente. Haga el proceso lentamente. 4.- Agregar 10 ml. de sacarosa 15% de la misma forma en que agregó la anterior. Deje en reposo de 5 a 10 min. Observar las interfases formadas. Preguntas: a.- ¿En qué se basa la separación de partículas en un gradiente continuo y en uno discontinuo de densidades?. Explique las ventajas de cada uno.

b.- Compare las técnicas de centrifugación diferencial con las de centrifugación en gradiente (continuo y discontinuo). Discuta la aplicabilidad de cada método.

3° etapa. Determinación de la presencia de fosfatasa ácida.

En las fracciones obtenidas durante un fraccionamiento subcelular, se puede hacer el seguimiento de la fracción de interés mediante la determinación de la actividad enzimática de enzimas marcadoras, pudiéndose considerar que la fracción enriquecida en la actividad enzimática de interés es la que se encuentra enriquecida, a su vez, en el organelo que las contiene. Para que esta suposición sea válida, el

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análisis debe hacerse expresando la actividad enzimática como actividad enzimática específica. La presencia del organelo en la fracción que presenta la mayor actividad enzimática específica, puede corroborarse por microscopía electrónica. En los lisosomas se encuentra una gran diversidad de enzimas hidrolíticas cuyo pH óptimo se encuentra en intervalos de pH ácido (4.2 - 4.5). Entre estas enzimas, la fosfatasa ácida ha sido utilizada como enzima marcadora de la fracción lisosomal. Esta enzima cataliza el rompimiento hidrolítico de ésteres de ácido fosfórico. En la práctica se utilizará el p-nitrofenil-fosfato como sustrato artificial de la fosfatasa ácida, el producto de la hidrólisis de éste sustrato es el 4-nitrofenol, el cual presenta un fuerte color amarillo en solución alcalina. La actividad fosfatásica es directamente proporcional a la cantidad de p-nitrofenol liberado por unidad de tiempo. Materiales: Agua destilada Soluciones: Gradilla Buffer acetato 0.2 M, pH 4.6 3 – 4 tubos de Bausch and Lomb NaOH 0.5 M 10 tubos de ensayo pequeños ρ-nitrofenil fosfato 10 mM 10 pipetas de 1 ml Baño de María a 37 °C Procedimiento:

1. Mientras separa las fracciones por centrifugación diferencial, prepare una serie de tubos por duplicado, claramente identificados, para el homogenato total y cada una de las fracciones a obtener. Un blanco y un tubo con H2O destilada.

2. Añada a cada tubo 0.2 cc de agua destilada, 0.1 cc de la fracción respectiva y finalmente 0.4 cc de buffer acetato. Haga esto en el orden aquí indicado.

3. Colocar en baño de María a 37°C. Agitar suavemente. Esperar 1 min. 4. Añadir 0.1 cc de la solución de p-nitrofenil fosfato. Tome el tiempo

inicial. Incube por 30 min. 5. Pare la reacción con 3.2 ml de NaOH 0.5 M. 6. Leer a 405 nm.

Nota: Anote toda aquella observación que pudiese serle útil en el transcurso del trabajo y para la presentación de los resultados.

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1.- Determine la actividad enzimática específica (AEE) en cada fracción. Los miligramos de proteína en cada una de las fracciones se determinará por el método de Lowry, la cual debe llevarse a cabo paralelamente a la determinación de la actividad enzimática. 2.- Compare la AEE en las diferentes fracciones. ¿En cuál de sus fracciones, concluye usted, ha obtenido mayor concentración de lisosomas?. 3.- Elabore una tabla con los valores obtenidos con el Lowry. En la tabla de be incluir valor de la dilución realizada, la densidad óptica obtenida y la concentración de proteína en cada fracción. 4.- Todo cálculo y resultado debe ser incluido en el informe en forma explícita. Preguntas: a.- ¿Cuál es la razón por la cual se resuspenden los sedimentos en el buffer para la enzima?. b.- ¿Qué entiende por AEE? c.- ¿Qué tipos de enzimas existen en los lisosomas? d.- ¿Qué entiende por enzima marcadora, cuáles son las ventajas y desventajas de su uso para estimar la pureza de una fracción celular? e.- ¿Cuál es la importancia del control de la temperatura durante el proceso de fraccionamiento? f.- Mencione otros métodos de ruptura celular. ¿Variarán los resultados si se cambia el método de ruptura? Bibliografía:

1. Molecular Biology of The Cell. Bruce Alberts, Dennis Bray, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, James, D. Watson. Garland Publishing, Inc. New York & London.

2. Biochemistry. Donal Voet, Judith G. Voet. John Wiley & Sons, INC.

New York Chichester Brisbane 3. Molecular Cell Biology. James Darnell, Harvey Lodish & David

Baltimore. Scientific American Books. Distribuido por W.H.Freeman and Company, New York.

4. The Tools of Biochemistry. T.G. Cooper. John Wiley and Sons, INC.

New York.

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Apéndices:

Estructura Proteína (%)

Diámetro (µm)

Densidad de

Equilibrio en

sacarosa (g/ml)

Enzima marcadora

Célula hepática

100 20 1.20

Núcleo

15 5 - 10 1.32 ADN-polimerasa

Aparato de Golgi (vacuolas)

2 2 1.10 Glicosil- transferasa

Mitocondria

25 1 1.20 Citocromo c oxidasa

Lisosomas

2 0.5 1.23 Fosfatasa ácida

Vesículas de retículo endoplasmático.

20 0.1 1.15 Citocromo b5 reductasa

Membrana plasmática

2 Variable (vesículas)

1.15 ATPasa Na+/K+

Tamaño y propiedades de sedimentación de los componentes subcelulares

Componente subcelular Tamaño (µm) RCF (gav)

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Instrucciones para la elaboración del Informe

1. Introducción (2 puntos): Marco teórico que permita comprender los

fundamentos de la practica

2. Objetivos (1 punto): Objetivos que se desean alcanzar con el ejercicio

practico

3. Metodología (1 punto): Metodología desarrollada en el ejercicio

práctico. Está debe ser esquemática.

4. Cálculos (2 puntos): Debe contener todos los cálculos que se realizan

para en el ejercicio práctico (con explicación detalla)

5. Resultados (3 puntos): Explicación de las tablas, figuras y gráficas

que expresan los datos obtenidos en el ejercicio practico

6. Discusión (9 puntos): Es considerado el punto más importante del

informe. Aquí se debe discutir a profundidad los resultados obtenidos

en el ejercicio práctico, haciendo uso del conocimiento teórico del tema

en cuestión al igual que la visión crítica del estudiante.

7. Conclusiones (1 punto): Aquí se debe colocar las conclusiones que el

estudiante obtuvo de su ejerció practico

8. Bibliografía (1 punto): Toda aquella bibliografía (libros, artículos de

revistas científicas, paginas WEB de Universidades o Institutos de

Investigación calificados en el área) utilizada para realizar el informe.

