UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CIUDAD JUÁREZ INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMÉDICAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS...

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CIUDAD JUÁREZ

INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMÉDICAS

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUÍMICO-BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE BIOLOGÍA

MANUAL DE PRÁCTICAS

BIOLOGÍA MOLECULAR

MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR

COMPILADORES:

Principal: Dra. Florinda Jimenez Vega

Colaboradores:

Revisado por: Academia de Biologia 2011

Ciudad Juárez, Chihuahua

Universidad Autónoma de Ciudad Juárez

2011

p. 69

M. en C. Emilio Clarke Crespo

Coordinador de la Academia de Biología

D. Ph. Antonio de la Mora Covarrubias

Coordinador del Programa de Biología

Dr. Alejandro Martínez Martínez

Jefe del Departamento de Ciencias Químico-Biológicas

M.C. Hugo Staines Orozco

Director del Instituto de Ciencias Biomédicas

Aprobados por la Academia de Biología, 2011

INTRODUCCIÓN

La Biología Molecular es una ciencia cuyo objetivo fundamental es la comprensión de todos aquellos procesos celulares, que contribuyen a que la información genética se transmita eficientemente de unos seres a otros, y se exprese en los nuevos individuos.

Este conocimiento ha rebasado barreras naturales entre especies y instalar genes de cualquier organismo, en un organismo hospedador no relacionado mediante el empleo de herramientas genéticas. Una de las consecuencias importantes derivadas, fue la producción de fragmentos de ácidos nucleícos a gran escala, abriendo las puertas a la secuenciación de los ácidos nucleícos, y por ende a nuevas disciplinas como el diagnóstico molecular, la terapia génica o la obtención de organismos superiores recombinantes.

Cronológicamente todos estos eventos inician en el año 1866 cuando Mendel publica sus experimentos conducentes a los principios de segregación y clasificación independiente de los genes. En 1953 se marca la pauta que dio origen a la revolución genética con la publicación de Watson y Crick en la cual describen la estructura del DNA como una doble hélice complementaria que recuerda la estructura de una escalera de caracol. A partir de entonces y de manera exponencial, se ha llegado hasta la secuenciación de los genomas y los procesos de clonación y mutagénesis.

El presente manual tiene como finalidad la transportación al maravilloso estudio de las macromoléculas y su integración como herramientas moleculares para el estudio y caracterización de estas. Es solo el inicio de un largo camino por andar, esperando sea de interés para ustedes.

Manual de Prácticas de Laboratorio Biología Molecular Dra. Florinda Jiménez Vega Pag. 2

TABLA DE CONTENIDO Practica No. 1 ........................................................................................................ 4

Preparación de soluciones de concentración definida y soluciones amortiguadoras ..................................................................................................... 4

Practica No. 2 ........................................................................................................ 9

Determinación de proteínas por la técnica de Bradford .............................. 9

Practica No. 3 ...................................................................................................... 13

Electroforesis en Geles de Poliacrilamida desnaturalizantes SDS-PAGE .... 13

Practica No. 4 ...................................................................................................... 20

Tinción de Geles de Poliacrilamida por Coomassie Blue ............................. 20

Practica No. 5 ...................................................................................................... 22

Extracción de DNA utilizando DNAZOL ............................................................ 22

Practica No. 6 ...................................................................................................... 25

Extracción de DNA utilizando Fenol Cloroformo Alcohol isoamílico .......... 25

Practica No. 7 ...................................................................................................... 28

Extracción de RNA .............................................................................................. 28

Practica No. 8 ...................................................................................................... 31

Cuantificación de RNA y DNA .......................................................................... 31

Practica No. 9 ...................................................................................................... 33

Electroforesis de DNA en geles de agarosa ................................................... 33

Practica No.10 ..................................................................................................... 35

Electroforesis de RNA en geles de agarosa-formaldehido .......................... 35

Practica No. 11 .................................................................................................... 38

Síntesis de cDNA .................................................................................................. 38

Practica No. 12 .................................................................................................... 41

Reacción en cadena de la Polimerasa .......................................................... 41

Practica No. 13 .................................................................................................... 44


Aislamiento de un fragmento de DNA a partir de un soporte solido ......... 44

Practica No. 14 .................................................................................................... 47

Ligación de productos de PCR a un vector de clonación .......................... 47

Practica No. 15 .................................................................................................... 50

Preparación de células químicamente competentes ................................. 50

Practica No. 16 ................................................................................................... 53

Transformación bacteriana en E. coli .............................................................. 53

Practica No. 17 .................................................................................................... 57

Análisis de colonias recombinantes por PCR ................................................. 57

Practica No. 18 .................................................................................................... 60

Aislamiento de DNA plasmídico ....................................................................... 60

Practica No. 19 .................................................................................................... 63

Digestión de DNA plasmídico con endonucleasas de restricción ............. 63

Practica No. 20 .................................................................................................... 67

Introducción a la Bioinformática ...................................................................... 67


PRACTICA NO. 1 PREPARACIÓN DE SOLUCIONES DE CONCENTRACIÓN DEFINIDA Y SOLUCIONES AMORTIGUADORAS

OBJETIVO

Que el estudiante aprenda a preparar disoluciones en concentraciones definidas en porciento, normalidad, molalidad y molaridad.

INTRODUCCIÓN

La composición de una solución se debe medir en términos de volumen y masa, por lo tanto es indispensable conocer la cantidad de soluto disuelto por unidad de volumen o masa de disolvente, es decir su concentración. Durante cualquier trabajo experimental, el uso de soluciones se hace indispensable, por lo que es necesario conocer los procedimientos para su elaboración. En la presente práctica se realizarán soluciones utilizando como concentración la molaridad, la normalidad y las relaciones porcentuales.

La molalidad se define como el número de moles de soluto disueltos en 1 kg de disolvente, esto es:

M =[( numero de moles de soluto )/( peso del disolvente en kg) ]

La unidad de porcentaje peso tiene la ventaja de que no se necesita conocer la masa molar del soluto. Además, el porcentaje peso de una solución es independiente a la


temperatura, ya que se define en términos de pesos, el termino de fracción molar no se emplea normalmente para expresar la concentración de soluciones. Sin embargo es de utilidad para calcular las presiones parciales de los gases y en el estudio de concentración que se emplean con frecuencia, la ventaja del empleo de la molaridad es que por lo general resulta más sencillo medir el volumen de una solución utilizando matraces volumétricos calibrados con precisión, que pesar al disolvente. Su principal inconveniente es que depende de la temperatura, ya que el volumen de una solución suele aumentar con el incremento de la temperatura. Otro inconveniente es que la molaridad no especifica la cantidad de disolvente presente. Por otra parte, la molalidad es independiente de la temperatura, ya que se define como una relación del número de moles de soluto y el peso del disolvente. Por esta razón, la molalidad es la unidad de concentración de empleo preferente en los estudios que involucran cambios de temperatura, al igual que en aquellos de las propiedades negativas de las soluciones.

Por su parte la Normalidad se define como el número de equivalentes químicos de sustancia disuelta por litro de solución.

# de equivalentes = peso molecular del soluto

Así también dentro de las concentraciones porcentuales, el %peso se define como el peso del componente entre el peso de la solución por 100 y el % mol es el numero de moles de cada uno de los componentes entre el número total de moles de solución por 100.

MATERIALES

Cloruro de Sodio

Hidróxido de Sodio

Ácido clorhídrico


Fosfato de Sodio

Probeta, pipetas, Balanza, Papel encerado, placa de agitación, magnetos, matraces volumétricos y vasos de precipitado.

PROCEDIMIENTO

I. Disoluciones de concentración en peso

Preparación de 50 mL de una solución de NaCl al 0.9% (p/v)

1. Pesar NaCl en la balanza

2. Disolver los X g de NaCl en agua destilada (aprox. 30 mL)

3. Colocar la disolución de NaCl en un matraz volumétrico de 50 mL y aforar con agua destilada.

Preparación de 50 mL de una disolución de alcohol etílico al 70% (v/v)

1. Con base a la concentración del alcohol etílico comercial determinar el volumen necesario para tener 35 mL de alcohol etílico.

2. Medir el alcohol en una probeta

3. Colocar el alcohol etílico en un matraz volumétrico de 50 mL y aforar con agua destilada.

II. Disoluciones de concentración molar

Preparación de 200 mL una disolución de NaOH 1 M

1. Determinar los gramos requeridos de NaOH para preparar 200 mL de NaOH 1M.

2. Pese el NaOH requerido y colocarlo en un vaso de precipitado de 500 mL para su disolución con agua destilada (aprox. 150 mL).

3. Colocar la disolución en un matraz volumétrico de 200 mL y aforar con agua destilada.


Nota: Los ácidos y los álcalis son agentes corrosivos. Extreme precauciones para su manejo, evite todo el contacto con la piel y ojos.