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UNIDAD II

EJERCICIO IIa TRANSPORTE CELULAR

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UNIDADII EJERCICIO IIa

Transporte Celular INTRODUCCIÓN

Las sustancias presentes en mayores cantidades (en términos del número de partículas) en el medio ambiente que circunda las células, son las sales. Es por esto que una de las funciones más importantes de la membrana plasmática sea la de regular el intercambio de iones entre la célula y el medio ambiente. Así, cualquier cambio en las concentraciones de sales en el exterior celular, origina un movimiento de agua que puede modificar sustancialmente el volumen de la célula. No obstante, la estructura lipoprotéica de la membrana plasmática es de tal fragilidad que la misma no es capaz de soportar cambios muy grandes en la presión osmótica entre el interior y el exterior celular. Estas características de la membrana plasmática determinan que los fenómenos de ósmosis sólo sean reversibles hasta un cierto grado de desviación de la isotonía del medio. Salvado dicho intervalo, las células se rompen. En el caso de células como los eritrocitos, esto trae como resultado la salida de la hemoglobina al exterior celular, un proceso conocido como hemólisis.

Los eritrocitos son las células más abundantes de la sangre, también llamados glóbulos rojos. Estas carecen de núcleo y de mitocondrias, están compuestos principalmente de hemoglobina, y presentan un tiempo de vida de entre 100 y 120 días.

La hemólisis ha sido un fenómeno utilizado para medir la velocidad de penetración de las sustancias en eritrocitos. El tiempo necesario para que este fenómeno ocurra, depende de la naturaleza del soluto que forma parte de la solución acuosa. Pueden medirse así las velocidades de penetración de distintos tipos de moléculas, a partir de la velocidad que tarde en presentarse la hemólisis.

Cuando ocurre hemólisis de los eritrocitos por ruptura de la membrana plasmática se produce un cambio en el Índice de Refracción (η) entre el

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interior celular (ηi) y el de la solución externa (ηe). Inicialmente son diferentes (ηi ≠ ηe) y al producirse la hemólisis se mezclan ambos ambientes (interno y externo); de modo que ηi = ηe. Este cambio puede ser monitoreado haciendo incidir un rayo de luz sobre la preparación en un aparato adecuado, midiendo así la dispersión de luz que ocurre por el pasaje de los rayos por medios de diferentes η.

A través del siguiente ejercicio práctico, se pretende que el estudiante desarrolle un sentido de aplicabilidad de los conceptos biofísicos básicos involucrados en los procesos de intercambio de material entre las células y su medio ambiente mediante la utilización de células sanguíneas (eritrocitos). Materiales: a) A traer por los estudiantes:

• Dos hojas de papel milimetrado • Una regla plástica • Tirro y marcadores

b) A ser suministrados por el laboratorio:

• Papel Parafilm • 2 fiolas de 50 ml • 30 tubos de ensayo de 15 ml • 1 placa de 96 pocillos • Pipetas Pasteur • Pipetas de 0.1, 1 y 10 ml

Soluciones necesarias (para todos los grupos)

• Cloruro de Sodio 150 mM (ISOTÓNICO) • Cloruro de Sodio 258 mM (HIPERTÓNICO) • Suspensión de eritrocitos lavada con NaCl 150 mM

Soluciones adicionales

• Cloruro de Amonio 150 mM • Acetato de Amonio 150 mM • Sulfato de Amonio 100 mM • Acetato de Sodio 150 mM • Sulfato de Sodio 100 mM • Glucosa 300 mM • Etilenglicol 300 mM • Úrea 300 mM • Manitol 300 mM • Galactosa 300 mM

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PROCEDIMIENTO 1.- CALIBRACIÓN DEL ESPECTROFOTÓMETRO (Longitud de Onda: 500 nm) a) Prepare dos suspensiones de eritrocitos, una de 100% de hemólisis y otra de 0% de hemólisis, de acuerdo a las siguientes indicaciones: Suspensión 100% de hemólisis: tome 0.5 ml de la suspensión de eritrocitos que le será entregada por el preparador (sangre lavada) y hemolícela con 10 ml de agua destilada. Complete hasta un volumen de 30 ml utilizando para ello SOLUCIÓN SALINA HIPERTÓNICA (esto es, NaCl 258 mM) Suspensión 0% de hemólisis: tome 0.5 ml de la suspensión de eritrocitos y añada cuidadosamente SOLUCIÓN SALINA ISOTÓNICA (esto es, NaCl 150 mM) hasta un volumen final de 30 ml, resuspendiendo suavemente b) A continuación, coloque 6 ml de cada una de las suspensiones preparadas de la forma indicada en (a) en cubetas Bausch & Lomb para fotocolorímetro. Ajuste el valor cero de densidad óptica (DO) o el 100% de Transmitancia del fotocolorímetro con la suspensión 100% de hemólisis. c) Posteriormente, proceda a medir la densidad óptica de la suspensión 0% de hemólisis. Anote sus resultados en la Tabla 2 IMPORTANTE:

• Sea cuidadoso al medir la cantidad de eritrocitos a utilizar para preparar las dos suspensiones

• A partir de este momento, en TODAS LAS MEDIDAS que se realicen en el fotocolorímetro deben utilizarse 6 ml de suspensión

• NO DESECHE las suspensiones preparadas en esta parte de la práctica. Consérvelas hasta el final

2.- CONSTRUCCIÓN DE UNA CURVA DE CALIBRACIÓN a) Mezclando adecuadamente las suspensiones de 0% y 100% de hemólisis, prepare suspensiones con un 25, 50 y 75% de hemólisis (el volumen final de cada suspensión debe ser 6 ml). Realice los cálculos necesarios para la preparación de estas suspensiones y complete la Tabla 1 b) Obtenga las lecturas correspondientes de Densidad Óptica y construya una curva de calibración en papel milimetrado (DO vs % de hemólisis). Anote sus resultados en la Tabla 2

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Tabla 1 % final

de hemólisis

Volumen de Suspensión 0%

(ml)

Volumen de Suspensión 100%

(ml) 0 --------------------- -----------------------

25 50 75

100 ---------------------- -----------------------

Tabla 2 % de

hemólisis Densidad

Óptica (500 nm)

0 25 50 75

100 3.- CONTRUCCIÓN DE UNA CURVA DE FRAGILIDAD DE LOS ERITROCITOS a) Prepare soluciones de NaCl a las siguientes concentraciones finales: 0, 30, 60, 90, 120 y 150 mM (el volumen de cada solución debe ser 14 ml). Para ello, debe partir de una solución madre de NaCl 150 mM. Realice los cálculos pertinentes para la preparación de estas soluciones y complete la Tabla 3

Tabla 3 Concentración

Final de NaCl (mM)

Volumen de NaCl 150 mM

(ml)

Volumen de Agua

(ml)

0 30 60 90

120 150

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b) Rotule una batería de tubos de ensayo (12 tubos), de manera que exista un duplicado para cada concentración de NaCl. Coloque en estos tubos, 5.9 ml de cada solución de NaCl preparada en (a) (Recuerde que es por duplicado). Posteriormente, añada 0.1 ml de la suspensión de eritrocitos; mezcle por inversión (PREGUNTE A SU PROFESOR O PREPARADOR) y deje los tubos sobre el mesón por espacio de 10 minutos. c) Transcurrido dicho tiempo, mida la Densidad Óptica de todas las muestras. Reporte sus resultados en la Tabla 4 d) Utilizando la curva de calibración obtenida en la sección 2, determine que porcentaje de hemólisis corresponde a cada una de las densidades ópticas leídas. Anote sus resultados en la Tabla 4. e) Realice en papel milimetrado una curva que muestre como varía el % de hemólisis de los eritrocitos con las concentraciones de NaCl utilizadas.

Tabla 4 [NaCl] (mM)

D.O500 % de hemólisis

0

30

60

90

120

150

4.- ENSAYO DE PERMEABILIDAD SELECTIVA DE LA MEMBRANA DE LOS ERITROCITOS Cuando los eritrocitos se colocan en una solución isotónica de un soluto permeable, el soluto entra a la célula. Esto trae como consecuencia que también se produzca la entrada de agua hasta que finalmente ocurre la hemólisis. La velocidad con la que este fenómeno tiene lugar, depende de la permeabilidad del soluto. Esta velocidad puede ser determinada

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cualitativamente o por medio del fotocolorímetro (cuantitativamente), haciendo lecturas de densidad óptica a diferentes tiempos. 4.1.- Procedimiento para la determinación cualitativa (método visual) En una placa de microtitulación de 96 pocillos que le será suministrada por su preparador, coloque 1 gota de sangre lavada y 5 gotas de cada soluto asignado a su grupo de trabajo. Al colocar un papel detrás de una suspensión de eritrocitos de 0% de hemólisis, no le será posible leer a través de la suspensión; mientras que si esta suspensión se encuentra al 100% de hemólisis, se podrá leer sin dificultad. Clasifique los solutos asignados como rápidos, lentos o intermedios de acuerdo al tiempo que tarden los mismos en entrar en los eritrocitos, es decir:

• Solutos rápidos: si el tiempo de hemólisis es menor o igual a 2 minutos

• Solutos intermedios: si el tiempo de hemólisis se encuentra entre 2 y 10 minutos

• Solutos lentos: si el tiempo de hemólisis es superior a 10 minutos Coloque los resultados de su ensayo en la Tabla 5

Tabla 5 Soluto Rápido Soluto Intermedio

Soluto Lento Soluto Problema

4.2- Procedimiento para determinación cuantitativa La determinación cuantitativa se realizará espectrofotométricamente. Para ello, coloque en tubos Bausch & Lomb, 5.9 ml de los solutos asignados a su grupo de trabajo y 0.1 ml de la suspensión de eritrocitos entregada al comienzo de la práctica. De acuerdo a la clasificación obtenida cualitativamente como soluto rápido, intermedio o lento; realice lecturas de la forma indicada a continuación:

• Para solutos intermedios: lecturas de densidad óptica cada minuto hasta llegar al 100% de hemólisis. Coloque sus resultados en la Tabla 6

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Tabla 6

Tiempo (min)

D.O500 % de Hemólisis

1 2 3 4 5 6 7 8

• Para solutos lentos: 3 lecturas de densidad óptica cada 5 minutos y luego lecturas cada 10 minutos hasta llegar al 100% de hemólisis. Coloque sus resultados en la Tabla 7

Tabla 7 Tiempo (min)

D.O500 % de Hemólisis

5 10 15 17 19 21 23 25

PARA LA REALIZACIÓN DEL INFORME

• Discuta el significado de la curva de fragilidad obtenida por usted. • Grafique el porcentaje de hemólisis contra tiempo para cada solución y

señale en la curva el tiempo requerido para alcanzar un 50% de hemólisis. Compare este tiempo entre los diferentes solutos utilizados y explique las diferencias observadas (si las hay).

• Ordene los solutos asignados a su grupo de trabajo de acuerdo a su permeabilidad.

• Discuta las relaciones entre:

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Permeabilidad y tipo de catión y/o anión (en caso de ser necesario). Permeabilidad y tamaño del soluto.

• Permeabilidad de los solutos y solubilidad en aceite. • Permeabilidad y estructura de la membrana plasmática.

Bibliografía:

1. Giese, A. C. (1983). Fisiología Celular y General. Nueva Editorial Interamericana. Cuarta Edición. México.

2. Rawn, J. D. (1989). Bioquímica (Volumen II). Capítulo 31. Primera Edición. Mc Graw Hill Interamericana

3. Voeth and Voeth (1998). Biochemistry. Segunda Edición. John Wiley Edition. Capítulo 18

4. Whittam, R. (1964). Transport and Diffusion in Red Blood Cells (Monographs of the Physiological Society). Edward Arnold (Publishers) Ltd.

5. Karp, G. (2005). Biología Celular y Molecular: Conceptos y Experimentos. Cuarta Edición. Mc Graw Hill Interamerica.

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UNIDAD II

EJERCICIO IIb COMUNICACIÓN

CELULAR

Modificada por

Prof. Valentina Salas

Abril 2015

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UNIDAD II

EJERCICIO IIb Comunicación Celular

Las células de los organismos multicelulares están en continua

interacción con el medio que la rodea y entre sí mismas. Las modificaciones del medio ambiente tales como cambios de temperatura, salinidad, pH, tensión de oxígeno o cambios en su composición química son transmitidos por señales apropiadas a tejidos específicos, los cuales modifican su actividad de acuerdo al mensaje recibido. Las señales en juego, pueden ser de tipo químico “Hormonas y neurotransmisores o señales eléctricas”. En este ejercicio se ilustraran algunas características de las señales eléctricas y de las células involucradas en la transferencia de esta información.

La membrana plasmática de la célula viva mantiene diferentes concentraciones iónicas entre el interior y exterior celular, debido a su capacidad de regulación selectiva del transporte de iones (permeabilidad iónica). Tal distribución desigual (asimétrica) de partículas cargadas origina una diferencia de potencial que hace el interior celular negativo respecto al exterior (potencial transmembrana).

La presencia y el mantenimiento de un potencial transmembrana es una característica general de la célula (incluyendo las vegetales), pero en las llamadas células excitables (nerviosas y musculares) la magnitud de este potencial es mucho mayor (el potencial transmembrana en estas células se denomina potencial de reposo). Más aún, ante una variación en el medio ambiente (estímulo) su membrana plasmática sufre un cambio dramático en la permeabilidad iónica y como consecuencia de ello, se produce un cambio transitorio (1 milisegundo en las células rápidas) del potencial de reposo. El cambio de potencial producido por el estímulo de las células excitables (las cuales son alargadas) puede propagarse en toda la extensión de la membrana plasmática (potencial de acción). La propagación del potencial de acción es en realidad la transmisión de una señal eléctrica, que contiene una cierta cantidad de información. En las células nerviosas el axón

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actúa como un cable de conducción. La señal eléctrica es de un solo tipo ya que la magnitud de cambios de potencial es siempre la misma (del orden de 100mV según el tipo de célula nerviosa). La variación en la frecuencia entre impulsos sucesivos (potenciales de acción) permite transmitir diferentes cantidades de información por cada axón. La versatilidad de esta información aumenta cuando la actividad de cada axón se integra en un nervio (manojo de axones), añadiéndose así al Alfabeto eléctrico las variaciones en la magnitud de la actividad eléctrica (fenómeno que se ha denominado respuesta gradual).

En este ejercicio se estudiarán: a) El potencial de reposo b) El potencial de acción y la respuesta gradual.

Para llevar a cabo esta tarea se cumplirán los siguientes objetivos: Objetivos: Determinar el potencial de membrana medido como Potencial de daño Determinar el potencial de acción compuesto

Identificar las siguientes propiedades del potencial de acción:

Primera respuesta Respuesta gradual Respuesta máxima Velocidad de propagación Potencial monofásico Efecto del alcohol Los conceptos claves de esta práctica son: Potencial de Membrana: Diferencia de potencial que existe entre el interior y el exterior celular en todas las células Potencial de Reposo: Diferencia de potencial que existe entre el interior y el exterior celular en células excitables (neuronas, musculares, receptores). Potencial de Acción: Despolarización de la membrana plasmática en células excitables cuando se aplica un estímulo. Se invierte el potencial de membrana. Es una respuesta temporal, rápida. Base de la comunicación eléctrica.