Preparación de 100 mL de una disolución de NaOH 25 mM a partir de la disolución de NaOH 1M

Aplicar la fórmula C1 x V1 = C2 x V2 para calcular los mL de NaOH 1 M necesarios para preparar 100 mL de una disolución de NaOH 25 mM

V1= (C2 x V2)/ C1 Donde: C1= Concentración inicial

V1= Volumen inicial

C2= Concentración final

V2= Volumen final

Medir el volumen requerido de NaOH 1M con una pipeta y colocarlos en un matraz volumétrico de 100 mL y aforar con agua destilada.

III. Disoluciones de Concentración Normal

Preparación de HCL 1N

1. Conocer la concentración del HCL concentrado comercial.

2. Calcular la cantidad de HCL conc. requerido para preparar 50 mL de HCl 1N.

3. Colocar el agua destilada (aprox. 30 mL) en un vaso de precipitado.

4. Con cuidado agregar poco a poco la cantidad de HCL concentrado requerido.

a. Nota: Siempre se agrega el ácido al agua nunca el agua al ácido.

5. Agitar en la placa de agitación

6. Colocar la disolución en un matraz volumétrico de 50 mL y aforar con agua destilada.


TEMAS A DEMOSTRAR

Cálculos estequiométricos

RESULTADOS

Desarrollar los cálculos que realizaron para preparar las soluciones.

Concluya la importancia de los diferentes procesos para preparar soluciones.


PRACTICA NO. 2

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR LA TÉCNICA DE BRADFORD

OBJETIVO

Por medio de la siguiente práctica el alumno será capaz de elaborar una curva de calibración para cuantificar la concentración de una proteína.

INTRODUCCIÓN

Las moléculas proteicas se organizan de manera característica en distintos niveles. El nivel primario es la secuencia de aminoácidos, dictada por el gen. Esta secuencia a su vez determina el plegamiento local (estructura secundaria, el plegamiento global (estructura terciaria) y la organización en estructuras de múltiples subunidades (estructura cuaternaria).

Para la cuantificación de estas moléculas existen diversos métodos los cuales se basan en a) la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV, b) para la formación de derivados químicos, o c) la capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos colorantes.

Dentro de la unión a colorantes específicos la cuantificación proteica por Bradford se basa en la unión del Coomassie Brillant Blue G-250 a moléculas de proteína en pH ácido produciendo un cambio de color de rojo-café a azul, que presenta un máximo de absorbancia a 595 nm.

La interacción del Coomassie se ha demostrado con residuos de arginina y muy levemente con cisteína, lisina, tirosina, triptófano y residuos de fenilalanina. Debido a que la respuesta


de color no es lineal en un amplio intervalo de concentración, es recomendable correr una curva estándar.

MATERIALES

Reactivo de Bradford

Disolver 100 mg de Coomassie B-Blue G-250 en 50 mL de etanol por agitación con un magneto, cuando este perfectamente disuelto adicionar 100 mL de ac.fosfórico 85% y aforar a un 1Lt CUIDADO!!! (ácido + agua)

Filtrar con papel (Listo para ser empleado).

Almacenar a temperatura ambiente.

Agua

Albúmina

Celdas para luz visible

PROCEDIMIENTO

Elaboración de curva patrón

1. A partir de una alícuota de proteína de aproximadamente 4 mg/mL (C1), realizar las diluciones necesarias para tener alícuotas de 500 uL con las siguientes concentraciones (0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 mg/mL)

Conc. mg/mL

C2

µL apartir de la alícuota de 4mg/mL

V1

µL de agua

C1

Volumen final

500 µL

V2

0.05

0.1

0.2

0.3

0.4


2. Para la cuantificación, se realizara, cada determinación por duplicado.

3. Marcar para cada concentración 2 tubos

Adicionar 100 µL de la proteína de cada una de las concentraciones conocidas

4. Incluir un par de tubos sin muestra, intercambiar por agua (será el control)

5. Adicionar 1 mL de reactivo

6. Incubar por 5 minutos a temperatura ambiente

7. Determinar absorbancia a 595 nm

Información Adicional

Verificar que el material empleado se encuentre perfectamente limpio ya que concentraciones muy bajas de detergentes pueden interferir en la reacción.

Sustancias compatibles con Bradford NaCl, MgCl, KCl, (NH4)2SO4, Etanol

Sustancias incompatibles con Bradford: Tris 2 M, Ac. Acético, 2-Mercaptoetanol 1 M, Sacarosa 1 M, Glicerol 99 %, EDTA 0.1 M,

Triton X-100 ≧ 0.1 %, SDS 1 %, Hemosol ≧ 0.1 %

TEMAS A DEMOSTRAR

Caracterización de macromoléculas

RESULTADOS

Graficar la concentración de proteína (mg/mL) en el eje X y lectura de absorbancia (595nm) eje Y.

Utilizando el programa Excel, realizar una regresión lineal de los datos y determinar la curva estándar para cuantificar.


PRACTICA NO. 3 ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA DESNATURALIZANTES SDS‐PAGE

OBJETIVO

Conocer los principios y aplicaciones de la electroforesis.

INTRODUCCIÓN

La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas (proteínas o ácidos nucleícos) según la movilidad de estas en un campo eléctrico a través de una matriz porosa, la cual finalmente las separa por tamaños moleculares y carga eléctrica, dependiendo de la técnica que se use. Los ácidos nucleícos ya disponen de una carga eléctrica negativa, que los dirigirá al polo positivo, mientras que las proteínas se cargan con sustancias como el SDS (detergente) que incorpora cargas negativas de una manera dependiente del peso molecular. Para la separación se usa un gel de agarosa o poliacrilamida (fibras cruzadas, como una malla). Al poner la mezcla de moléculas y aplicar un campo eléctrico, éstas se moverán y deberán ir pasando por la malla, por la que las pequeñas se moverán mejor, más rápidamente. Así, las más pequeñas avanzarán más y las más grandes quedarán cerca del lugar de partida.

Por lo general para caracterizar la molécula se determina la velocidad a la que esta se mueve en un campo eléctrico y se utiliza para determinar el peso molecular en el caso de


proteínas o para detectar cambios de aminoácidos y separar cuantitativamente distintas especies moleculares.

MATERIALES

Soluciones proteicas

Marcadores de peso molecular

Fuente de poder

Cámara de electroforesis

Puntas de micropipeta

Papel absorbente

Soluc. Azul de Coomasie (tinción) (tabla anexa)

Soluc. PAGE-SDS (Tabla anexa)

PROCEDIMIENTO

Preparación del gel de corrimiento (10%)

1. La preparación del gel de separación se efectúa de acuerdo

a la tabla anexa

2. Una vez polimerizado en el portagel, lavarlo y eliminar el

exceso de agua usando tiras de papel Whatman.

3. Preparar el gel de concentración (stacking gel) de acuerdo a

la tabla anexa.

4. Una vez llena la cámara, colocar el peine evitando la

formación de burbujas.

5. Una vez polimerizado el gel, lavarlo con agua destilada y

llenarlo con buffer de corrimiento (running buffer).


6. Resuspender la buffer muestra en proporción 1:4 (si es

necesario agregar más azul de bromofenol y glicerol).

7. Colocar las muestras y marcadores de peso molecular en los

carriles correspondientes.

8. Fijar las condiciones de corrimiento en 60 V hasta que entre la

muestra al gel de separación, una vez dentro, cambiar a 100-

120 V (2 h) y vigilar que las muestras no salgan del gel.

9. Desprender cuidadosamente el gel de los vidrios dividir el gel.

10. Teñir el gel utilizando Coomassie Blue, de acuerdo al

protocolo anexo.

11. Calcular el peso molecular de las proteínas problema.

TEMAS A DEMOSTRAR


RESULTADOS

1. Determinación de la aparente masa molecular de las proteínas

2. Mida la distancia total del principio al fin del gel de corrido

3. Mida la distancia del origen a cada uno de los estándares de peso molecular

4. Mida la distancia de la proteína desconocida (X)

5. Para cada banda calcula la movilidad relativa: a / total, b / total

6. Ejemplo a = 0.5cm, total = 4.9cm. 0.5/4.9 = 0.1

7. Calcular el logaritmo del peso molecular de cada estándar


8. Hacer una grafica del log pM contra la movilidad relativa de los estándares

9. Localizar la movilidad relativa de la proteína de la proteína desconocida, extrapolando el log PM correspondiente y calcular el antiligaritmo.

MOVILIDAD

LOG

MW


ANEXO

Preparación del Gel y Reactivos para la Electroforesis en Geles de SDS-Poliacrilamida (SDS-PAGE) (Laemmli)

A) Acrilamida/Bis (30% T, 2.67%C)

Acrilamida 146.0 g

N’N Bismetilenacrilamida 4.0 g

500 mL de agua destilada. Filtrar, guardar a 4°C en la obscuridad. Vida media 30 días.

B) 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8

Tris base 54.45 g

Agua destilada 150 mL

Ajustar el pH 8.8 con HCl 1.0 N. Aforar a 300 mL con agua destilada. Almacenar a 4 °C

C) 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8

Tris base 6.0 g

Agua destilada 60 mL

Ajustar el pH 6.8 con HCl 1.0 N. Aforar a 100 mL con agua destilada y almacenar a 4°C.

D) 10% (w/v) SDS

Disolver 10 g de SDS en agua destilada, agitar suavemente y aforar a 100 mL

E) 10% (w/v) Persulfato de Amonio


100 mg de sulfato de amonio. Adicionar 1 mL de agua destilada, preparar en el momento.

F) Buffer de corrimiento (5x), 25 mM Tris, 192 mM Glicina, 1% de SDS, pH 8.3

Tris base 45.0 g

Glicina 216 .0 g

SDS 15.0 g

No incluir el SDS cuando se requiera hacer corrimiento bajo condiciones nativas (PAGE).

Aforar a 3 L con agua destilada. No ajustar el pH con acido o base. Almacenar a 4°C. Calentar a 37°C antes de usar en caso de precipitación.

G) Buffer muestra

Agua destilada 4.4 mL

0.5 M Tris-HCl pH 6.8 1.0 mL

Glicerol 0.8 mL

10 % SDS 1.6 mL

0.5 (w/v) azul de bromofenol en agua

0.2 mL

Diluir la muestra por lo menos 1:4 con el sample buffer.

*Si el gel fuese en condiciones desnaturalizantes y reductoras, se deberá adicionar 0.4 mL al buffer muestra de beta-mercaptoetanol y posteriormente de diluir 1:4 habrá que calentar las muestras a 95 °C por 4 min.

*Cuando son condiciones nativas (PAGE) omitir SDS,


H) Preparación de PAGE-SDS 10%

Volúmenes requeridos para dos placas del sistema Mini-Gel BioRad MR

Gel Separador (Separating) (10 mL)

Agua destilada

4.0 mL


Acrilamida 3.3 mL

10 % SDS 0.1 mL

Persulfato de amonio 10% 0.1 mL

Temed 0.004 mL

Gel Concentrador (Stacking) (4mL)

Agua destilada

2.7 mL


Acrilamida 0.67 mL

10 % SDS 0.04 mL

Persulfato de amonio 0.10 mL

Temed 0.004 mL


PRACTICA NO. 4 TINCIÓN DE GELES DE POLIACRILAMIDA POR COOMASSIE BLUE

OBJETIVO

El alumno evaluara el proceso para la detección de proteínas en gel.

INTRODUCCIÓN

Las proteínas que se han separado en un gel de poliacrilamida (o otros soportes) pueden ser detectadas por diferentes métodos, entre los que destacan los colorantes y la tinción con plata.

La tinción de azul de coomassie permite detectar hasta o.2 a 0.6 µg de proteína y es cuantitativo (lineal) hasta 15 a 20 µg. Se utilizan principalmente solventes como metano y ácido acético para fijar las proteínas.

Dentro de las diversidad de técnicas que existen podemos mencionar también la tinción con Plata que aunque es más sensible el proceso suele ser más tardado y más caro.

El uso de la tinción por Comassie tiene dentro de sus bondades bajo costo y rapidez.

MATERIALES

Coomassie Blue-R250 al 0.1%

Disolver 0.1 g en solución de desteñido, dejar a temperatura ambiente hasta el siguiente día, agregar el agua. Filtrar siempre antes de su uso.


Solución A Solución de fijado / desteñido (Metanol 50%, Ac. Acético 10%)

Recipientes plásticos o de vidrio

PROCEDIMIENTO

1. Sumergir el gel por 10 minutos en solución A.

2. Teñir con la solución de Coomassie.

3. Desteñir con la solución A hasta que se observen las bandas.

4. Enjuagar con agua destilada.

5. Documente su gel fotograficamente

TEMAS A DEMOSTRAR


RESULTADOS

Determine la pureza de sus muestras, así como el tamaño de las bandas proteicas obtenidas

Defina otras metodologías para tinciones electroforéticas mencionando el rango de sensibilidad así como bondades y deficiencias en comparación a la tinción con azul de comassie.


PRACTICA NO. 5 EXTRACCIÓN DE DNA UTILIZANDO DNAZOL

OBJETIVO

Por medio de la siguiente práctica el alumno será capaz de extraer DNA, partiendo de tejido de tipo animal o vegetal, a través de esta práctica el alumno pondrá en práctica los conocimientos adquiridos en clase para el manejo y almacenamiento del DNA.

INTRODUCCIÓN

La doble cadena de DNA está compuesta de potenciales grupos reactivos que están arreglados dentro de una hélice central unida a través de enlaces de puente de hidrógeno. Estas pares de bases están protegidas por azucares y fosfatos los cuales están unidos internamente por fuerzas superiores.

A pesar de su estabilidad química el DNA es físicamente frágil, para su extracción a través de células o tejidos es necesaria Proteinasa K en presencia de EDTA y una solubilización de membranas y desnaturalización de proteínas con un detergente como SDS. Los ácidos nucleicos pueden ser purificados a través de extracciones con solventes orgánicos y ser aplicados a una infinidad de técnicas desde análisis de southern blot, como templado en reacciones en cadena de la polimerasa y construcción de librerías genómicas entre otros.

MATERIALES

Material Biológico


DNAzol

Puntas, micropipetas, microtubos

PROCEDIMIENTO

1. Lisis celular adicionar 0.75-1mL de DNAzol

Células crecidas en monocapa 10cm 2 de cultivo

Suspensión celular 1-3 x 10 7

Tejidos 25-50 mg

2. Mezclar por homogenización, si se trata de tejidos, habrá que fragmentar en porciones pequeñas, previo a la homogenización.

3. Sedimentar el homogenizado por centrifugación por 10 min a 10 000 x g a una temp. ambiente o 4 °C. Transferir la fase sobrenadante a un tubo nuevo.

4. Precipitación.- Precipitar el DNA por adición de 0.5 mL de Etanol al 100% por mL de DNAzol. Mezclar por inversión y mantener a temperatura ambiente por 1-3 min. El DNA puede ser visible como una nube precipitante. Si es probable, enroscar las hebras de DNA con la ayuda de la punta de una pipeta (Si es que es visible) y transferir a un tubo nuevo. Si tenemos pequeñas cantidades, centrifugar a 4000 x g por 1-2 min a temp. ambiente o 4 °C y retirar el sobrenadante.

5. Lavado del DNA.- Lavar el DNA precipitado 2 veces con 0.8-1.0 mL de etanol al 75% por inversión del tubo 3-6 veces. Mantener los tubos en posición vertical por 1-2 min para sedimentar el DNA y remover el etanol por pipeteo o decantación.

6. Resuspender el DNA en un pequeño volumen de agua destilada.

7. Evaluar calidad y concentración


8. Almacenar el DNA a -20 ºC hasta su cuantificación y corrimiento electroforético.

TEMAS A DEMOSTRAR

Caracterización de los ácidos nucleícos

RESULTADOS

Determine como puede interferir la presencia de proteínas en la muestra.

Investigue en caso de tener proteínas en la muestra de DNA que proceso utilizaría para poder purificarla?

Que características le da si obtiene una relación de absorbancia 260/280 = 1.9?


PRACTICA NO. 6 EXTRACCIÓN DE DNA UTILIZANDO FENOL CLOROFORMO ALCOHOL ISOAMILICO

OBJETIVO

Evaluar el aislamiento de DNA a partir de extracciones con solventes.

INTRODUCCIÓN

El DNA puede ser aislado de diferentes formas dependiendo si es cromosomal o extracromosomal, para su purificación se requiere de debilitar la pared bacteriana por congelación y descongelación o por tratamiento con lizosima y agentes quelantes como EDTA.

La lisis celular tanto de procariotes como eucariotes, se realiza con la adición de detergentes, como el dodecil sulfato de sodio (SDS). Después de la lisis se degrada el RNA y las proteínas con ribonucleasa pancreatíca y proteasa. Las proteínas se extraen con solventes orgánicos como fenol, debido a que este solvente permite su desnaturalización y su concentración en la fase orgánica, en tanto que el DNA es recuperado de la fase acuosa y precipitado con etanol.