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A. El POTENCIAL DE REPOSO Para determinar la magnitud del potencial transmembrana se requiere del uso de técnicas especializadas que permitan mantener la integridad de la membrana y la distribución desigual de los iones, las cuales están fuera del alcance de este laboratorio. Sin embargo, es posible constatar la existencia del potencial transmembrana utilizando un procedimiento clásico muy sencillo.

Potencial de Daño: Si se coloca un electrodo sobre una porción de un músculo o un nervio que ha sido cortada para exponer el interior y otro sobre una porción intacta o no cortada, se establece entre ellos una diferencia de potencial llamado potencial de daño. Si la porción cortada se mantiene eléctricamente aislada de la porción intacta, se puede suponer que el electrodo sobre la porción dañada hace contacto eléctrico con el citoplasma, mientras que aquel sobre la porción intacta lo haría con la solución externa. Así, el potencial obtenido entre los electrodos sería una medida aproximada del potencial de reposo. El músculo sartorio del sapo es una buena preparación para la aplicación de este método ya que puede aislarse fácilmente, sus fibras corren a todo lo largo del músculo y el potencial obtenido es más o menos estable durante unos 45 min.

Materiales: Aguja de disección Tijera gruesa Pinza fina Hilo Tijera fina Pila (5 V) Sapo (a ser traído por los estudiantes 1 por c/2 equipos)

MÉTODO:

1) Utilizando una aguja de disección, descerebre y desmedule un sapo (dos equipos usarán el mismo sapo).

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Figura 1: Descerebración y desmedulación del sapo.

Figura 2: Sapo descerebrado y desmedulado Y materiales para la disección.

2) Con una pinza levante la piel a nivel de la articulación ileofemoral y

corte la piel ventralmente hasta la región cloacal. Haga otro corte en (“T”) a todo lo largo de la región ventral de la extremidad inferior hasta la rótula. Separe la piel e identifique el músculo sartorio. Corte el tendón que lo une a la rótula y cuidadosamente, sepárelo de los músculos subyacentes y libérelos del tejido conectivo. Continúe la disección hasta obtener una buena porción (2-3 cm) del músculo y córtelo en la parte más distal (región cortada).

Figura 3: Separación del músculo sartorio

Figura 4: Corte transversal del músculo sartorio

3) Coloque inmediatamente el sartorio en la cámara respectiva y haga las conexiones pertinentes para registrar el potencial de daño. Asegúrese sobre la manera de hacerlo.

Figura 5: Colocando el músculo en la cámara

Músculo Sartorio

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4) Ajuste la sensibilidad del amplificador derecho a 10 mV/div y la Base de tiempo del Osciloscopio a 0,5 ms/div y determine la magnitud y el signo de potencial de daño. Anote las observaciones. El esquema de este ensayo es el siguiente:

Figura 6: Esquema de la medición del Potencial de Daño Discuta:

• El origen y mantenimiento de este potencial. • Compare el valor obtenido del potencial de Daño con el potencial de reposo medido con microeléctrodos intracelulares.

• Los factores experimentales que modifican la medición en el potencial de Daño.

ENSAYO CON LA PILA:

• Ajuste la sensibilidad del amplificador izquierdo a 1V/div • Base de tiempo o “barrido” a 0,5 mseg/div. • Conecte una pila (aprox. 1V) al amplificador. Determine la

magnitud y el signo • potencial registrado, oprimiendo la “tierra” (GDN) del canal

respectivo del • amplificador. Anote sus observaciones.

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B. EL POTENCIAL DE ACCIÓN:

El potencial de acción puede observarse registrado con dos electrodos externos el cambio transitorio que sufre el potencial de reposo cuando se estimula una célula excitable. Un electrodo es colocado sobre una porción “excitada” y el otro sobre una en “reposo”.

En este ejercicio utilizamos el nervio ciático del sapo, del cual se puede

obtener una buena porción (cerca de 5 cm) y cuya actividad permanece más o menos estable por períodos de tiempos largos (horas). El potencial medido es la suma de la actividad eléctrica de cada uno de los axones componentes del nervio y se llama Potencial de Acción compuesto.

MÉTODO: 1) Una vez sacado el músculo sartorio del sapo. Continúe la disección. Con

cuidado levante las visceras y localice el origen de los ciáticos (uno a cada lado de la columna vertebral). Mueva hacia arriba del animal las vísceras, libere de tejido conectivo los nervios sin tocarlos y humedézcalos con solución Ringer. Inserte un hilo (previamente humedecido con Ringer) por debajo de cada ciático y lo más cercano posible a su origen. Haga un lazo y temple los extremos del hilo rápidamente de modo que se anude en un solo intento. Haga un segundo nudo en el segundo nervio.

Figura 7: nervios ciáticos saliendo de la columna vertebral del sapo

Figura 8: Nervios ciáticos amarrados con hilos de algodón sumergidos en solución Ringer.

2) Corte los nervios entre el nudo y la columna vertebral. Con una tijera gruesa corte el animal transversalmente por encima del origen de los ciáticos.

HILO

NERVIO CIATICO

45

Figura 9: Corte de los nervios por encima del nudo

Figura 10: Corte del sapo por la mitad cuidando de no cortar los nervios, estos deben estar con un algodón con solución Ringer hacia adelante

Para la disección del ciático tenga cuidado de:

a) no tocarlo con nada, b) no templarlo y c) manipularlo solo por el hilo. d) fumadores abstenerse de manipular el nervio

3) Elimine la piel restante de las extremidades halándola con una pinza gruesa (o los dedos si así lo desea). Luego continúe la disección de los nervios separando los mismos cuidadosamente en todo su recorrido hasta la rótula en ambas patas, a nivel de la rótula ate otro pedacito de hilo de la misma manera como lo hizo anteriormente. Cada equipo usará un nervio por lo cual deberá realizar esta parte de la disección. Tome el nervio por los hilos atando a sus extremos y deposítelos en una placa de Petri conteniendo Ringer. Cuidadosamente, libere el nervio de los restos mayores de tejido conectivo.

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Figura 11: Patas una vez cortado el animal y Sacada la piel, los nervios amarrados con

Figura 12: nervio separado del animal con los dos extremos aislados por los nudos con el hilo

los hilos. 2) Para este ensayo usaremos el osciloscopio y el estimulador: Haga las conexiones de los cables para registro con el osciloscopio y de los cables de estimulación al estimulador (haga revisar estas conexiones con el Profesor o Preparador). Usted, utilizará los dos amplificadores del osciloscopio:

• El derecho para registrar el potencial de acción producido por el nervio cuando se estimula: un electrodo de registro ira al (+) del amplificador y el otro al (-), de esta manera usted estará haciendo un registro diferencial.

• El amplificador izquierdo será utilizado para determinar las características del “pulso” de estimulación o sea el estímulo. Ubique los amplificadores en la figura:

Figura 13: Amplificadores del Osciloscopio y Base de tiempo

Base de tiempo Amplificador

izquierdo Amplificador

derecho o central

1

Para la práctica se usarán cables para conectar la cámara que contiene al músculo o al nervio llamados cables BNC-BNC o cables BNC-Bananas. Observe las siguientes figuras:

Figura 14: Cables BNC-BNC y terminales BNC.