MATERIALES

Material Biológico


Buffer de Lisis ( Tris 0.1M pH 8.0, EDTA 0.1M, NaCl 0.15 M, 2% β-mercaptoetanol, 4% L-Sarkosil)

Proteasa (10 mg/mL)

RNAsa (10mg/mL)

Fenol cloroformo alcohol isoamilico 24:25:1

Acetato de sodio 3M pH 5.4

Etanol absoluto

Etanol al 70%

Agua destilada estéril

TE pH 8.0

PROCEDIMIENTO

1. Colocar una muestra de tejido finamente cortado aproximadamente 10 mg de tejido en tubos eppendorf de 1.5 mL

2. Adicionar 500 μL de Bufer de lisis y 3 μL de proteinasa

3. Incubar durante 1 hr a 37ºC. Vortex cada 30 min

4. Adicionar 3 μL de proteinasa e Incubar durante 1 hr a 37ºC. Vortex cada 30 min

5. Adicionar 500 μL de Fenol Cloroformo Alcohol Isoamilico 25:24:1

6. Mezclar por inversión

7. Centrifugar a 14 rpm durante 10 min a 4ºC

8. Colectar el sobrenadante y colocarlo em um tubo eppendorf nuevo

9. Adicionar 2 volúmenes de etanol absoluto previamente enfriado a -20ºC.


10. Mezclar por inversión, adicionar 1/10 del volumen de acetato de sodio 3M

11. Incubar a -20 ºC durante 10 min.

12. Centrifugar a 14 000 rpm durante 20 min a 4ºC

13. Decantar el sobrenadante

14. Lavar el pellet con 250 μL de alcohol al 70 % previamente enfriado a -20º

15. Dejar secar por inversión

16. Resuspender el pellet en 50 μL de agua estéril o buffer TE

TEMAS A DEMOSTRAR

Caracterización de ácidos nucleícos

RESULTADOS


PRACTICA NO. 7 EXTRACCIÓN DE RNA

OBJETIVO

Por medio de la siguiente práctica el alumno será capaz de extraer RNA de tejido, y pondrá en práctica los conocimientos adquiridos en clase para su manejo y almacenamiento.

INTRODUCCIÓN

Una típica célula de mamíferos contiene aproximadamente 10 -5 µg de RNA, 80-85% del cual es ribosomal. El remanente 15-20% consiste de RNAs de bajo peso molecular (RNAs de transferencia y pequeño nuclear). Estos RNAs abundantes han sido determinados en tamaño y secuencia, y pueden ser aislados por electroforesis, centrifugación a través de gradientes de densidad, o cromatografía de intercambio iónico. En contraste con el RNA mensajero, el cual se encuentra entre el 1 al 5 % del total del RNA celular.

La clave para poder extraer un RNA intacto es dada a través de la inactivación del RNAsa, muchos métodos, utilizan para la purificación fuertes agentes desnaturalizantes como tiocionato de guanidina para disruptar las células, solubilizar sus componentes y desnaturalizar simultáneamente RNAsas endógenas.

La técnica más utilizada fue descrita por Chomczynski and Sacchi en 1987, en la cual el tiocianato de guanidina es extraído utilizando solventes como fenol cloroformo. Lo cual genera una segunda fase orgánica en la cual el DNA y las proteínas son extraídos liberando en RNA en la fase sobrenadante. El RNA puede ser precipitado utilizando


Isopropanol y purificado por cromatografía o utilizado como tal para análisis de hibridación tipo Northen Blot, transcripción reversa o transcripción reversa-PCR

MATERIALES

Tejido fresco

Estuche de disección, tubos eppendorf,

Trizol, Agua tratada con DEPC,

Homogenizadores

PROCEDIMIENTO

1. Cuidadosamente con ayuda de un equipo de disección, extraer el tejido a utilizar no contaminar con otro tejido, y de ser posible enjuagar con agua DEPC.

2. Fragmentar el tejido, pesar y colocar en un tubo

3. Mezclar 10 mg de tejido con 0.75 mL de trizol, homogenizar la muestra e Incubar el homogenizado por 5 min a temperatura ambiente (En este paso la muestra puede ser almacenada a -80 ºC).

4. Adicionar 0.2 mL de cloroformo por cada 0.75 mL de Trizol, mezclar vigorosamente con la mano por 15 seg e incubar a temperatura ambiente por 2-15 min. Centrifugar la muestra a no más de 12,000 x g por 15 min a 4 ºC.

5. Transferir la fase acuosa a un tubo limpio, libre de RNAsas.

6. Precipitar el RNA por adición de 0.5 mL de isopropanol por cada 0.75 mL de Trizol, e incubar a 4 ºC por 10 min.

7. Centrifugar a no más de 12,000 x g, por 10 min a 4 ºC. El RNA precipitara formando una especie de gel, en la parte inferior del tubo

8. Remover el sobrenadante. Lavar el pellet con 1 mL de EtOH al 75%


9. Centrifugar a no más de 7500 x g por 5 min a 4 ºC

10. Secar el precipitado de RNA por 5 -10 min

11. Disolver el RNA en 50 µL de agua libre de RNAsas, por mezcla con la pipeta o incubando por 10 min a 55-60 ºC.

12. Almacenar el RNA a -80 ºC hasta su cuantificación y corrimiento electroforético.

TEMAS A DEMOSTRAR


RESULTADOS

Determine la calidad y concentración del ácido nucleícos

Investigue que efecto tiene la solución DEPC dentro del proceso de aislamiento de RNA

Mencione que tipos de RNA existen en un tejido


PRACTICA NO. 8 CUANTIFICACIÓN DE RNA Y DNA

OBJETIVO

El alumno será capaz de determinar la concentración de DNA y RNA por espectroscopia.

INTRODUCCIÓN

Medir la concentración de ácidos nucleicos de alto peso molecular es difícil, cuando se trata realizar a través de métodos estándares. Esto es debido a que la solución de DNA es usualmente viscosa, el problema se minimiza al realizar diluciones de la muestra en buffer TE pH 8.0 y mezclando vigorosamente. La absorbancia puede ser determinada a 260 y 280 nm.

Una solución con una A260 de 1 contiene aproximadamente 50 µg de DNA/mL en tanto que para DNA de simple cadena o RNA A 260 equivale a un coeficiente de 38 µg de RNA/mL.

MATERIALES

DNA, RNA

Buffer TE o agua

PROCEDIMIENTO

1. Colocar 1 µL del ácido nucleícos a cuantificar y diluir con 89 µL de agua. Mezclar bien.

2. Ajustar a 0.0 la lectura del espectrofotómetro a 260 y 280 nm con agua.


3. Leer la absorbancia de la solución a 260 y 280 nm.

4. Utilizar la relación de 50 µg/mL de DNA= 1 unidad de absorbancia a 260 nm y calcular la concentración y pureza del DNA, en base a los principios estudiados en clase.

5. Utilizar la relación de 40 µg/mL de RNA= 1 unidad de absorbancia a 260 nm y calcular la concentración y pureza del RNA, en base a los principios estudiados en clase.

TEMAS A DEMOSTRAR


RESULTADOS

Evalue los datos obtenidos y reporte


PRACTICA NO. 9 ELECTROFORESIS DE DNA EN GELES DE AGAROSA

OBJETIVO

Analizar por electroforesis la calidad del DNA extraído.

INTRODUCCIÓN

Los ácidos nucleícos pueden ser sujetos a técnicas electroforéticas a través de geles de agarosa que pueden ser detectados por tinción y visualización por iluminación con 300 nm de luz U.V. Los métodos de tinción y visualización del DNA más utilizados son bromuro de etidio y SYBR Gold.

El bromuro de etidio fue sintetizado en los años 50´s en un esfuerzo para desarrollar fenantridina como un efectivo agente tipanocidal. Puede ser utilizado para la detección de ácidos nucleícos de simple y doble cadena.

MATERIALES

DNA

Buffer de corrida TAE Tris-Acetato EDTA (acetatos 0.04M, EDTA 0.01M, pH 8.0)

Agarosa

Buffer muestra

Estándares de Peso molecular 1 Kb ladder

Bromuro de etidio 1 mg/mL en agua

Cámara de electroforesis


Transiluminador de UV

Cámara fotográfica polaroid

PROCEDIMIENTO

1. Preparar una solución de agarosa al 1% en buffer TAE. Disolver por calentamiento cuidando que no ebulla rápidamente y se derrame del matraz.

2. Una vez disuelta dejar que se enfrié y vaciar en la placa de la unidad de electroforesis. Esperar a que solidifique.

3. Colocar el gel en la unidad de electroforesis horizontal. Agregar el buffer lentamente hasta cubrir el gel.

4. Cargar las muestras en los pozos del gel.

5. Conectar los electrodos a la fuente de poder.

6. Correr el gel en las condiciones indicadas; esto depende del tamaño del gel ya que alto voltaje puede ocasionar que la agarosa se disuelva (en este caso 100 Volts constantes).

7. Fotografiar el gel utilizando película instantánea y un transiluminador de luz ultravioleta (usar lentes de seguridad).

8. Analizar los resultados del gel. Estime los tamaños de los fragmentos de acuerdo a la migración de los estándares y las muestras.

TEMAS A DEMOSTRAR


RESULTADOS


PRACTICA NO.10 ELECTROFORESIS DE RNA EN GELES DE AGAROSA‐FORMALDEHIDO

OBJETIVO

Determinar la calidad del RNA aislado anteriormente

INTRODUCCIÓN

Después del aislamiento de la muestras de RNA, la calidad de la preparación aislada del RNA es evaluada por electroforesis en gel de agarosa. Aunque los resultados son principalmente cualitativos, se consigue información de la calidad del material. Dicho análisis deberá de realizarse en condiciones desnaturalizantes dado que el RNA tiende a formar extensivamente estructuras secundarias, lo cual dificulta su migración.

Un RNA intacto en un gel desnaturalizante deberá observarse como un barrido donde encontraremos las bandas 28S y 18S rRNA (en muestras eucariotas). La subunidad 28S rRNA puede ser aproximadamente el doble de intensa que la 18S rRNA. Este ratio 2:1 (28S:18S) es un indicativo que el RNA esta intacto.

MATERIALES

Buffer 10X MOPS/EDTA: MOPS 0.2 M, acetato de sodio 50 rnM, EDTA 10

mM, pH 7.0 Yesterilizada en autoclave.


Buffer muestra para RNA: 0.75 mI de formamida desionizada, 0.15 mI de MOPS lOX, 0.24 mI de forma1dehido,0.1 mI de agua tratda con DEPC, 0.1 mI de glicerol, 0.08 mI de azul de bromofenol al 10.% (p/v)

Agarosa

Estándares de tamaños conocidos

Cámara para electroforesis horizontal

Fuente de poder

Cámara fotográfica polaroid

PROCEDIMIENTO

1. Preparar un gel al 1% de agarosa en buffer MOPS IX libre deRNAsas. Para un volumen de 50 mI pesar 0.5 g de agarosa, agregar 43.5 mI de agua tratada con DEPC y 5 mI de buffer MOPS 10X en un matraz erlenmeyer libre de RNAsas.

2. Calentar en el microondas cuidando que no ebulla rápidamente y se tire del matraz.

3. Enfriar la solución hasta 55°C y agregar 2.05 mI de formaldehido al 37%, mezclar suavemente evitando la formación de burbujas y vaciar a la placa libre de RNAsas. (Hacer este paso en la campana de humos, el formaldehido es tóxico.

4. Esperar 1 h antes de usar el gel.

5. Preparación de la muestra: Calcular el volumen necesario para cargar 5-10 µg de RNA en el gel. Añadir por lo menos 1 vol igual de buffer muestra. Lo ideal es tener 5 vol de buffer muestra/vol de muestra. Calentar a 65°C por 15 min y colocar en el hielo.

6. Colocar buffer MOPS IX en la cámara de e1ectroforesis.El nivel del buffer debe de cubrir ligeramente el gel.


7. Agregar 1-5 µl de la solución de bromuro de etidio (1.0 mg/mL) a cada muestra y cargar la muestra en el gel. Nota: antes de cargar las muestras, lave los pozos con el buffer de corrida.

8. Conectar a la fuente de poder. Nota: Este tipo de electroforesis genera mucho calor y afecta el buffer de corrida ocasionando cambios de pH y por lo tanto migraciones anómalas. Si va correr geles geles grandes, se recomienda recircular el buffer y utilizar un sistema de enfriamiento.

9. Correr la electroforesis en las condiciones adecuadas de acuerdo al tamaño del gel. Seguir la migración del azul de bromofenol hasta aproximadamente 75% del gel.

10. Visualizar las bandas con luz UV y tomar la fotografía.

11. Determinar los tamaños de las bandas más abundantes.

TEMAS A DEMOSTRAR


RESULTADOS


PRACTICA NO. 11 SÍNTESIS DE CDNA

OBJETIVO

Por medio de esta práctica el alumno será capaz de sintetizar in vitro DNA complementario a partir de RNA.

INTRODUCCIÓN

La mezcla de RNAmensajero o bien RNA total se utiliza como molde para sintetizar una cadena de DNA complementario mediante una polimerasa dependiente de RNA, la transcriptasa inversa. Para la reacción se necesita de un cebador y se aprovecha la presencia de la cola de Poli A en el lado 3´del mRNA eucariotico.

Tras la síntesis del cDNA se desnaturaliza el hibrido. El extremo 3´forma una horquilla que sirve como cebador para la síntesis de la segunda cadena, lo cual en este caso pueda darse por medio de un fragmento de Klenow como en la transcriptasa inversa.

MATERIALES

RNA problema

Oligo dt 50 mM

dNTP´s 10 mM

Buffer RT 10X

MgCl2 25 mM

DTT 0.1 M

RNAse OUT 40U


RNAsa H

SuperScript 200U

Microtubos

Incubadora

PROCEDIMIENTO

1. Mezlcar los siguientes componentes

RNA 5 µg

Oligo (dt) 50 µM 1µl

dNTP´s 10 mM 1 µl

Llevar con agua DEPC a 10 µl

2.-Incubar a 65ºC por 5 min, y mantener en hielo por 1 min

3.-Preparar la siguiente mezcla, adicionando los componentes en el orden indicado.

10X RT Buffer 2 µl

25 mM MgCl2 4 µl

0.1 M DTT 2 µl

RNAse out(40U /µl) 1 µl

Super Script III RT (200U/ µl) 1 µl

4.-Adicionar 10 µl de la mezcla de cDNA síntesis al tubo de reacción mezclar suavemente y colectar por centrifugación.

5.-Incubar a 50 ºC por 50 min.

6. Terminar la reacción por incubación a 85 ºC por 5 min, y mantener en hielo.

7. Colectar la reacción por centrifugación. Adicionar 1 µL de RNAsa H a cada tubo e incubar por 20 min a 37 ºC.

8. La síntesis puede ser almacenada a -20 ºC. o ser utilizado inmediatamente para PCR.


TEMAS A DEMOSTRAR

Transcripción in vitro de RNA

RESULTADOS

Probar la síntesis de CDNA por PCR

Defina la importancia de realizar un ensayo de RT-PCR a un gen problema?

Se requiere de esta técnica para diagnostico molecular de enfermedades como Dengue, o virus del nilo?

Porque?


PRACTICA NO. 12 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

OBJETIVO

Por medio de la siguiente práctica el alumno será capaz de amplificar segmentos específicos de DNA mediante PCR

INTRODUCCIÓN

Es una de las técnicas más utilizadas en el campo de la biología molecular. Este método fue propuesto a mediados de los años 70’s por Ghobind Khorana, sin embargo no su puso en marca pues Polimerasas termoestables no habían sido descritas y la síntesis de oligonucleótidos era más que un arte de la ciencia. Sin embargo la técnica fue puesta en práctica 15 años más tarde por Kary Mullis, quien describió la amplificación in Vitro de una copia de genes de mamífero usando polimerasa Klenow. PCR es una técnica rápida y flexible, que permite la amplificación del DNA, este interactivo proceso requiere de tres elementos como desnaturalización del templado por calor, alineación de los oligonucleótidos a las secuencias blanco de DNA y extensión de los primers alineados por una termoestable DNA polimerasa.

MATERIALES

50 mM MgCl2

Taq Polimerasa 2U/µL

10 mM dNTP’s


20 mM Primer Sentido y Antisentido

DNA

Agua estéril

Termociclador

Tubos para PCR

Pipetas

PROCEDIMIENTO

1. En un microtubo de 0.2 mL para PCR, adicionar todos los

reactantes, mezclando con el agua perfectamente.

DNA10ng X µL

MgCl2 50 mM * 1.5 µL

dNTPS 10 mM* 1.0 µL

P. Sentido 20 mM 1.0 µL

P. Antisentido 20 mM 1.0 µL

Taq Polimerasa 2U/µL* 1.0 µL

Agua X µL

Volumen final 25 µL

*Si se cuenta con master mix 2X Promega, estos reactivos pueden

sustituirse por 12.5 µL de la muestras.

2. Colocar los tubos en la centrifuga y dar un pulso

3. Calentar los tubos a 95 °C por dos minutos

4. Correr las reacciones bajo el siguiente programa:

5. 94°C por 45 seg, T.M de los primers por 1 min y 68°C por 2 min,

durante 30 ciclos, programar una extensión final a 68°C durante 10

min y por ultimo mantener la reacción a 4°C.