Cables BNC-Bananas y terminales Bananas

Encienda el estimulador. Conecte un cable “BNC” con “bananas” al terminal “AC COUPLED” de uno de los canales del estimulador y otro cable igual a la entrada positiva del amplificador izquierdo. Conecte ambos cables entre sí conservando su polaridad (+) con (+) y (-) con (-). De esta manera Ud. está enviando al osciloscopio por el amplificador izquierdo, la señal que proviene del estimulador y que será registrada por uno de sus canales como un haz luminoso adicional. Coloque el haz sobre la línea más inferior de la graticula de la pantalla, usando para ello el control de posición (POSITION) ubicado en el amplificador respectivo. Ajuste la sensibilidad de amplificador a 100 mV/div. 3) Conecte al osciloscopio la señal de sincronización del estimulador (éste tiene dos “tomas”, una al frente y la otra en la parte posterior). Esta conexión deberá hacerla a la base de tiempo del osciloscopio (TIME BASE/ AMPLIFIER) en el terminal EXT INPUT. Encienda el estimulador y coloque los “switches” respectivos en la posición PULSO (PULSE).

Cable BNC-BNC

Terminales BNC

Cable BNC-Bananas Terminales-Bananas

2

4) Ajuste el barrido del osciloscopio a 0.2 mseg/div. Coloque el control de retardo (DELAY) del estimulador a 0.1 mseg y el control maestro (MASTER PERIOD) en 1000 mseg. La onda que aparece en la pantalla es el pulso de estimulación (onda cuadrada). Ajuste la duración del pulso a 0.2 mseg, moviendo el control respectivo en el estimulador (PULSE DURATION). Ajuste la amplitud del pulso de estimulación a 150mV usando el control “PULSE AMPLITUDE” y reduzca la sensibilidad de ese amplificador a 100 mV/div. Apague el canal de estimulador, colocando el “switch” derecho (OUTPUT) en la posición “OFF”. 5) Tome el nervio por los hilos y deposítelo en la cámara, cuidando de que se haga un buen contacto con cada uno de los electrodos. Mueva el control maestro (MASTER PERIOD) a posición 05K (1/2 seg.). Ajústela sensibilidad del amplificador a 100mV/div y mueva la posición del haz a objeto de que el barrido ocurra en el centro de la pantalla. Conecte los electrodos de estimulación en paralelo con la salida del estimulador, colocando el (+) lo más distal de los electrodos de registro. Encienda el canal de estimulación (coloque el electrodo positivo proximal a los electrodos de registro). ¿Qué ocurre?. Cambie de nuevo la polaridad. ¿Qué concluye?. EXPERIMENTO 1. Primera respuesta, respuesta gradual y respuesta máxima: El objetivo de este ejercicio es demostrar la primera respuesta del nervio y la respuesta gradual. Retorne a cero el control de amplitud del pulso de estimulación. Aumente la sensibilidad del amplificador derecho a 1 mV/div. Empiece a aumentar la amplitud del pulso de 50 en 50 mV hasta que aparezca una señal perceptible en el canal respectivo y continúe hasta 500 mV. ¿Cómo se denomina este estímulo?. Continúe aumentando la amplitud de 100 en 100 mV hasta alcanzar 1 voltio (cambie la sensibilidad del amplificador izquierdo correspondientemente). Determine en cada caso la magnitud del potencial obtenido y observe su forma. Retorne la amplitud que provocó la respuesta máxima. Apague el canal de salida del estimulador. Grafique la diferencia del potencial (magnitud del potencial de acción) versus la magnitud del pulso de estimulación. Discuta las características de este gráfico. Así mismo, discuta la forma de potencial de acción obtenido. Lo que observará en le pantalla del Osciloscopio se indica en la siguiente figura:

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Figura 15: Estímulo y Potencial de Acción Compuesto en la pantalla del osciloscopio Observe las unidades de los ejes en la pantalla del osciloscopio. EXPERIMENTO 2. Periodo Refractario Absoluto y Relativo: En este ejercicio se demostrará la existencia del período refractario absoluto y del relativo, característica muy importante de las células excitables. Para ello usted trabajará con un tren de pulsos, procediendo como se describe a continuación:

1) Desconecte los electrodos de estimulación de la cámara y ajuste el osciloscopio para un barrido de 2 mseg/div.

2) Ajuste el estimulador como sigue: control maestro (MASTER PERIOD) 500 mseg, retardo (DELAY) = 0.1 mseg; tren (TRAIN) = switch en TRAIN duración del tren (TRAIN DURATION) = 5 mseg., período del tren (TRAIN PERIOD) = 2 mseg. No mueva los controles de duración o amplitud del pulso de estimulación, puesto que han quedado ajustados para obtener la respuesta máxima.

3) Disminuya cuidadosamente el período del tren y observe que ocurre. Retorne el período del tren a su posición inicial (o hasta que aparezca un solo pulso de estimulación en la pantalla).

Duración del pulso = 0,2 mseg. Período del tren = 0,1 mseg. Duración del tren = 5 mseg.

4) Apague el canal de estimulación y conecte los electrodos de

estimulación.

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5) Coloque el control maestro en 1K (1 segundo) y encienda el tren y observe lo que ocurre. Solicite ayuda para fotografiar el fenómeno (si es posible). Una vez concluida la experiencia, apague el canal de estimulación coloque el “switch” respectivo en la posición SINGLE PULSE.

Figura 16: Determinación de los Periodo Refractarios en el nervio

Discuta los resultados obtenidos e inclúyalos también en su informe.

EXPERIMENTO 3: Velocidad de propagación y potencial monofásico.

1) Elija el pulso que provoco una respuesta cercana a la máxima (200/500 MV)

2) Estimule el nervio y aumente la velocidad de barrido, convenientemente.

3) Mida la distancia entre ambos picos del potencial de acción y entre los electrodos de registro. Anote la velocidad de barrido.

4) Con una pinza, triture el nervio por la región ubicada sobre el electrodo de registro más distal a los electrodos de estimulación. Observe el potencial de acción.

5) Proceda en forma similar en una región entre los electrodos de estimulación y de registro.

EXPERIMENTO 4: Efecto del alcohol sobre la conducción nerviosa Agregue unas gotas de alcohol sobre el nervio y observe qué sucede con el potencial de acción.

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INFORME: Responda el cuestionario que le será entregado en el momento de la práctica, en los espacios asignados para ello. Bibliografía: Fisiología Animal. Eckert R, Randall D. y Augustine G. Interamericana Mc Graw Hill, capítulos 5 y 6. Molecular Biology of The Cell. Bruce Alberts, Dennis Bray, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, James, D. Watson. Garland Publishing, Inc. New York & London. Molecular Cell Biology. James Darnell, Harvey Lodish & David Baltimore. Scientific American Books. Distribuido por W.H.Freeman and Company, New York.

Preguntas para estudiar: Las siguientes preguntas son una guía de los temas sobre esta unidad que usted debe manejar, antes, durante y después de la práctica.