6. Para estimar el producto de la reacción examinar 5 µL en un gel de

electroforesis de agarosa al 2%


7. Fotografiar el gel con ayuda de un transilumnidar

8. Estimar el producto de la reacción de PCR comparando la

intensidad de las bandas con el marcador de peso molecular

utilizado en la electroforesis.

TEMAS A DEMOSTRAR

Amplificación del DNA

RESULTADOS

Determine los productos de amplificación

Explique su gel de electroforesis

Calcule los tamaños de sus bandas


PRACTICA NO. 13 AISLAMIENTO DE UN FRAGMENTO DE DNA A PARTIR DE UN SOPORTE SOLIDO

OBJETIVO

El alumno utilizara sus conocimientos y adiestramiento en técnicas de biología molecular para recuperar un fragmento de DNA partir de un gel electroforético.

INTRODUCCIÓN

La purificación de bandas requiere el uso nde agentes caotropicos que desnaturalizan las proteínas, disuelven la agarosa y promueven la unión de DNA de doble cadena (100 bp a 48 kb)a una matriz de vidrio. Una vez que el DNA es capturado, proteínas y sales contaminantes son lavadas y el DNA purificado es eluido en un buffer de baja fuerza iónica (TE o agua).

MATERIALES

Buffer de captura*, Buffer de lavado*, Columnas para purificación de DNA*

Baños de agua, Incubadora, Pipetas, Microtubos

*Componentes del Kit Ilustra GFX PCR DNA and gel elute GE MR

cat 27-9602-01.

PROCEDIMIENTO

Pesar un microtubo limpio y estéril.


Exponer el gel, rápidamente en el transiluminador y cortar con ayuda de una navaja limpia, la banda de interés, colocarla en el tubo, limpio y volver a pesar. Por diferencia de pesos determinar el peso real de la banda.

De acuerdo al peso estimado, adicionar 300 µL de buffer de captura por cada 300 mg de gel.

Cerrar el tubo, mezclar vigorosamente e incubar a 60 °C por 5-15 min, hasta que la agarosa se haya disuelto.

Transferir la muestra a una columna de purificación e incubar por 1 min.

Centrifugar por 30 seg a 10´000 rpm, descartar el buffer centrifugado.

Adicionar a la columna 500 µL de buffer de lavado, centrifugar por 30 seg a 10´000 rpm

Colocar la columna en un tubo limpio y adicionar agua estéril para la elusión 50 µL, para eluir el DNA en forma concentrada, disminuir el volumen de agua a no menos de 10 µL

Incubar la muestra a temperatura ambiente por 1 min

Centrifugar por 30 seg a 10´000 rpm para recuperar el DNA purificado.

TEMAS A DEMOSTRAR

Aislamiento de DN A

RESULTADOS

Describa sus observaciones

Que características físicas y químicas tiene la agarosa que permite purificar DNA?

Investigue el material y principio de las columnas que se utilizan en estos procesos?


Porque este tipo de técnicas no pueden utilizarse para otras moléculas como proteínas?


PRACTICA NO. 14 LIGACIÓN DE PRODUCTOS DE PCR A UN VECTOR DE CLONACIÓN

OBJETIVO

Obtener un DNA recombinante mediante el proceso de ligación del material genético a un vector de clonación.

INTRODUCCIÓN

La tecnología del DNA recombinante es un campo relativamente extenso de la Biología molecular que ha permitido realizar grandes avances en el conocimiento de la estructura y función del material hereditario. Comprende un conjunto de técnicas que permiten realizar el análisis estructural y fisiológico de los elementos genéticos. Destacamos los diferentes pasos a seguir en un experimento de clonado de DNA por medio de plásmidos bacterianos.

Un experimento de clonado de DNA consiste, esencialmente, en extraer de un contexto genético y celular complejo, grande y poco conocido un fragmento de DNA de interés, y colocarlo en un contexto sencillo y bien conocido. Desde el punto de vista molecular, el DNA de interés se inserta en un vector., para llevar a cabo este proceso se requiere de la Ligación con DNA ligasa de los DNAs productos de una amplificación por PCR o de la digestión de un DNA. Éstos se mezclan y se les añade DNA ligasa. De este modo, se obtienen moléculas recombinantes integradas por el vector más un inserto.


. MATERIALES

Incubadora

Microtubos

Micropipetas

pGEM-T Vector (50ng/µL)*

Inserto (DNA ~4 ng/µL)

T4 DNA ligasa100U *

Buffer de ligación rápido 2X * * Reactivos contenidos en el Kit pGEM®-T Easy Vector System II Promega

A 1380.

PROCEDIMIENTO

1.-Centrifugar los tubos conteniendo el Vector rápidamente para mantener el contenido de estos en el fondo.

2.-Mezclar el buffer de ligación

3.- Realizar la mezcla de la siguiente forma:

Buffer de Ligación 2X 5µL

DNA ligasa 3U/µL 1µL

Vector pGEM 50 ng 1µL

DNA XµL

___________

10 µL

*Llevar a un volumen de 10µL con agua desionizada

4.- Mezclar la reacción por pipeteo e incubar por una hora a temp amb, alternativamente si se requiere obtener un número mayor de recombinantes incubar por toda la noche a 4ºC.

TEMAS A DEMOSTRAR

Tecnología del DNA recombinante

RESULTADOS Y CONCLUSIÓN


Documentar sus observaciones

Describa porque es importante mantener control de la temperatura, si la reacción se lleva a cabo por toda la noche?

Describa el modo de acción de las T4 DNA ligasas

Uno de los más estudiados y utilizados vectores para propósitos generales ha sido el llamado pBR322, dibuje el mapa genético del vector e identifique los elementos con que cuenta y para qué sirven.


PRACTICA NO. 15 PREPARACIÓN DE CÉLULAS QUÍMICAMENTE COMPETENTES

OBJETIVO

Elaborar células competentes utilizando CaCl2

INTRODUCCIÓN

Para los experimentos de DNA recombinante se requiere de la inserción del DNA a una célula hospedera. En bacterias el proceso de introducir DNA dentro de la célula es llamado transformación. Para E. coli uno de los métodos de transformación requiere que las células sean tratadas con un régimen de alta temperatura y cloruro de calcio (CaCl2).

El mecanismo de acción del CaCl2 es asumido que la pared de la célula bacteriana es fragmentado lo cual va a permitir que el DN A entre al interior de la célula, por ello se dice que son competentes. Para E. coli la competencia debe ser inducida, en tanto que para otras bacterias esto ocurre naturalmente y algunas veces puede ser inducido por el uso específico de medios de cultivo o condiciones de crecimiento. Para bacterias que son resistentes a la competencia química o no son naturalmente competentes, otros sistemas pueden ser utilizados, como la competencia por pulsos eléctricos (electroporación).

MATERIALES

Colonia de E. coli

Medio LB


CaCl2

Tubos Falcon de 50 mL

Todos los materiales y reactivos deben de estar en condiciones estériles.

PROCEDIMIENTO

1. Inocular una colonia de E. coli en 50 mL de medio LB, crecer durante toda la noche a 37ºC con agitación moderada (250rpm). Transferir la colonia en 100 mL de caldo LB o medio SOC en un matraz de 1 L. Incubar el cultivo por 3 hrs a 37ºC con vigorosa agitación, monitoreando la densidad óptica del cultivo a 600 nm. (Para una eficiente transformación, es esencial que el número de células viables no exceda de 10 8 cel/mL, lo cual en la mayoría de las E. coli es equivalente a una OD600 de 0.4.

2. Transferir las células a un tubo de 50 mL estéril y frio. Enfriar los cultivos a 0 ºC manteniéndolos en hielo 10 min.

3. Recuperar las células por centrifugación a 2700 g por 10 min a 4ºC.

4. Decantar el medio del pellet celular. Mantener los tubos en posición invertida sobre una toalla de papel por un minuto para evitar trazas del medio.

5. Resuspender el pellet en 30 mL de solución (MgCl2 80 mM, CaCl2 20 mM) fría.

6. Recuperar las células por centrifugación a 2700 g por 10 min a 4ºC.

7. Decantar el medio del pellet celular. Mantener los tubos en posición invertida sobre una toalla de papel por un minuto para evitar trazas del medio.

8. Resuspender el pellet en 2 mL de solución de CaCl2 0.1 mM fría, por cada 50 mL del cultivo original.


9. En este punto las células pueden ser utilizadas para transformación o bien almacenadas en alícuotas para su almacenamiento a -70 ºC.

10. Adicionar 34 μl de glicerol 100% v/v estéril a las alícuotas de 166 μl de la solución de células competentes, dando una concentración final de 17% de glicerol.

TEMAS A DEMOSTRAR


RESULTADOS Y CONCLUSIÓN

Documentar sus observaciones

Mencione 5 de las principales cepas de E. coli que se utilizan para los fines de transformación.