1) Defina potencial de membrana. 2) Defina potencial de reposo. 3) Defina potencial de acción. 4) Defina potencial de daño. 5) Defina potencial de acción compuesto. 6) Explique cuál es su estructura y cómo funciona un osciloscopio. 7) Investigue sobre las aplicaciones del osciloscopio en la medicina 8) Explique qué es un estimulador. 9) Discuta la utilidad de los microelectrodos. 10) Explique la aproximación experimental en la cual se basa la determinación del

potencial de daño. 11) Explique cuál es la muestra biológica para determinar el potencial de daño y

cuáles son las ventajas de utilizar dicha muestra? 12) Explique la aproximación experimental en la cual se basa la determinación del

potencial de acción compuesto. 13) Explique cuál es la muestra biológica para determinar el potencial de acción

compuesto y cuáles son las ventajas de utilizar dicha muestra? 14) Defina en el potencial de acción compuesto a qué nos referimos con:

- Primera respuesta - Respuesta gradual - Respuesta máxima

15) Dibuje un esquema con la ubicación de la muestra y los equipos para determinar el potencial de daño.

16) Dibuje un esquema con la ubicación de la muestra y los equipos para determinar el potencial de acción compuesto.

17) Discuta por qué usamos un estímulo eléctrico para determinar el potencial de acción compuesto y no otro tipo de estímulo?.

18) Compare las medidas de potencial de daño determinadas por usted y sus compañeros con los valores reportados en la bibliografía.

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19) Qué es y qué contiene la solución Ringer? 20) Por qué se llama solución Ringer? 21) Para qué y en cuál prueba se utiliza la solución Ringer? 22) Qué pasaría si utilizamos solución Ringer en la prueba del potencial de daño?

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UNIDAD III

EJERCICIO IIIa-IIIb INTEGRACIÓN Y CONTROL DE LA

FUNCIÓN CELULAR

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UNIDAD III

Integración y Control de la Función Celular Introducción

Los procesos de crecimiento y diferenciación celular son complejos resultantes de la interacción de las distintas actividades celulares: biosíntesis, transporte, reconocimiento, etc. y las particulares condiciones ambientales en que se desarrolla el sistema celular. La clave en esta interacción son los numerosos sistemas regulatorios, a distintos niveles, que están asociados a todos los aspectos de la función celular. Estos sistemas regulatorios básicamente constituyen servo-mecanismo que continuamente controlan la actividad de las distintas funciones e integran diferentes funciones, a diferentes niveles, a fin de adecuarlas a los requerimientos globales del sistema celular. En última instancia, la respuesta de una célula a un determinado grupo de condiciones puede trazarse, incluyendo los mecanismos regulatorios antes mencionados, a la expresión ordenada de la información contenida en el genoma celular. La capacidad de respuesta de una célula, que es transitoria y reversible en todos sus aspectos para organismos unicelulares de vida libre, pero definitiva en la expresión de ciertas funciones de células especializadas de organismos multicelulares, es pues una función tanto de la variedad de su información genética como de la capacidad de regular la expresión de la misma frente a un conjunto de condiciones específicas.

En ese ciclo de trabajos de laboratorio estudiaremos la capacidad de respuesta a diferentes condiciones de crecimiento de un organismo procariótico capaz de vida libre (aunque normalmente es un comensal en el intestino humano), Escherichia coli, y los mecanismos regulatorios involucrados en la misma. En una primera experiencia (A) se desarrollarán metodologías para cuantificar la respuesta de una población, expresada en los distintos parámetros de la cinética de crecimiento de la misma, a diferentes condiciones físicas y químicas del medio de cultivo. Se trata de introducir aquí al estudiante en el manejo de técnicas de

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estudio de microorganismos o células aisladas y, a través de una experiencia colectiva que permita estudiar gran variedad de situaciones, determinar las condiciones óptimas de crecimiento in vitro y sus relaciones con las condiciones naturales (in vivo) en que se desarrolla el organismo. En el segundo ejercicio (B) se utilizarán metodologías desarrolladas en el ejercicio anterior, así como nuevas técnicas que se introducirán en éste, para estudiar específicamente la respuesta del mismo organismo a modificaciones drásticas en el medio de cultivo, específicamente con relación a la fuente de energía accesible a la célula. Esto será seguido midiendo la actividad de una enzima responsable del procesamiento del sustrato ofrecido al organismo bajo diferentes condiciones. Se quiere obtener a partir del análisis de las diferentes respuestas, información sobre el sistema regulatorio responsable de la misma (aparición o desaparición de la enzima en el medio intracelular).

EJERCICIO IIIa Objetivos: Al completar el ejercicio el estudiante debe ser capaz de: 1. Usar diferentes métodos de contaje de células, conocer su

relación con distintas propiedades de las mismas y, basándose en ellos desarrollar criterios para el análisis cuantitativo de la cinética de crecimiento de una población celular.

2. Ser capaz de analizar el efecto de variables ambientales, tales

como temperatura, tipo de fuente de carbono presente en el medio de cultivo, aerobiosis o anaerobiosis y diauxismo, sobre la cinética de crecimiento de una población de un organismo procariótico de vida libre (Escherichia coli).

Método: 1. Contaje indirecto de células procarióticas:

Cada equipo en condiciones estériles preparará un medio de cultivo de la siguiente composición (10 ml totales en una ertula): Medio mineral completo Vitamina B1 (tiamina) – 5 µgr/ml Fuente de carbono – 10 mM El medio es inoculado con una dilución 1/10 de un cultivo de bacterias (Escherichia coli) que se le suministrará. Incube la

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ertula inoculada en un baño de agitación (120 rpm) a la temperatura asignada. Inmediatamente después de inocular el medio y con intervalos sucesivos de 20 minutos, durante 3 horas, determine la población bacterial presente realizando las siguientes operaciones: (Todas estas operaciones deben llevarse a cabo en condiciones estériles.

1. Mida la densidad óptica del cultivo, (recuerde ajustar la lectura del fotocolorímetro con el blanco apropiado en cada oportunidad).

2. Retire una muestra de 0.1 ml exactos del cultivo en cuestión y haga una dilución global de éste de 1 en 104

para medidas menores de 40 unidades Klett (UK) y de 1 en 106 para medidas mayores de 40 unidades Klett, por vía de diluciones sucesivas en los tubos de solución salina estéril que se les proveerá. (tome en cuenta el volumen de solución que hay en estos tubos).

NOTA: 1 DO= 500 UK y 1 UK= 2x106 cel/ml

3. Tome 0.1 ml exactos de la dilución obtenida en el paso 2 y

distribúyala uniformemente sobre una placa de agar nutritivo estéril, usando una asa de vidrio.

4. Incube estas placas invertidas a 37 °C por 24 horas y

determine el número de colonias. Calcule a partir de allí el número de células viables presentes en el cultivo original por milímetro.

2. Contaje directo de células eucarióticas

Haga diluciones seriadas en 1/5 de 1/10 y de 1/20 (en formol 2%, solución salina tamponada) del cultivo de Leptomonas sp. (no patógena) que se le suministrará y determine el total de células por ml. en cultivo original por vía de contaje directo de las células en una cámara de Neubauer, según el método descrito en el apéndice. Nota: Antes de hacer la inoculación en el medio de cultivo mida la densidad óptica de éste (recuerde ajustar el cero con el blanco), y use este valor para corregir las medidas sucesivas.