Desarrolle brevemente el principio de la electroporación y cuáles son las condiciones que se requieren para llevar a cabo dicho proceso.

Describa cuales son los puntos clave para que las células no pierdan eficiencia.


PRACTICA NO. 16 TRANSFORMACIÓN BACTERIANA EN E. COLI

OBJETIVO

El alumno evaluara el proceso de incorporar DNA extraño a una célula de E. coli.

INTRODUCCIÓN

La transformación es el proceso en el que las células procariontes toman DNA exógeno del ambiente, alterando a su fenotipo y el de sus descendientes. En general la entrada del DNA a las células es independiente de la fuente del DNA (o de sus secuencias), pero es muy dependiente del estado físico-químico del DNA (tamaño, hebra simple o doble, lineal o circular, relajado o superenrollado). La eficiencia con la que la célula blanco tima el DNA exógeno varía ampliamente entre especies procarióticas y dentro una especie, de las cepas. Algunas especies pueden ser manipuladas en el laboratorio para incrementar la eficiencia con la que toman el DNA. Las células pre-tratadas que toman el DNA más eficientemente se dice que son “competentes”.

El efecto que tiene el DNA al entrar en una célula blanco y en los descendientes depende completamente de la secuencia específica del DNA exógeno. El DNA exógeno pasará a la descendencia sólo si este se integra en el material genético de la célula blanco o si el mismo tiene un origen de replicación (ori), que funcione en la célula blanco. Transformaremos células de E. coli para demostrar la habilidad de este DNA para modificar permanentemente la herencia genética de las células que lo adquieren. Se transformará con un plásmido que


contiene su propio ori y un gen de resistencia a antibiótico. Las células blanco que adquieran el plásmido se transformarán, de un fenotipo sensible al antibiótico, a otro, resistente al antibiótico. Después de mezclase con el plásmido, encontraremos a las células resistentes al antibiótico sembrando las células tratadas sobre cajas de agar que contienen antibióticos. El antibiótico matará cualquier célula que no adquiero al plásmido.

MATERIALES

Medio LB

Reacción de ligación

Células competentes

Placas LB-agar

Antibiótico

IPTG

X-Gal

PROCEDIMIENTO

Nota: Es necesario trabajar con mucho cuidado para mantener la esterilidad y no contaminar las muestras.

1. Cada grupo tomará dos tubos con 200 μl de células competentes para la transformación. Los tubos deberán conservarse sobre hielo.

2. Adicionar 2 μl de la reacción de ligación sólo a uno de los tubos. Los dos tubos se incubarán 30 minutos sobre hielo. (El tubo al que se le agregó el DNA es el experimento y al que no se le agregó nada es el control negativo).

3. Colocar ambos tubos en un baño de agua a 42ºC por 90-120 segundos. Remover el tubo inmediatamente hacia el hielo e


incubarlo otros 5 minutos (Al finalizar este paso el DNA presente debió entrar en algunas células).

4. Adicionar 900 μl de LB o medio SOC a cada tubo resupendiendo suavemente las células. Incubar 30-60 min, esto permitirá a las células recobrarse del trauma del tratamiento de competencia y empezar la expresión de los genes funcionales recién introducidos.

5. Después de la incubación, resuspender las células de ambos tubos y sembrar por separado 100 μl de cada uno en cajas con LB, conteniendo el antibiótico al que confiera resistencia el plásmido (generalmente 50μg/ml) y suplementadas con 100 µL de 100mM IPTG y 20 µL de 50 mg/mL y esparcir uniformemente sobre el agar con una varilla de vidrio doblada como bastón de hockey esterilizada mediante flameo con alcohol.

6. Pipetear 1.98 ml de medio LB en cuatro tubos estériles y arreglar en dos hileras de tubos.

7. Agitar en vortex el tubo con el cultivo tratado con el plásmido e inmediatamente pipetear 20 μl en el primer tubo de la primera serie y agite vigorosamente. Este tubo contendrá la dilución 1 a 100. Cambiar la punta de la pipeta e inmediatamente pipetear 20 ml de esta dilución 1:100 al segundo tubo y agitar vigorosamente. Se realizaron dos diluciones seriales 1:100. ¿Cuál es la dilución final en el segundo tubo? Ahora repita las diluciones con el tubo del control negativo.

8. Agitar la dilución final y pipetear 100 μl de células diluidas en cajas con LB márquelas como “transformadas”. Untarlas en la superficie de la placa con la varilla de vidrio esterilizada. Repetir el procedimiento para la dilución final del tubo del control negativo y marcar.


9. Incubar las placas a 35-37 ºC toda la noche y revisar si hay crecimiento al otro día. Contar el número de colonias en las cajas con LB-antibiótico.

TEMAS A DEMOSTRAR


RESULTADOS

Cuente el número de colonias en las dos cajas con LB. ¿Debería ser el número de colonias en estas dos cajas similar?

¿Cuántos ml requieren agar y de esos cuántos ampicilina?

Llene la siguiente tabla

Control Transformadas

#

colonias

Factor de dilución

Células suspendidas (cels/ml)

#

colonias

Factor de dilución

Células suspendidas (cels/ml)

Calcular la proporción del control de células transformadas

(#células no transformadas / total de células = ________

Calcule la proporción de células transformadas (#células

transformadas / total de células = ________

Porque se tiene la presencia de colonias blanca y azules?


PRACTICA NO. 17 ANÁLISIS DE COLONIAS RECOMBINANTES POR PCR

OBJETIVO

El alumno será capaz de analizar la presencia de inserto producto de un proceso de clonación.

INTRODUCCIÓN

La tecnología de DNA recombinante requiere de una batería de procedimientos experimentales usados para aislar piezas de DNA que contienen específicos genes.

En este caso el aislamiento de la colonia por el toque a través de un palillo, es de los métodos más sencillos para poder evaluar la presencia de un recombinante presente en ese DNA, no requiere de cultivo previo, la técnica acoplada a PCR utilizando oligonucleótidos específicos contenidos en el vector permite el análisis del inserto correspondiente.

MATERIALES

Colonias en placa

Palillos estériles

Placas LB + antibiótico

Agua estéril

Tubos de PCR

Master Mix 2X (Contiene Taq Polimerasa 2U, Buffer PCR 10X, dNTP´s 10 mM)

Primers 20 mM

PROCEDIMIENTO


1. Tomar parte de la colonia con un palillo estéril

2. Transferir el material a un tubo conteniendo 35 µL de agua estéril en un tubo

3. Realizar una siembra en un sector de la placa utilizando el material restante en el palillo

4. Preparar la reacción utilizando las siguientes condiciones:

Master mix 10.5 µL

Primer FW 1.0 µL

Primer RV 1.0 µL

Agua inoculada con la colonia 12.5 µL

5. Amplificar utilizando las siguientes condiciones de corrida

35 ciclos a 1 min 95 ºC, 2 min a 50 ºC ( o a la tm de los primers -5 ºC), 2 min.

6. Analizar 10 µL de la reacción de PCR en gel de agarosa

TEMAS A DEMOSTRAR

Tecnología del DNA recombinante_Clonación

RESULTADOS

Determine la presencia de insertos

Explique su gel electroforético

Describa porque es importante crecer la colonia en medio de cultivo una vez diluida en agua para el método de PCR.

Que otra técnica puede utilizar para analizar la presencia de un recombinate?

Cual considera ud que son los riesgos de esta metodología?


PRACTICA NO. 18 AISLAMIENTO DE DNA PLASMÍDICO

OBJETIVO

Aislar DNA plasmidico a partir de un cultivo líquido de E. coli transformada.

INTRODUCCIÓN

Los plásmidos son moléculas de DNA extracromosómico circular y generalmente de tamaño pequeño que se localiza en bacterias y que puede ser replicado independientemente. Tiene un interés peculiar dado que son producidos mediante ingeniería genética como producto de una clonación.

El proceso de aislamiento es conocido como Mini Preps, debido a que es preparado de pequeñas proporciones de cultivo de bacterias las cuales contienen el plásmido. La bacterias debe ser lisada con una solución conteniendo dodecil sulfato de sodio e hidróxido de sodio, lo cual desnaturaliza proteínas y DNA cromosomal. La mezcla es neutralizada con acetato de sodio, la mayoría del DNA cromosomal y proteínas son precipitadas y removidas por centrifugación, por lo cual el DNA plasmídico es recuperado en la fase sobrenadante y precipitado con etanol, para su posterior análisis.

MATERIALES

Plásmido

Solución I (Glucosa 50mM, Tris-HCL pH 8.0 25 mM, EDTA 10mM)

Solución II (NaOH 0.2 N, SDS 1%)

Solución III (Acetato de Potasio 5M)

Etanol, Isopropanol


Caldo LB

Ampicilina

PROCEDIMIENTO

1. Inocular 5 mL de caldo LB estéril conteniendo ampicilina 100 ug/mL, con 10 ml de muestra. Incubar en agitación hasta obtener un cultivo en fase estacionaria por lo menos 8 hrs.

2. Centrifugar 1.5 mL de cultivo en un microtubo a 10,000 rpm x 3 min, retirar el sobrenadante y colocar ahí mismo otros 1,5 mL de cultivo, repetir este proceso, hasta haber centrifugado todo el material.

3. Resuspender las células en 250 µL de solución 1, mezclando bien

4. Adicionar 250 µL de Solución 2, esperando 5-10 min hasta que este transparente.

5. Adicionar 250 µL de solución III (fría) y mantener en hielo por 10-15 min.

6. Centrifugar a temperatura ambiente por 10 000 rpm x 10 min

7. Transferir el sobrenadante a un tubo limpio (700 µL)

8. Adicional 500 µL de Isopropanol a temp. Ambiente, agitar, suavemente

9. Centrifugar 30 min a 10,000 rpm

10. Remover el sobrenadante y lavar el pellet con 500 µL de etanol frió al 70%

11. Centrifugar por 5 min y remover el etanol

12. Decantar y dejar secar, colocando el tubo, boca abajo y dejarlo por 5 min a temp. amb.

13. Resuspender en 50 µL de agua estéril.

14. Evaluar el DNA mediante gel, PCR o digestión enzimática.


TEMAS A DEMOSTRAR

Tecnología del DNA recombinante_Caracterización de plasmidos

RESULTADOS

Evaluar la calidad del material nucleíco por espectrofotometría y análisis en gel.


PRACTICA NO. 19 DIGESTIÓN DE DNA PLASMÍDICO CON ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN

OBJETIVOS

Digerir DNA plasmídico con diferentes enzimas de restricción.

INTRODUCCIÓN

Muchos de los cambios que se han llevado a cabo en las ciencias biológicas pueden ser atribuidos a la habilidad para manipular el DNA. La herramienta más importante para la ingeniería genética son las enzimas que catalizan específicas reacciones en el DNA.

Primeramente el corte se da en sitios limitando a obtener un mapa físico de DNA. Segundo, la habilidad para producir específicamente fragmentos de DNA haciendo posible purificar estos fragmentos por clonación molecular.

Existen dos tipos de enzimas de restricción. Las del tipo I son complejos enzimáticos grandes con capacidad de modificar mutilar y colar el DNA. Probablemente sirven para proteger las células de la invasión de DNA extraño. Las endonucleasas de restricción del tipo II reconocen secuencia cortas de DNA y rompen el DNA en sitios específicos dentro o adyacente a secuencias de reconocimiento, las secuencias son generalmente, pero no siempre 4 a 6 nucleótidos en longitud y son usualmente caracterizados por una simetría. El corte puede producir diferentes tipos de extremos en la molécula produciendo extremos parejos o disparejos produciendo extremos cohesivos.


Algunos factores que deben de tomarse en cuenta para una digestión son pureza del DNA, grado de mutilación y condiciones de buffer.

MATERIALES

Buffer de reacción (10X) para las digestiones

Buffer muestra 6X para terminación de reacción y de carga paraelectroforesis6X:0.25% azul de bromofenol, 0.25% xilencianolFF 30%

Glicerol

DNA plasmídico

Agua destilada estéril

Enzimas de restricción

Nota: Para la mayoría de las enzimas de restricción comerciales, una unidad de actividad se define como la cantidad de enzima requerida para digerir completamente 1 µg de pBR322 o de DNA del bacteriófago lambda) en una hora bajo las condiciones apropiadas de reacción y generalmente a 37°C.

La digestión del DNA es afectada por la pureza del DNA y el número de sitios de restricción presentes en el mismo. En ocasiones es necesario extraer la solución de DNA otra vez (y a veces más) con fenol y cloroformo para eliminar las proteínas, seguido por precipitación con etanol para remover los solventes orgánicos, las sales y finalmente precipitar el DNA.

Baño de agua o incubadora a 37°C.

PRECAUCIONES:

Siempre use puntas nuevas y estériles para tomar cada una de las enzimas. Evite la contaminación de las soluciones, del DNA y


de las enzimas usando una punta nueva para la toma de cada componente.

PROCEDIMIENTO

1. Utilizar micropipeta y microtubos de 1.5 mL estériles para

hacer las siguientes digestiones. Todas las soluciones y los

tubos de reacción se mantienen en hielo hasta el momento

de iniciar la digestión. Agregar los componentes de la

reacción en forma ordenada como se indica. Mezclar los

componentes de las reacciones por agitación suave del

microtubo con la punta de los dedos. Incluir un control sin

digerir para cada una de las reacciones, para este paso,

agregar todos los componentes en el mismo orden, excepto

la enzima, mezclar como lo hizo anteriormente y parar la

reacción inmediatamente después con buffer muestra para

electroforesis. Evitar introducir burbujas de aire por agitación

demasiado vigorosa.

Cada reacción deberá de tener los siguientes componentes.

Agua bidestilada estéril ____µL

Buffer 10X ____µL

Enzima de restricción ____µL

DNA a digerir - ____µL

Volume total _50_µL

2. Colocar los tubos a digerir a 37°C e incubar por 1.5 hr.

Mantener los tubos control (sin digerir) a -20°C o en hielo.


3. Transferir una alícuota de 0.5 µg del DNA plasmídico a otro

tubo, agregar buffer de carga para analizar por electroforesis

en geles de agarosa.

4. Guardar los tubos conteniendo el resto de DNA a -20°C.

TEMAS A DEMOSTRAR

Tecnología del DNA recombinante _ Mapas de restricción

RESULTADOS

Defina el mapa de restricción del proceso utilizado.

Describa 5 enzimas que presenten sitios rasurados y 5 con sitios cohesivos.

Mencione 5 factores que interfieran en la digestión enzimática de un DNA y explique porque interfieren.


PRACTICA NO. 20 INTRODUCCIÓN A LA BIOINFORMÁTICA

OBJETIVO

Aplicación del uso de las herramientas bioinformáticas accesibles en el Internet para el estudio de proteínas y los genes que las codifican.

INTRODUCCIÓN

La biología computacional está creciendo rápidamente y el número y variedad de métodos computacionales utilizados para el análisis de secuencias de DNA y proteínas aumenta cada día. El conocimiento de los algoritmos y su aplicación tienen alto valor para las compañías biotecnológicas y para los investigadores.

Por ello, se hace necesario conocer las principales herramientas de la Bioinformática y aprender a utilizarlas en la resolución de problemas biológicos. Nuevas técnicas y demostraciones de su uso, son presentadas para mantener al alumno en el estado del arte de esta disciplina.

MATERIALES

Secuencias: AAS65790, NP_003113, Q39837, BAA99079, NP_035564

PROCEDIMIENTO

1. Conocer la página NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/

2. Explorar y PUBMED, BLAST, Books y all bases.

3. Elija 3 secuencias de las proporcionadas


4. Busque la secuencia que le fue asignada a través de su

número de acceso del banco de datos NCBI.

5. Asigne identidad a la secuencia.

6. Determine mediante esta página http://ca.expasy.org/

i.Peso molecular

ii.Punto isoeléctrico

iii.Contenido de aminoácidos

iv.Mencione en que ORF se localiza

v.Describa que tipo de estructura secundaria presenta

7. Determine el sitio de corte del péptido señal (si es que se

presenta). http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/

8. Explore la liga de Human genome resuorce

9. Conozca las herramientas para el diseño de primers

http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi

10. Conozca las herramientas para poder estudiar filogenia

11. http://evolution.genetics.washington.edu/phylip/software.ht

ml

TEMAS A DEMOSTRAR

Análisis Bioinformáticos

RESULTADOS

Para su reporte explore una liga de las bases analizadas y

arme un ejercicio con forme a lo aprendido en esta sección.

Describa en media cuartilla la importancia que tienen la

bioinformática en relación con el estudios de los genomas.


BIBLIOGRAFÍA • Ausbel F., Brent R., Kingston R.E., Moore D., Seidman J.,

Smith J.A., Struhl, K. 1995. Current Protocols in Molecualr Biology. John Wiley & Sons, Inc.

• Devlin T. 2000. Bioquimica:Libro de texto con aplicaciones clínicas. 3ª Edición. Reverté. Madrid, España.

• Glick B. y Pasternak J. 2003. Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA. American Society for Microbiology. Washington D.C.

• Harlow Ed. 1988. Antibodies a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York.

• Ruvinsky A., Marshall, J. 2005. Mammalian Genomics. CABI Pub, Cambridge, MA, USA.

• Sambrook J. y Rusell D. 2001. Molecular Cloning a Laboratory Manual. 3a Edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

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