Materiales: Cada equipo recibirá 2 ertula de 125 ml (estéril)

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1 pipetero con: 45 pipetas de 0.1 ml 3 pipetas de 0.2 ml ESTERILES

2 pipetas de 1 ml 2 pipetas de 10 ml

40 tubos con 10 ml. de solución salida estéril 10 placas con Agar nutritivo (estéril) 2 tubos de ensayo 2 pipetas Pasteur + perita de goma 2 pipetas de 1 ml. no estériles 1 asa de vidrio 1 mechero

Disponibles para cada 3 equipos:

50 ml de medio mineral (Fosfatos, K+, Na+, Ca2+, Mg2+, Fe3+, NH+

4 (estériles) Glucosa, 1M Galactosa, 1M Acetato, 1M Succinato, 1M Lactosa, 1M Glucosa 100 mM Succinato, 100 mM Vitamina B1, 1 mg/ml 1 fotocolorímetro Klett-Sumerson 1 cámara de contaje celular Neubauer Disponibles para cada cinco equipos: 1 baño de termperatura regulable, con agitación. Cada equipo trabajará con dos condiciones específicas, los resultados obtenidos por los diferentes equipos se compararán e integrarán en la discusión post-práctica. Las condiciones que se estudiarán en las prácticas son las siguientes (subraye la que se le asigne):

Fuente de carbono Temperatura Agitación (Concentración final) (°C) 1 D-glucosa 10 mM 37 si 2 D-glucosa 10 mM 37 no 3 D-glucosa 10 mM 43 si 4 Succinato 10 mM 37 si

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5 Succinato 10 mM 37 no 6 Succinato 10 mM 43 si 7 Galactosa 10 mM 37 si 8 Galactosa 10 mM 43 si 9 L-glutamato 10 mM 37 si 10 Acetato 10 mM 37 si 11 D-lactosa 10 mM 37 si 12 D-glucosa 1 mM + D-lactosa10 mM 37 si 13 L-glutamato 1 mM + D-lactosa 10 mM 37 si Resultados: El diseño de este ejercicio, donde cada equipo estudia el crecimiento de la misma cepa bacteriana pero en condiciones diferentes a las estudiadas por los otros, lleva a que los resultados de las prácticas deban ser discutidas colectivamente en el período pos-práctica. Sin embargo, cada grupo debe presentar en el informe, que debe ser entregado el día de la discusión, los siguientes resultados:

1. Discusión del uso y composición del blanco que se utiliza en las determinaciones espetrofotocolorimétricas.

2. Discusión del significado y uso de la determinación de la

densidad óptica de medio de cultivo antes de la inoculación. 3. Tabla de valores de densidad óptica, densidad de células viables

(determinada por el contaje de colonias en placa) y tiempo.

4. Gráficas en papel lineal y semilogarítmico de la densidad óptica y de células viables contra el tiempo.

5. Gráfica de densidad óptica contra densidad de células viables,

para cada tiempo. Discuta la gráfica obtenida y a partir de ella analice las gráficas obtenidas en el punto anterior.

6. Discusión de las matemáticas del crecimiento de una población

celulares que prolifera por fisión binaria. Precise bajo que condiciones se obtiene un crecimiento exponencial de la misma y basándose en esto determine el tiempo de generación (tiempo requerido para la duplicación de la población bacterial de la fase exponencial de crecimiento) de su cultivo.

7. En base a su conocimiento del metabolismo energético de

bacterias y del hábitat normal de E. coli (intestino humano)

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analice el efecto de la temperatura, fuente(s) de carbono y aireación utilizada en su experimento. Bibliografía: DAWES, E. A. (1969) –Quantitative problems in Biochemistry, caps VII y IX E.S. Livingstone, Ltd., Edingburg. London. DYSON, Robert. (1973) –Cell Biology, a molecular approach, cap. 9 Allyn and Bacon, Boston. LEHNINGER, A. (1975) – Bioquímica, Caps. 15, 16, 18, 19, 20. Worth Pub.

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APÉNDICE

CÁMARA DE NEUBAUER Una de las formas de expresar el tamaño (número de

elementos) de una población de individuos unicelulares que creen libremente suspendidos en medio líquido, es indicar el número de los mismos por unidad de volumen del medio que les sirve de sustrato. Ejemplo, células/mililitro. Sin embargo, es frecuente que se alcancen valores de millones de células por cm3, lo cual hace imposible el contaje directo en ese volumen, se recurre entonces a diluciones seriadas. Al trabajar con poblaciones de microorganismos, relativamente grandes (varias micras de diámetro) después de realizar las diluciones apropiadas se coloca una muestra (0,1 ml) para su contaje al microscopio. Se cuentan los microorganismos presentes en la muestra y, tomando en cuenta el volumen y las diluciones, se determina la densidad (N° cel/ml) de la población original.

Uno de los elementos que se utilizan para esto, es la

Cámara de Neubauer. La misma esta constituida básicamente por una lámina de vidrio (porta objeto) gruesa, como se ve en la figura 1a.

Cada cámara tiene en el centro (A) dos regiones de contaje, I y II idénticas independientes una de otra, separadas por un canal intermedio. A los lados hay dos rebordes, que sobresalen de la cámara (figura 1a) sobre los cuales va la lámina cubre objeto. La distancia del cubre objeto al aporte objeto es de 0,1 m.m. Viendo al microscopio la superficie I o II, se observará un cuadriculado característico (figura 2) con las dimensiones que se indican en el dibujo.

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Se pone una gota de muestra en el porta objeto, se

coloca luego el cubre objeto y se lleva al microscopio (Obj. de 16 x ó 40x). Se puede elegir a voluntad un cierto volumen conocido, para contar el número de células. Ejemplo, si escogemos la zona del centro, vemos que esta sub-dividida en 25 cuadros que tienen 1/5 de mm de lado: cada uno de estos está dividido a su vez en 16 cuadrados de 1/20 mm de lado, por tanto, el cuadrado más pequeño tiene una superficie de 1/20 x 1/20 = 1/400 mm2. Al conocer la altura podemos luego trasladarlo a otra unidad de volumen deseado (N° cel/cm3).

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Ejemplo:

Calcule el número de parásitos/ml si hemos hecho una dilución de 10-6 y contamos en un cuadro central de 1/5 de mm de lado 8 parásitos. ¿Cree usted que es suficiente contar en ese solo cuadro? ¿Por qué?

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EJERCICIO IIIb

Integración y Control de la Función Celular

Objetivos: Al completar el ejercicio el estudiante debe ser capaz de: 1. Explicar las diferentes características de la respuesta

adaptativa de una población celular que crece bajo condiciones nutricionales que varían con el tiempo: alteraciones en la tasa de crecimiento de la población, aparición o desaparición de ciertas funciones celulares, tiempo de respuesta.

2. Poder inferir a partir del análisis de una dada respuesta adaptativa la naturaleza de los mecanismos regulatorios involucrados en la misma: nivel de regulación, tipo de regulación (positiva o negativa) y posibles alteraciones del mecanismo regulatorio en las cepas estudiada.

Se trabajará con dos cepas diferentes de E. coli (A y B), una de ellas corresponde a la cepa silvestre y la otra, a una cepa que presenta una mutación que afecta la regulación del operón Lac. Cada equipo recibirá instrucciones sobre las cepas y las condiciones específicas del cultivo que usarán en los pasos II y III. Estas deben ser subrayadas en el protocolo y deben aparecer claramente en el informe. Método I: Cada equipo trabajando en condiciones estériles preparará un medio de cultivo de la siguiente composición (20 ml totales en una értula). Medio mineral, completo Vitamina B1 (tiamina) 5 µgr/ml Succinato 10 mM El medio será inoculado con una dilución 1:20 de un cultivo de bacterias (A o B) que se le suministrará. La ertula será mantenida en un baño con agitación (120 cps a 37°C). Luego de inoculado el medio se determinará la población bacterial por densitometría (600 nm), según el método usado en el ejercicio A, cada 30 (treinta) minutos durante 1,5 horas (4 determinaciones). De igual forma en cada uno de estos tiempos se retirará en esterilidad una muestra de 0.5 ml exactos del cultivo y se le agregará de inmediato una gota de tolueno, se agitará fuertemente y se incubará a temperatura ambiente hasta el momento de determinar la actividad (Método IV). El

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tolueno, es un solvente orgánico capaz de disolver los lípidos de la membrana celular de E. coli, liberando el contenido citoplasmático al medio. Este procedimiento se realizará a fin de determinar el contenido de la enzima β-galactosidasa en el medio intracelular, según se describe en el punto IV. Método II:

Llegado a este punto se procede a hacer en la misma értula, una de las dos adiciones siguientes (todas las adiciones deben ser hechas en condiciones estériles).

a) Isopropil-tiogalactosido (IPTG), concentración final 0.1

mM. b) Actinomicina-D concentración final 4 µgr/ml + IPTG 0.1

mM

El isopropil–tiogalactosido (IPTG) es un análogo de la lactosa, un compuesto que puede actuar como inductor del Operón Lac y que no es metabolizado por la bacteria. La Lactosa es un disacárido que usa frecuentemente E. coli como fuente de carbono y de energía. Entre las enzimas responsables del uso de este β-galactosido, está la β-galactosidasa, codificada por un gen del operón LAC y cuya expresión será medida en esta práctica cuantificando su actividad enzimática. A partir de este punto proceda a medir la densidad óptica del cultivo (600 nm) y a obtener las muestras de 0.5 ml cada 30 minutos, durante un total de 90 minutos (3 determinaciones) para la medición de la actividad β-galactosidasa (Método IV). A estas alícuotas de 0.5 ml se le agregará inmediatamente 1 gota de Tolueno tal como se explicó en el Método I. Método III: Al completar la segunda etapa, en las mismas értulas, se procederá a hacer una de las siguientes adiciones: a) Glucosa, concentración final en el cultivo 10 mM b) Glucosa, concentración final en el cultivo 10 mM más 3’,5’

adenosin-monofosfato-cíclico (AMP-c), concentración final 2 mM.

De nuevo se determinará la densidad óptica del cultivo (600 nm) y se retirarán muestras de 0.5 ml cada 30 minutos, durante un total de 90 minutos (3 determinaciones) para la

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medición de la actividad β-galactosidasa (Método IV). A estas alícuotas de 0.5 ml se le agregará inmediatamente 1 gota de Tolueno tal como se explicó en el Método I. Método IV: Para realizar las determinaciones de la actividad β-galactosidasa, a las muestras de 0.5 ml retiradas del cultivo a lo largo de todo el experimento, a las cuales se les había agregado previamente una gota de Tolueno, se le agregará 0-nitrofenol-galactosido (ONFG) a una concentración final de 5 mM, se incubarán a temperatura ambiente durante 10 minutos y se parará la reacción enzimática con 6 ml. de carbonato de sodio (Na2CO3) 1 M. La fuerte alcalinización del medio inhibe la actividad de la enzima. El ONFG es un análogo de la lactosa que es hidrolizado por la β-galactosidasa a galactosa más 0-nitrofenol. Este último compuesto tiene una intensa absorción en el ultravioleta cercano (420 nm) y sus soluciones son de fuerte color amarillo a pH básicos. Mida la densidad óptica de cada muestra a la longitud de onda indicada, usando como blanco Carbonato de Sodio 1 M. Materiales: Cada equipo recibirá 2 ertulas de 125 ml (estéril) 1 pipetero estéril con: 3 pipetas de 0.1 ml

20 pipetas de 1 ml 4 pipetas de 5 ml

2 pipetas de 10 ml 20 tubos de ensayo 1 pipetas Pasteur + 1 peritas de goma 1 pipeta de 0.1 ml no estéril 1 pipeta de 10 ml no estéril 1 mechero

Disponible para cada tres equipos:

50 ml de medio mineral (fosfatos K+, Na+, Ca2+, Mg2+ y Fe3+NH4

+ (estéril) 5 ml de vitamina B1 (tiamina), 1 mg/ml Succinato, 1M en medio mineral (estéril)

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Disponible para cada cinco equipos:

Glucosa 1M IPTG 10 mM AMP-c 200 mM en medio mineral (estéril) Actinomicina-D 400 µg/ml ONFG, 25 mM en medio mineral Na2CO3, 1M en agua 1 baño de temperatura regulable con agitación 1 espectrofotómetro (Baush & Lomb, Spectronic 20, por ejemplo)

Resultados:

En este ejercicio como en el anterior, se realizarán simultáneamente (por los distintos equipos) diferentes experimentos para estudiar la respuesta de los microorganismos a diferentes condiciones ambientales, de aquí que una comprensión global de las propiedades adaptativas requiere una discusión colectiva de las experiencias logradas. Pero, de nuevo, cada equipo debe discutir en su informe (el cual debe presentar conjuntamente con el de la parte A, el día de la discusión) los siguientes conceptos y resultados para las condiciones particulares utilizadas por cada equipo durante la práctica:

1) Características estructurales y funcionales de un operón 2) Papel de las enzimas codificadas por el operón LAC en el

metabolismo de β-galactosidos. 3) Características básicas y diferencias entre mecanismos de

control positivo y negativo. 4) Tabla de resultados: Densidad óptica del cultivo (D.O. 600 nm),

no de células/ml, Densidad óptica a 420 nm obtenida en el experimento IV, actividad específica β-galactosidasa y tiempo.

5) Gráficas: Número de células/ml vs tiempo, Densidad óptica a 420 nm versus tiempo y actividad específica β-galactosidasa versus tiempo.

6) Analice, en su caso particular, el efecto sobre la tasa de crecimiento de la población y actividad β-galactosidasa, de las alteraciones (compuestos añadidos en el medio) en los métodos II y III del experimento.

a) ¿Qué puede inferir de la relación entre la concentración de IPTG y la respuesta producida?

b) ¿Qué puede inferir, de la respuesta producida en presencia de actinomicina-D sobre el nivel al cual se regula la presencia de β-galactosidasa en la célula? Describa el mecanismo de acción de la actinomicina-D.

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c) Puede usted de los resultados obtenidos inferir qué tipo de control (positivo o negativo) regula la presencia de la β-galactosidasa a través de IPTG. ¿Por qué?

d) Respecto al sistema de regulación mediado por la glucosa, puede usted afirmar que constituye un sistema diferente al mediado por IPTG? ¿Qué relación jerárquica existe entre ellos? Explique.

Bibliografía:

1. Molecular Biology of The Cell. Bruce Alberts, Dennis

Bray, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, James, D. Watson. Garland Publishing, Inc. New York & London.

2. Molecular Cell Biology. James Darnell, Harvey Lodish &

David Baltimore. Scientific American Books. Distribuido por W.H.Freeman and Company, New York.

3. Bioquímica. J David Rawn. Interamericana McGraw-Hill.

4. Biología Celular y Molecular: Conceptos y

Experimentos. Karp, G. Mc Graw Hill Interamerica.

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